苗竹林, 鐘興明, 崔蓉, 趙文忠, 王永霞, 鐘文瑤, 張碧云

廣東省計(jì)劃生育專科醫(yī)院/廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所、國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣東廣州 510600)

近年來，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)發(fā)生率逐年增加，給患者造成巨大的痛苦，也引起國內(nèi)外醫(yī)務(wù)工作者的高度重視。RSA病因復(fù)雜，免疫學(xué)因素是近年來普遍關(guān)注的一個(gè)問題。夫婦雙方組織相容性及抗丈夫淋巴細(xì)胞抗體(antipatemal lymphocyte antibody，APLA)產(chǎn)生被認(rèn)為是誘導(dǎo)母胎免疫耐受的基礎(chǔ)理論之一[1]，但是母胎免疫耐受的機(jī)制至今未明[2]。長期以來，APLA檢測成為臨床評(píng)估同種免疫型自然流產(chǎn)的主要方式之一[3]。APLA是否可以成為判斷流產(chǎn)的生物學(xué)指標(biāo)？臨床上采用何種方法檢測APLA？基于APLA陰性或不足所做的相關(guān)治療是否有效，目前爭議很大，值得進(jìn)一步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧分析 2009年2月至2018年8月期間，在廣東省計(jì)劃生育專科醫(yī)院生殖免疫遺傳中心門診就診的RSA患者，選擇資料完整320例進(jìn)行研究(RSA組)。對(duì)照組為同時(shí)期因?yàn)槟行栽蛐腥斯な诰蚵寻麧{內(nèi)精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)第二代試管嬰兒等輔助生殖技術(shù)的女性不孕患者，身體健康，月經(jīng)規(guī)律，無流產(chǎn)病史，同意行APLA檢測。

1.2 APLA檢測方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA)檢測方法，抗原檢測板由美國One Lambda公司提供，包被有HLA-Ⅰ類、HLA-Ⅱ類抗體，嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 具體步驟如下 (1)取 100 μL 蒸餾水溶解對(duì)照血清，徹底溶解后加抗體稀釋液 900 μL 配成1∶10 的稀釋液。(2)取 15 μL抗體稀釋液稀釋待測 15 μL血清混勻。(3) 加入10 μL稀釋的陽性對(duì)照血清及受檢血清(做復(fù)孔)于包被了HLA 抗原的微孔板中。(4)37℃孵育45 min，之后用緩沖液洗滌2次。(5)按 1∶100 的比例取 5 μL酶聯(lián)抗體加抗體稀釋液 495 μL 混勻，每孔中加入10 μL。(6)37℃孵育30 min，緩沖液洗滌3次，甩干血清。(7)分別取顯色劑A 和 B 各 250 μL 混勻，每孔加入10 μL,37℃避光孵育10 min，記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分率) 表示，采用2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APLA檢測方法比較 320例患者中，采用補(bǔ)體依賴微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(CDC)檢測APLA的59例，占18.433%；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(FCXM)23例，占7.19%；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢(ELISA)226例，占70.6%，是最常用的檢測方法；采用(PCR)夫婦 HLA 相容性判斷APLA的10例，占3.13%；其他2例，占0.63%，見表1。

表1 RSA患者APLA檢測方法比較

2.2 ELISA方法檢測結(jié)果比較 對(duì)采用ELISA法進(jìn)行檢測的RSA組和對(duì)照組進(jìn)行比較，兩組一般情況，包括年齡和體質(zhì)指數(shù)(BMI) 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RSA組與對(duì)照組APLA陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、3及圖1。

圖1 APLA抗體ELISA方法檢測圖

表2 兩組一般情況比較

表3 ELISA方法檢測兩組APLA陽性率比較

2.3 淋巴細(xì)胞免疫治療及妊娠結(jié)局變化 分析226例ELISA方法檢測APLA陰性RSA患者，220例進(jìn)行淋巴細(xì)胞免疫治療后，復(fù)查212例轉(zhuǎn)為陽性，轉(zhuǎn)陽率為96.4%(212/220)。其中186例患者再次妊娠，經(jīng)過積極保胎治療后，APLA陽性后再次發(fā)生流產(chǎn)18例，流產(chǎn)率為9.70%(18/186)。

3 討論

3.1 母胎免疫耐受機(jī)制及RSA患者APLA學(xué)說 母胎免疫問題一直是生殖免疫領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)性的一個(gè)問題，是目前生殖免疫，基礎(chǔ)免疫和器官移植等多個(gè)學(xué)科的研究焦點(diǎn)[4]。從移植免疫學(xué)角度來講，體液免疫在移植排斥反應(yīng)中起一定作用，在某些情況下起次要作用，所產(chǎn)生抗體反而能保護(hù)移植物，防止或延緩排斥反應(yīng)的發(fā)生，這種抗體稱為增強(qiáng)抗體(enhancing antibodies)，增強(qiáng)抗體與移植物上的抗原結(jié)合，不激活補(bǔ)體，也不引起細(xì)胞毒效應(yīng)，卻可阻斷其他抗體或效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)移植抗原的識(shí)別和對(duì)移植物的攻擊，因而又稱為封閉抗體(blocking antibodies)[5]。

關(guān)于母胎免疫耐受的封閉抗體學(xué)說，從20世紀(jì)70年代起，這一概念一直沿用至今。學(xué)者們普遍認(rèn)為，在正常妊娠中，胎兒及其附屬物不被母體排斥是因?yàn)榕咛ニ鶐У母冈葱钥乖?在于滋養(yǎng)細(xì)胞表面)能刺激母體免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生一類IgG型抗體，稱之為抗丈夫淋巴細(xì)胞因子或APLA。APLA既可與母體淋巴細(xì)胞表面抗原結(jié)合，又可與滋養(yǎng)細(xì)胞本身結(jié)合，從而阻斷母兒之間的免疫識(shí)別和免疫反應(yīng)，是一種胚胎保護(hù)性抗體，自然流產(chǎn)與APLA不足有關(guān)[6]。

也有學(xué)者提出，APLA不是一種而是一類抗體，主要有抗溫B細(xì)胞抗體、抗冷B細(xì)胞抗體、抗特異性抗體、抗TLX抗體、抗Fc受體的抗體以及抗父體的補(bǔ)體依賴性抗體(APCA)。這些基礎(chǔ)研究的內(nèi)容很難為臨床醫(yī)生所了解并掌握，因?yàn)槿〔募皺z測困難，很難用于臨床[7]。

3.2 目前臨床常用APLA檢測的方法

3.2.1 補(bǔ)體依賴微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(complement-dependent cytotoxicity，CDC) 抽取患者靜脈血并分離血清備用；抽取供者肝素抗凝靜脈血并分離出PBMC，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/mL。按操作說明先后分別加入供者PBMC、受者血清、兔補(bǔ)體到微孔板對(duì)應(yīng)的各孔中(設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照)，置于37℃孵育，然后加入熒光染料染色，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況并計(jì)數(shù)[8]。該方法因操作繁瑣，目前在臨床上已很少應(yīng)用，本研究收集到的病例多數(shù)為2009年前檢測的手段。

3.2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(FCXM) 近年來隨著流式細(xì)胞技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，在臨床上出現(xiàn)了采用流式細(xì)胞術(shù)檢測APLA的方法。該方法主要用來檢測母體中抗父體白細(xì)胞抗體。首先分離父體中的淋巴細(xì)胞，與熱滅活的母體血清孵育，離心、洗滌后加入CD3熒光抗體孵育，離心洗滌后在流式細(xì)胞儀上分析，判斷夫婦雙方的抗丈夫淋巴細(xì)胞率[9]。該方法采用外周血檢測，淋巴細(xì)胞比例變化影響因素大，操作復(fù)雜，理論依據(jù)不足，臨床診斷及應(yīng)用價(jià)值有限。

3.2.3 ELISA 試劑盒為人類組織相容性與白細(xì)胞抗體檢測試劑盒，該方法因操作方便目前為多數(shù)臨床所采納，主要是用一組包含大部分HLA抗原的細(xì)胞板或抗原板，檢測是否有對(duì)應(yīng)的抗體存在。主要是針對(duì)移植免疫中的交叉配型和群體反應(yīng)性抗體PRA進(jìn)行檢測。目前，成為多家醫(yī)院婦產(chǎn)科檢測APLA判斷流產(chǎn)原因的一種方法[10]。本研究結(jié)果顯示，正常女性APLA陰性率約為95.65%，未經(jīng)淋巴細(xì)胞免疫治療的流產(chǎn)患者陰性率約為96.02%，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.4 抗封閉抗體獨(dú)特性抗體 獨(dú)特性抗體是針對(duì)抗體分子V區(qū)上的特異抗原表位群(稱為獨(dú)特型)的抗抗體(anti-idiotypeantibody, AId)，抗獨(dú)特型抗體可作為替代抗原用于免疫分析。AId與原來抗原的決定簇分子互為“內(nèi)影像”關(guān)系，可模擬抗原結(jié)構(gòu)和功能的作用，因AId是始動(dòng)抗原的內(nèi)影像，可刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)始動(dòng)抗原的免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生保護(hù)作用，目前主要作為新型疫苗來研究[11]。而婦產(chǎn)科方面，AId是推測母體針對(duì)APLA產(chǎn)生的一種可以破壞胚胎細(xì)胞的特異性抗體[12]，而APLA目前尚不明確，因此針對(duì)APLA的AId，仍然診斷價(jià)值不確切。

本研究結(jié)果分析提示APLA陰性無法判斷是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要原因，淋巴細(xì)胞免疫治療是APLA轉(zhuǎn)為陽性的一種方法，但是轉(zhuǎn)為陽性后仍然有9.70%的患者再次出現(xiàn)流產(chǎn)，臨床應(yīng)用APLA的檢測來判斷流產(chǎn)原因證據(jù)不足的。

總之，母胎免疫耐受的原理至今未明，APLA限于一種假說，但是沒有確切的診斷方法來判斷什么是APLA，是否存在APLA，流產(chǎn)的同種免疫學(xué)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。