霍辰思 樊新萍 劉偉

摘 要： 針對(duì)草莓主要病毒病及其為害特點(diǎn)、草莓脫毒主要技術(shù)及病毒檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述，介紹了近年來(lái)草莓脫毒苗繁育技術(shù)，以期對(duì)草莓生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞： 草莓病毒病;脫毒技術(shù);病毒檢測(cè)

文章編號(hào)：2096-8108（2020）04-0066-06? 中圖分類(lèi)號(hào)：S668.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Research Advance in Detoxification Technique and Virus Detection of Strawberry Virus Disease

HUO Chensi， FAN Xinping， LIU Wei

（Fruit Tree Research Institute of Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， China）

Abstract： The injurious characteristics of strawberry virus disease、main technologies of strawberry detoxification and virus detection techniques were summarized in this research. The breeding technique of virus-free strawberry was introduced，in order to provide theoretical guidance of strawberry production.

Keywords： strawberry virus disease; detoxification technology; virus detection

草莓（Rosaceae，F(xiàn)ragaria）在園藝學(xué)上屬漿果類(lèi)果樹(shù)，多年生薔薇科草本植物[1]。其資源類(lèi)型多樣，適應(yīng)強(qiáng)，栽培面積廣，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。果肉香甜多汁，含有大量微量元素和維生素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，素有“水果皇后”之美稱(chēng)，是一種深受大眾喜愛(ài)的水果。多以無(wú)性繁殖為主，其繁殖方式有匍匐莖繁殖、新莖分株繁殖和離體繁殖。然而，通過(guò)傳統(tǒng)繁殖方法并不能有效脫除病毒。很多農(nóng)業(yè)企業(yè)只注重產(chǎn)量，對(duì)生產(chǎn)中出現(xiàn)的病毒病并沒(méi)有得到有效重視。由于多年連作，種性退化嚴(yán)重，草莓病毒病嚴(yán)重影響產(chǎn)量。其主要表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)緩慢、葉片皺縮見(jiàn)斑駁、果實(shí)畸形品質(zhì)變差[2]。 目前，草莓斑駁病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓鑲脈病毒、草莓皺縮病毒和草莓潛隱環(huán)斑病毒是栽培生產(chǎn)上廣泛侵染草莓的幾種病毒[53]。

草莓同馬鈴薯、甘薯、山藥等無(wú)性繁殖植物一樣，一旦感染病毒就會(huì)傳染給后代。隨著無(wú)性繁殖系數(shù)不斷擴(kuò)大，病毒傳播速度也逐漸加快。草毒植株本身對(duì)病毒并沒(méi)有免疫能力，目前尚沒(méi)有特效方法或外用藥劑可以治愈病毒病，獲得草莓無(wú)病毒苗的有效方法仍是通過(guò)組培脫毒，得到無(wú)病毒原種植株，然后將無(wú)病毒苗進(jìn)行擴(kuò)繁，從而達(dá)到滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求量[4]。目前，在草莓病毒脫除方面，熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法國(guó)內(nèi)外普遍采用的一種方法[5-6]，但這種方法存在操作時(shí)技術(shù)難度大、培養(yǎng)周期耗時(shí)長(zhǎng)、脫毒環(huán)境要求高、脫毒苗成活率低等問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)草莓病毒病的研究現(xiàn)狀、脫毒技術(shù)及病毒檢測(cè)鑒定等方面的研究進(jìn)行綜述，以期對(duì)草莓生產(chǎn)起到指導(dǎo)作用。

1 草莓主要病毒病類(lèi)型

1.1 草莓斑駁病毒（strawberry mottle virus， SMoV）

草莓斑駁病毒又叫草莓輕型皺縮病毒，屬伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、（Sadwavirus）病毒屬[2]。病毒粒子形狀為球形，通常存在于植株葉片的表層、韌皮部以及薄壁細(xì)胞里。1938年，第1次在英格蘭鳳梨草莓上發(fā)現(xiàn)該病毒，存在范疇廣。該病毒屬典型的半持久類(lèi)蚜蟲(chóng)傳染，其傳播途徑以草莓釘毛蚜為主，托馬斯毛管蚜、花毛管蚜、棉蚜等蚜蟲(chóng)皆可傳播。通過(guò)嫁接和機(jī)械接種進(jìn)行傳染;不能通過(guò)草莓種子傳染，植株間相互觸碰也不會(huì)被傳染。感染該病毒草莓的主要癥狀為：葉脈透明水漬化、脈序雜亂，葉片褪綠見(jiàn)斑駁，植株矮化;病癥隨季節(jié)變化其表現(xiàn)略有不同或無(wú)癥狀，但隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)勢(shì)減弱，產(chǎn)量降低。

1.2 草莓鑲脈病毒 （strawberry vein band virus， SVBV）

草莓鑲脈病毒屬花椰菜花葉病毒科（Caulimoviridae）、花椰菜病毒屬（Caulimovirus）[2]。病毒粒子體積較大，呈球型，沒(méi)有包膜。通常于細(xì)胞質(zhì)里進(jìn)行復(fù)制，依附于葉片表面、植株表皮、跟木質(zhì)部連接的維管束以及細(xì)胞質(zhì)。英國(guó)科學(xué)家于1952年從美國(guó)、巴西等地引進(jìn)的草莓品種Fairfax上首次發(fā)現(xiàn)該病毒，隨后在全球范圍廣泛傳播。它屬于半持久性蚜傳病毒，同草莓斑駁病毒類(lèi)似，主要通過(guò)草莓釘毛蚜進(jìn)行傳播;鑒于其在傳播媒介里不能進(jìn)行復(fù)制，所以無(wú)法通過(guò)汁液傳染，也不能通過(guò)種子及花粉傳染。研究發(fā)現(xiàn)：弗吉尼亞草莓、叢林草莓、智利草莓等被該病毒侵染后植株癥狀為葉脈發(fā)黃、葉片邊緣呈不規(guī)則黃色、新葉細(xì)弱畸形等。由于該病毒來(lái)源復(fù)雜，不同地域壞境下SVBV基因組分子存在差異，這也導(dǎo)致危害特點(diǎn)、傳播媒介各不相同。

1.3 草莓皺縮病毒 （strawberry? crinkle? virus，SCV）

草莓皺縮病毒屬?gòu)棤畈《究疲≧habdoviridae），細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬（Cytorhabdovirus）[2]。病毒學(xué)家普遍認(rèn)為草莓潛 A 和潛 B 病毒與SCV 同屬一類(lèi)病毒?，F(xiàn)如今，大范疇存在于國(guó)內(nèi)外，還有著株系分化的情況。病毒粒子形狀呈子彈狀，通常依附在植株表皮、導(dǎo)管跟篩管周?chē)能涹w組織細(xì)胞里。該病毒的傳播媒介通常是草莓釘毛蚜，傳染性持久，可以在昆蟲(chóng)的體內(nèi)完成復(fù)制，還可以通過(guò)接種及嫁接的形式傳播;植株彼此觸碰不會(huì)發(fā)生傳染，種子跟花粉同樣不會(huì)傳播病毒。在生產(chǎn)上主要危害叢林草莓，受其侵染后，花瓣變形缺瓣，植株葉片畸形，葉脈邊緣出現(xiàn)大面積不規(guī)則褪綠斑及壞死斑，葉脈由綠色變?yōu)樗疂n透明狀，幼葉生長(zhǎng)大小不均，皺縮扭曲，小葉黃化，植株矮化、果實(shí)畸形，嚴(yán)重制約草莓產(chǎn)量。

1.4 草莓潛環(huán)斑病毒（strawberry latent ringspot virus， SLRSV）

草莓潛環(huán)斑病毒屬豇豆花葉病毒科（Secoviridae），線蟲(chóng)傳多面體病毒屬（Nepovirus）[2]。通常存在于歐洲、美國(guó)及俄羅斯等國(guó)家，中國(guó)目前尚未發(fā)現(xiàn)該病毒。病毒粒子形狀尚不確定，有文獻(xiàn)報(bào)道其粒子形態(tài)為球型。主要以長(zhǎng)劍線蟲(chóng)為媒介傳播。主要感染種球、苗木以及塊莖。植株受到病毒侵染后，主要表現(xiàn)為葉片畸形、褪綠黃化;植株矮小、果實(shí)品質(zhì)下降，危害嚴(yán)重時(shí)可絕產(chǎn)。

1.5 草莓輕型黃邊病毒（strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）

草莓輕型黃邊病毒屬甲型線性病毒科（Alphaflexiviridae）、暫定為馬鈴薯Χ病毒屬（Potexvirus）[2]。蘇代發(fā)[2]在文獻(xiàn)中闡述，在1992年時(shí)，這種病毒首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)加州，之后澳大利亞、歐洲和日本等地相繼發(fā)現(xiàn)此病毒，現(xiàn)如今在國(guó)內(nèi)外廣泛傳播。病毒粒子呈線性，屬單鏈正義RNA。

該病毒傳播媒介通常是草莓釘毛蚜，不能在其他傳播媒介中繁殖。這種病毒單獨(dú)侵染危害小，通常是跟其他多種病毒共同侵襲植株。受病毒復(fù)合侵染后表現(xiàn)：嫩葉綠色褪除出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，老葉出現(xiàn)壞死條斑，葉片大面積枯死，植株變矮，果實(shí)畸形、果品變差，極大程度影響草莓產(chǎn)量。

2 草莓脫毒技術(shù)

2.1 草莓莖尖培養(yǎng)脫毒

植物莖尖分生組織由不斷分裂的細(xì)胞組成，由于其生長(zhǎng)旺盛、細(xì)胞分裂快，且在1.0 mm范圍內(nèi)受病毒浸染小。因此，生產(chǎn)上廣泛使用的方法仍是草莓莖尖脫毒[13]。Belkengren and Miller最早應(yīng)用組培法獲得了草莓無(wú)病毒苗，法國(guó)學(xué)者M(jìn)orel[14]證明已感染病毒的植株通過(guò)莖尖分生組織培養(yǎng)，可以恢復(fù)成無(wú)病毒植株。莖尖大小直接影響著脫毒效果，由于病毒廣泛存在于無(wú)維管束的分生區(qū)域內(nèi)，需依靠胞間連絲進(jìn)行傳遞，莖尖分生區(qū)域的細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)速度較快，病毒的傳遞速度較莖尖分生細(xì)胞慢，所以生長(zhǎng)點(diǎn)病毒含量最低[15]。然而，組培中剝?nèi)∏o尖大小直接影響其脫毒率，莖尖越小脫毒率越高，而成活率卻有所降低，且剝?nèi)》秶叫〔僮麟y度越大。因此，掌握合適的剝?nèi)》秶鷮?duì)脫毒率和成活率至關(guān)重要。沈磊、童堯明[51]等切取草莓莖尖分生組織0.2～0.4 mm進(jìn)行組培，出苗率為83%～90%，脫毒率高達(dá)100%。高山林[16]把切取的草莓芽沖洗后，通過(guò)高溫、短時(shí)間快速熱處理，用莖尖培養(yǎng)法獲得無(wú)病毒草莓苗。高遐虹[17]在試驗(yàn)中采用二次脫毒方法：即第1次不剝離莖芽的苞葉，直接切割莖尖進(jìn)行組培脫毒，將培養(yǎng)2個(gè)月后的組培苗從瓶中取出，再次切取0.4～0.6 mm的莖尖進(jìn)行第2次脫毒培養(yǎng)，獲得分化率和脫毒率分別為79.2%和84.5%的草莓脫毒苗。何歡樂(lè)[18]等研究表明：取大約0.5 mm莖尖進(jìn)行二次脫毒培養(yǎng)，脫毒率高達(dá)100%，但成活率卻大大降低為26%。綜合前期研究表明，采用莖尖脫毒，莖尖大小通?？刂圃?.2～0.4 mm左右，脫毒率最高。若熱處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)阻礙莖尖正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致存活率下降。綜上所述，傳統(tǒng)莖尖培養(yǎng)及二次脫毒莖尖培養(yǎng)技術(shù)雖是獲得無(wú)毒苗的有效手段，但存在操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)、工作效率低的問(wèn)題。因此，摸索出一套高效、快捷、簡(jiǎn)便的脫毒方法至關(guān)重要。

2.2 熱處理脫病毒

自然界大多數(shù)的病毒粒子都有不耐高溫特性，熱處理脫毒就是利用高溫能使病毒粒子失活，達(dá)到滅活效果[21]。熱處理包括熱水處理和熱氣處理，目前脫毒效果較好的方法是利用恒溫或變溫的熱空氣處理帶病植株，剪取熱處理后長(zhǎng)出的新芽進(jìn)行嫁接或進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到無(wú)病毒的草莓原種植株。肖君澤[19]通過(guò)37～38 ℃恒溫或35～38 ℃變溫處理草莓莖尖，有效降低熱處理后植株死亡率。廖俊杰[20]等將育苗缽培養(yǎng)的草莓苗于38 ℃恒溫箱處理15 d后并沒(méi)有脫除病毒，處理90 d后脫毒率僅為66%。劉健[21]在文獻(xiàn)中表述莖尖在 40 ℃與42 ℃水浴處理的脫毒率均可達(dá)100%，綜合考慮成活率與脫毒率，熱處理溫度以40 ℃為好。

2.3 化學(xué)試劑脫毒

化學(xué)療法脫毒就是利用化學(xué)試劑在植物體內(nèi)可以延遲或是抑制病毒復(fù)制，從而使植物擺脫病毒的一種外界干預(yù)法。該方法對(duì)莖尖大小要求不高，無(wú)需特定范圍的莖尖也能得到較好的脫毒效果。對(duì)于化學(xué)藥劑處理脫毒的機(jī)制尚未有很深入的研究，目前植物脫毒的化學(xué)試劑主要有三氮唑核苷（病毒唑）、5-二氫尿嘧啶（DHT）、放線菌素、堿性孔雀綠及環(huán)乙酰胺等，其中病毒唑是應(yīng)用最廣的化學(xué)試劑。1953-1954年，D.Norris最早將孔雀綠用于馬鈴薯無(wú)病毒苗培育，脫掉了馬鈴薯X病毒，獲得了馬鈴薯無(wú)病毒苗。廖俊杰[20]等采用培養(yǎng)基化學(xué)療法和田間化學(xué)療法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，在培養(yǎng)基中加入化學(xué)試劑后切取適當(dāng)莖尖進(jìn)行組培，獲得比對(duì)照（田間化學(xué)療法）高70%的脫病毒率。秦梅[22]在甘薯脫毒培養(yǎng)基中加入10 mg/L的三氮唑核苷后，脫毒率可達(dá)到76%。Cassells[23]等將病毒唑加入培養(yǎng)基中，通過(guò)組培可脫除馬鈴薯多種病毒。通過(guò)化學(xué)療法雖然能得到脫病毒植株，但是會(huì)有輕度藥害現(xiàn)象發(fā)生。有研究表明其毒性會(huì)遺留在新生植株內(nèi)，隨后進(jìn)入人體，與現(xiàn)在提倡的綠色環(huán)保無(wú)公害作物相駁。出于安全實(shí)效性考慮，很難在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

2.4 熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒

利用傳統(tǒng)的熱處理脫毒，由于莖尖在高溫、高濕環(huán)境下處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，植株易枯死、容易受紅蜘蛛、蚜蟲(chóng)等昆蟲(chóng)危害。且不同病毒對(duì)高溫的耐受性不同，單純依靠熱處理并不能有效脫除病毒。而熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合比常規(guī)脫毒效果更好，目前該技術(shù)在生產(chǎn)上普遍使用。王際軒[24]將生長(zhǎng)旺盛的草莓盆栽苗于38～40 ℃溫度下熱處理42 d，選取熱處理后大小合適的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，脫毒率能達(dá)到70%左右。何歡樂(lè)[46]在草莓莖尖培養(yǎng)脫毒效果研究中采用改良熱處理莖尖培養(yǎng)法，先將草莓匍匐莖于40 ℃水浴處理4 h后，剝?nèi)?0.5～0.6 mm左右的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，獲得47.37%莖尖成活率。劉健[21]在試驗(yàn)中設(shè)計(jì)40 ℃和42 ℃兩個(gè)溫度梯度，處理后的莖尖脫毒率均可達(dá)到100%，但鑒于時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)莖尖有影響力，一般采用40 ℃處理4h為宜。李志強(qiáng)[25]等以草莓品種“紅顏”、“章姬”為試材，篩選出莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L，并建立其組培快繁 體系。顧地周[26]采用均勻設(shè)計(jì)法，將已感染了斑駁病毒和皺縮病毒的草莓試管苗在試管內(nèi)誘導(dǎo)匍匐莖，再將帶有匍匐莖的試管苗直接進(jìn)行56 ℃高溫處理后，切取1 mm的莖尖在LS+6-BA 1.00 mg/L+GA3 1.90 mg/L+KT 1.00 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)病毒檢測(cè)和栽培觀察可知，脫毒率高達(dá)100%。

2.5 超低溫脫毒

超低溫脫毒是一種新型高效脫毒技術(shù)，較傳統(tǒng)脫毒法而言，其脫毒效率更高，且對(duì)莖尖大小無(wú)要求。超低溫冷凍療法是兼植物種質(zhì)資源保護(hù)與脫毒雙重作用的一種脫毒方法，其作用原理是[27]：利用莖尖分生組織細(xì)胞與分化細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的差異進(jìn)行脫毒。由于莖尖分生組織細(xì)胞體積較小、液泡小和較大核質(zhì)體積比等特點(diǎn)，脫水更容易，在液氮環(huán)境中不易被凍死;而莖尖分化細(xì)胞體積較大，含有較大的液泡和較小的核質(zhì)比，脫水處理較難，在超低溫環(huán)境下易被凍死。此外，莖尖分生組織病毒含量少，而分化組織往往是病毒富集區(qū)。因此，當(dāng)液氮處理分生組織后，受傷死亡的細(xì)胞大部分都是分化細(xì)胞，而保留下來(lái)的不含病毒分生組織，可通過(guò)組織培養(yǎng)獲得無(wú)病毒植株[27]。Brison等（1997）首次運(yùn)用超低溫脫毒法脫除李痘包病毒（Plum pox virus，PPV），獲得李無(wú)病毒植株。此后，超低溫冷凍療法開(kāi)始普遍應(yīng)用于植物脫毒。目前，超低溫脫毒技術(shù)已經(jīng)在百合[28]、甘薯[29]、馬鈴薯[30]、黃瓜[31]、葡萄[29]、柑橘[32-33]、香蕉[31]、櫻桃[34]、獼猴桃[35]等植物脫除病毒上廣泛應(yīng)用，對(duì)于草莓研究報(bào)到較少。羅婭[37]優(yōu)化超低溫脫除體系，草莓的莖尖存活率為69%，多種草莓病毒被脫除，脫除率高達(dá)100%。盛宏亞[38]以攜帶草莓斑駁病毒（SMoV）“紅顏”為供試材料，建立預(yù)防“紅顏”草莓的莖尖玻璃化超低溫脫毒體系。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)草莓斑駁病毒的脫毒效果，脫毒率為100%。陳曦[39]以“福莓1號(hào)”為試材，利用莖尖超低溫冷凍脫毒技術(shù)將外植體低溫鍛煉2周后，莖尖在預(yù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng) 3 d，1/2濃度 PVS2溶液及全濃度PVS2溶液冰上冷處理2次，液氮冷凍 1 h后，在39 ℃的水浴中快速化凍2? min，卸載后莖尖先暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入正常光照培養(yǎng)，再生培養(yǎng)成活率約30%，病毒脫除率為100%。

3 草莓無(wú)病毒苗鑒定與繁殖

3.1 草莓病毒病檢測(cè)方法

采用上述脫毒技術(shù)獲得的草莓苗并不一定能夠完全脫毒，因此需要對(duì)脫毒后的草莓苗進(jìn)行病毒檢測(cè)。無(wú)病毒苗的鑒定主要有生物學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測(cè)法、電鏡檢測(cè)法等[47]。目前，分子PCR 技術(shù)也被廣泛應(yīng)用到草莓病毒檢測(cè)中[40]。生物學(xué)鑒定法又稱(chēng)指示植物檢測(cè)法，是最早應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)的方法，目前仍被廣泛應(yīng)用[47]。該檢測(cè)方法可以直接觀察到檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需特定儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單易掌握。不過(guò)檢測(cè)時(shí)間耗時(shí)長(zhǎng)，受外界環(huán)境因素影響大，容易出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性，降低其檢測(cè)的靈敏度[48]。血清學(xué)病毒檢測(cè)法應(yīng)用較早，該方法利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，來(lái)鑒定植物是否攜帶病毒[49]。常見(jiàn)的血清學(xué)檢測(cè)方法有沉淀反應(yīng)、凝聚反應(yīng)（VBA）、酶聯(lián)免疫的吸附法（ELISA）、免疫熒光技術(shù)（IFA）、斑點(diǎn)免疫測(cè)定法（DIBA）以及免疫膠體金技術(shù)（GICT）[49]等，這些方法具有較高的檢測(cè)靈敏性，能夠快速的檢測(cè)到草莓病毒，操作也相對(duì)簡(jiǎn)易方便。但由于其檢測(cè)時(shí)常依賴(lài)血清的品質(zhì)，可被鑒定的病毒種類(lèi)受到限制。目前僅有少部分果樹(shù)病毒的抗血清可被利用，草莓病毒檢測(cè)中，只有草莓輕型黃斑病毒和草莓皺縮病毒抗血清制備成功[50]。電子顯微鏡技術(shù)在生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)等多個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，不僅能夠直觀、準(zhǔn)確的觀察到植物表面特征，還可以對(duì)病毒機(jī)理進(jìn)行深入的內(nèi)在挖掘。由于設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作技術(shù)要求高，并沒(méi)有廣泛應(yīng)用到植物檢測(cè)實(shí)際工作中。但電子顯微技術(shù)作為輔助檢測(cè)技術(shù)，在分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著不可磨滅的作用[41]。分子生物學(xué)檢測(cè)法以核酸分子雜交為基礎(chǔ)，成為當(dāng)前病毒檢測(cè)最主要方法。因其檢測(cè)時(shí)靈敏度高、特異性強(qiáng)，不受季節(jié)、外界環(huán)境影響，采樣后可隨時(shí)進(jìn)行大批量檢測(cè)，發(fā)揮著血清學(xué)檢測(cè)法及傳統(tǒng)病毒檢測(cè)法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。目前，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)法、以RNA分子轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的NASBA檢測(cè)法、核酸雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)等是分子生物學(xué)檢測(cè)的常用手段[3]。

3.2 草莓脫毒苗繁育技術(shù)

草莓脫毒苗較傳統(tǒng)繁殖方式有較大優(yōu)勢(shì)，其在植物學(xué)性狀、果實(shí)品質(zhì)、豐產(chǎn)性等各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于普通繁殖苗。大量研究表明，栽培無(wú)病毒的草莓苗，能夠提高草莓的質(zhì)量。草莓果實(shí)著色正常，果形整齊，畸形果率降低[19]。這些都為草莓優(yōu)質(zhì)、商品化生產(chǎn)提供有力保障。在現(xiàn)代化草莓種苗擴(kuò)繁基地，脫毒苗的組織培養(yǎng)為種苗生產(chǎn)發(fā)揮關(guān)鍵性作用[52]。在脫毒快繁過(guò)程中不僅要提高組培苗的增殖率和成活率，還要求對(duì)培養(yǎng)基濃度、培養(yǎng)容器種類(lèi)及凝固劑種類(lèi)等進(jìn)行優(yōu)化篩選，在保證種苗生產(chǎn)質(zhì)量的基礎(chǔ)上達(dá)到降低生產(chǎn)成本，找到節(jié)能、環(huán)保、高效的繁育技術(shù)。張恒[42]等用蛭石 + IBA 溶液作為草莓大苗沙盤(pán)生根培養(yǎng)基，利用保鮮膜對(duì)沙盤(pán)進(jìn)行保濕，可保障草莓繼代培養(yǎng)的大苗在沙盤(pán)里生根。將該技術(shù)應(yīng)用于草莓脫毒苗的擴(kuò)繁，可節(jié)約大量成本。謝文申[43]以脫毒野薄荷試管苗為外植體，用30 g/L食用白糖代替蔗糖、用涼開(kāi)水代替蒸餾水配置淺層液體培養(yǎng)基，比普通固體培養(yǎng)基節(jié)約成本 57.44%。張春芬[44]為降低草莓脫毒組培苗的生產(chǎn)成本，用白砂糖替換蔗糖、卡拉膠替換瓊脂粉，總成本降為原來(lái)的 32.5%。采用帶塑料瓶蓋的玻璃瓶，可大大節(jié)省勞動(dòng)力，提高生產(chǎn)效率。另外，隨著生物技術(shù)發(fā)展，脫毒草莓苗的培育更傾向于集生物工程、病毒學(xué)檢測(cè)和快繁農(nóng)藝技術(shù)為一體的栽培模式，應(yīng)將這一高新技術(shù)系統(tǒng)化、高效化、實(shí)用化的應(yīng)用到草莓生產(chǎn)中。

4 展望

近年來(lái)，隨著綠色生態(tài)種植農(nóng)業(yè)的蓬勃發(fā)展，草莓種植面積逐年增加。由于其生長(zhǎng)周期短、采摘方便，草莓生態(tài)園自助采摘模式已成為深受市場(chǎng)青睞的一項(xiàng)新型產(chǎn)業(yè)。脫毒草莓苗在生產(chǎn)上的應(yīng)用，極大提高了種植者積極性。而草莓病毒病嚴(yán)重制約草莓高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)進(jìn)程，重茬種植造成草莓品種單一、種性退化。為了滿(mǎn)足市場(chǎng)上草莓周年供應(yīng)，建立完善的種苗繁育體系、標(biāo)準(zhǔn)化草莓病毒檢測(cè)中心[40]，從源頭上管控草莓病毒，引進(jìn)脫毒成功的草莓品種尤為重要。由于草莓病毒病多為復(fù)合型病毒感染，單一應(yīng)用傳統(tǒng)的脫毒方法并不能達(dá)到良好的脫毒效果，生產(chǎn)上應(yīng)該采取多種脫毒方法混合使用。隨著基因工程的發(fā)展，生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用為草莓脫毒及無(wú)病毒苗鑒定開(kāi)辟了新的途徑。目前，草莓脫毒苗繁育體系雖然有了一定的發(fā)展，但是組培快繁技術(shù)成本高、操作環(huán)節(jié)嚴(yán)謹(jǐn)難度大、資源浪費(fèi)嚴(yán)重，需進(jìn)一步探索符合生產(chǎn)實(shí)際、節(jié)能環(huán)保高效的繁育體系，促進(jìn)草莓業(yè)健康發(fā)展。

[32] 王子成，鄧秀新.玻璃化法超低溫保存柑橘莖尖及植株再生[J].園藝學(xué)報(bào)，2001，28（4）301-306.

[33] 丁 芳.柑橘黃龍病菌及與其混合發(fā)病的分子特性及超低溫研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[34] Niino T， Tashiro K， Suzuki M， et al. Cryopreservation of in vitro on? 11 shoot tips of cherry and sweet cherry by one-step vitrification[J]. Scientia Hortieulturae. 1997（70）：155-163.

[35] 徐小彪，辜青青.玻璃化法超低溫保存稱(chēng)猴桃離體莖尖及其植株再生[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33（4）：842-844.

[36] 蔡斌華，張計(jì)育，渠慎春，等.通過(guò)玻璃化超低溫處理脫除草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2008，25（6）：872-876.

[37] 羅 婭，邱 靜，凌亞杰，等.超低溫療法在草莓病毒脫除中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2016，14（9）：2488-2494.

[38] 盛宏亞，萬(wàn)繼花，徐 川，等.利用玻璃化超低溫技術(shù)脫除草莓斑駁病毒（SWo V）的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，21（3）：53-57.

[39] 陳 曦，黃銘奇，陳 銑，等.‘福莓1號(hào)草莓莖尖超低溫脫毒技術(shù)[J]東南園藝，2018（6）：31-34.

[40] 胡淑明，張學(xué)英，李青云，等.草莓脫毒技術(shù)研究進(jìn)展[J]河北果樹(shù)，2007（4）：1-2.

[41] 遲惠榮，毛碧增.植物病毒檢測(cè)及脫毒方法的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2017，33（8）：26-33.

[42] 張 恒.草莓脫毒苗組培快繁工藝的簡(jiǎn)化及降低成本研究[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，17（1）：68-71.

[43] 謝文申，周恒蒼，付晏昆，等.野薄荷脫毒苗低成本組培快繁研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（9）：174-176.

[44] 張春芬，鄧 舒，聶園軍，等.草莓脫毒組培苗低成本快繁技術(shù)研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：379-382.

[45] 張吉紅，余澍瓊，徐 瑛，等.逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)草莓潛隱環(huán)斑病毒的研究[J].植物保護(hù)，2013，39（6）：74-77.

[46] 陳繼峰，趙軍營(yíng)，李邵華，等.果樹(shù)病毒檢測(cè)方法及其應(yīng)用[J].河北林果研究，2005，20（2）：167-172.

[47] 徐重新.人源化抗蘇云金芽孢桿菌Bt（Cry1B）毒素蛋白單鏈抗體的篩選、表達(dá)及生物學(xué)活性測(cè)定（D）.南京：南京師范大學(xué)，2013.

[48] 張京宣，曹秀芬，宋 濤，等.植物病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展分析[J].花卉中草藥，2011（10）：79-80.

[49] 楊洪一，李麗麗，張志宏，等.果樹(shù)病毒核酸檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)科學(xué)，2007，23（2）：350-354.

[50] 沈磊，童堯明.草毒莖尖分生組織一步成苗試驗(yàn)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，19（1）：36-38.

[51] 趙佐敏，艾 勇.草莓脫毒技術(shù)的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29（6）：50-52.

[52] 聶園軍，李瑞珍，張春芬，等.草莓莖尖脫毒技術(shù)研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019（3）：29-32.