郭元元，張 力，蔣月喜，陳振東，黃如葵，宋煥忠，車江旅，吳永升，陳 琴，零 活，張?jiān)剖|

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 南寧 530007； 2.廣西壯族自治區(qū)蔬菜育種與新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南寧 530007； 3.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 南寧 530007）

細(xì)香蔥（Allium schoenoprasum）又名香蔥、小蔥，是百合科（Liliaceae）蔥屬多年生簇生草本植物，以嫩葉和假莖供食，味辛香、性溫，具有殺菌、解熱、通便、助消化、預(yù)防感冒等功效，是一種鮮食加工兼用的調(diào)味香料蔬菜[1-2]。廣西壯族自治區(qū)地處熱帶亞熱帶，熱量豐富、雨水豐沛，適宜香蔥生長(zhǎng)。廣西細(xì)香蔥規(guī)?；N植歷史悠久。目前年均區(qū)內(nèi)種植面積約2 萬(wàn)hm2（集中于南寧市、柳江市、百色市、桂林市、玉林市等地），產(chǎn)值超過(guò)100 億元，產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)優(yōu)勢(shì)突出，在廣西蔬菜周年生產(chǎn)供應(yīng)中占一席之地，也成為廣西“南菜北運(yùn)”和“西菜東運(yùn)”的特色蔬菜種類之一[3-4]。以地方種質(zhì)資源為基礎(chǔ)而形成的‘柳江細(xì)蔥’‘鐘山撒子蔥’‘桂林矮婆娘’‘玉林紅蔥’‘靈川靈香1 號(hào)’‘靈川靈香2 號(hào)’等[5-6]品種的品質(zhì)優(yōu)異、葉綠油韌、蔥白緊實(shí)，氣味濃郁，深受群眾歡迎，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民增收做出了重大貢獻(xiàn)。生產(chǎn)上細(xì)香蔥多為無(wú)性繁殖，長(zhǎng)期栽培過(guò)程中種質(zhì)不斷退化。在眾多育種方法中，雜交育種是最基本最常用也是最有成效的方法，對(duì)蔥屬作物原始材料創(chuàng)新的作用巨大[7-8]?；ǚ凼侵参锏男叟渥芋w，在植物的有性繁育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。父本具有良好的花粉活力是成功進(jìn)行雜交育種的重要條件[9]。在授粉之前檢驗(yàn)花粉的生活力，以確定花粉發(fā)芽的可靠程度，這對(duì)繁殖效率提高及有效實(shí)施雜交育種具有重要意義。為了合理利用細(xì)香蔥種質(zhì)資源，挖掘與創(chuàng)新香蔥品種，開(kāi)展細(xì)香蔥育種研究勢(shì)在必行。在蔥屬花粉活力測(cè)定方面，曾有采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法、聯(lián)苯胺染色法、四甲基偶氮唑（MTT）法、碘－碘化鉀法、花粉離體萌發(fā)法等對(duì)蔥屬韭蔥、高葶韭、韭菜及百合等其他作物的花粉活力進(jìn)行測(cè)定報(bào)道[10-13]，而細(xì)香蔥花粉萌發(fā)方面鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者以細(xì)香蔥花粉為材料，采用蔥屬其他作物中花粉活力測(cè)定最常用的TTC 染色法、聯(lián)苯胺染色法、花粉離體萌發(fā)法進(jìn)行不同花粉活力測(cè)定方法比較，以期篩選出適宜的簡(jiǎn)單快速測(cè)定方法，并采用該方法對(duì)不同細(xì)香蔥種質(zhì)資源的花粉活力進(jìn)行測(cè)定，為香蔥種質(zhì)的有效利用和育種工作提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年3 月在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所中試基地香蔥資源圃及廣西蔬菜育種與新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。

選取從各地收集的香蔥地方種質(zhì)資源為試驗(yàn)對(duì)象（表1），于設(shè)施大棚中栽培，畦寬1.5 m 包溝，溝寬30 cm，高25～30 cm。田間小區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每份種質(zhì)3 次重復(fù)，每重復(fù)小區(qū)面積12 m2。所有細(xì)香蔥種質(zhì)同時(shí)移栽定植，株行距20 cm×15 cm，每穴5 個(gè)分蘗，期間統(tǒng)一正常水肥管理，定期觀察記錄田間數(shù)據(jù)并整理。開(kāi)花期間，于晴天10：00 采集細(xì)香蔥花序，將花序放在培養(yǎng)皿內(nèi)收集新鮮花粉，測(cè)定花粉活力。

1.2 方法

1.2.1 不同檢測(cè)方法對(duì)花粉活力測(cè)定的比較 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法[9]：隨機(jī)選取AF13、AF14、AF93 少量花粉放在載玻片上，加1～2 滴TTC 溶液，蓋上蓋玻片后將制完的片子放入培養(yǎng)皿內(nèi)，置于35 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，20 min后進(jìn)行鏡檢觀察花粉染色情況。染成紅色的花粉活力較強(qiáng)，無(wú)色為不具有活力的花粉。

表1 香蔥地方種質(zhì)資源及來(lái)源

聯(lián)苯胺染色法[14]：隨機(jī)選取AF13、AF14、AF93少量花粉放在載玻片上，花粉上滴1 滴混合液（0.20%聯(lián)苯胺溶于50%酒精溶液、0.15%α-萘酚溶于50%酒精溶液、0.25%碳酸鈉溶液為1∶1∶1 混合）和1 滴0.3%過(guò)氧化氫溶液，充分混合，經(jīng)過(guò)3～4 min后，在顯微鏡下檢查被染色和未染色的花粉粒數(shù)。生活力愈強(qiáng)的花粉染色紅色愈深，不具生活力的花粉則呈黃色和無(wú)色。

花粉離體萌發(fā)法[12]：配置培養(yǎng)基（含10%蔗糖、0.1%硼酸、0.1 g·L-1瓊脂），用玻棒將冷卻前（約50 ℃）的培養(yǎng)基滴入凹玻片的凹孔中（1～2 滴），隨機(jī)選取AF13、AF14、AF93 少量花粉，將花粉置于培養(yǎng)液中，在25 ℃條件下光照培養(yǎng)4 h，顯微鏡下檢測(cè)花粉萌發(fā)情況。

1.2.2 不同香蔥種質(zhì)資源花粉活力的比較 采用篩選出的快速檢測(cè)方法，對(duì)29 份細(xì)香蔥種質(zhì)資源進(jìn)行花粉活力鑒定。

1.2.3 鏡檢結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法 以上每份種質(zhì)（處理）設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察5 個(gè)視野，每個(gè)視野不少于100 ?；ǚ郏y(tǒng)計(jì)花粉活力。花粉活力/%=花粉染色或萌發(fā)總數(shù)/觀察花粉總數(shù)×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2009 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，采用SPSS 19.0 以及GraphPad Prism 6 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢測(cè)方法對(duì)花粉活力測(cè)定的比較

采用TTC 染色法、聯(lián)苯胺染色法和花粉離體萌發(fā)法對(duì)3 個(gè)品種的細(xì)香蔥花粉活力進(jìn)行測(cè)定（圖1），結(jié)果顯示同一種質(zhì)花粉的活力（萌發(fā)率）或是平均花粉活力（萌發(fā)率）從高到低依次為聯(lián)苯胺染色法＞TTC 染色法＞花粉離體萌發(fā)法（表2）。采用TTC 染色法和離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力的結(jié)果不穩(wěn)定。采用離體萌發(fā)法耗時(shí)較長(zhǎng)，且萌發(fā)結(jié)果不明顯。采用聯(lián)苯胺染色法操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)較少，反應(yīng)3～4 min 后即可觀察，顯色較好，大部分花粉活力顯示均達(dá)到60%以上（圖1）。

表2 不同檢測(cè)方法對(duì)3 個(gè)香蔥種質(zhì)的花粉活力測(cè)定結(jié)果

圖1 不同檢測(cè)方法對(duì)花粉活力測(cè)定的比較

2.2 不同細(xì)香蔥種質(zhì)的花粉活力比較情況

采用聯(lián)苯胺染色法測(cè)定基地中29 個(gè)細(xì)香蔥種質(zhì)的花粉活力（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，29 個(gè)細(xì)香蔥種質(zhì)中AF14‘四季香蔥’測(cè)定的花粉活力最高，為80.20%；其次為AF93‘扶照蔥’78.35%，再次為‘老口蔥’76.41%。測(cè)定花粉活力最低的為AF57‘香蔥’16.62%。

3 討 論

3.1 花粉活力測(cè)定方法的比較

雖然前人研究大多認(rèn)為離體萌發(fā)法測(cè)定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、結(jié)果真實(shí)，但是由于花粉萌發(fā)過(guò)程中的培養(yǎng)條件（蔗糖、硼酸及溫度）對(duì)花粉萌發(fā)有一定影響，因此需要根據(jù)不同的植物進(jìn)行培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和溫度等條件的前期摸索，時(shí)間消耗相對(duì)過(guò)長(zhǎng)。筆者采用的是高葶韭的離體萌發(fā)法配方，發(fā)現(xiàn)采用該方法的細(xì)香蔥花粉萌發(fā)率不高，并且操作起來(lái)較繁瑣，結(jié)果與郝瑞娟等[15]相同。相對(duì)于離體萌發(fā)法，染色法測(cè)定花粉活力具有簡(jiǎn)單和快捷的優(yōu)點(diǎn)，但由于受花粉特性影響，不同植物花粉適宜的染色方法不同，如高葶韭的花粉活力適宜聯(lián)苯胺和離體萌發(fā)法[12]、柳樹(shù)適宜藍(lán)墨水染色法[16]、茶樹(shù)花粉適宜離體萌發(fā)法和TTC 染色法[17]。在本試驗(yàn)中，TTC 法測(cè)定的細(xì)香蔥花粉活力較低，可能由于花粉外壁太厚或花粉內(nèi)含物中支鏈淀粉含量太少等原因，染色結(jié)果不佳，這與汪妮等[18]結(jié)果相似。聯(lián)苯胺染色法結(jié)果操作簡(jiǎn)單，是測(cè)定細(xì)香蔥花粉活力最適宜的方法。

3.2 花粉活力與花粉萌發(fā)

在試驗(yàn)之后，筆者進(jìn)行了種子收獲情況、質(zhì)量的調(diào)查。發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)香蔥可以收到種子，小部分種質(zhì)自交沒(méi)有種子。出現(xiàn)了部分花粉活力較高的細(xì)香蔥種質(zhì)未收獲種子，部分活力較低的細(xì)香蔥種質(zhì)也可以收到種子，但是收種數(shù)量不多的情況。這可能與花粉受精過(guò)程復(fù)雜、花粉活力只是花粉萌發(fā)的必備條件之一有關(guān)?；ǚ勖劝l(fā)除與本身內(nèi)在因素有關(guān)，還受許多外在環(huán)境及條件影響，柱頭可授性、花朵的開(kāi)放期、柱頭分泌物，以及外界環(huán)境、溫度、營(yíng)養(yǎng)條件等均能影響授粉成功率。傳粉是種子植物受精的必經(jīng)階段，其過(guò)程始于花藥開(kāi)裂和成熟花粉的散出，攜帶著雄配子或其前體的花粉粒被暴露在干燥條件下，必須在具有活力時(shí)到達(dá)適宜的接受柱頭。因此，花粉的活力與壽命、柱頭的可授性便成為傳粉生態(tài)學(xué)所必須研究的內(nèi)容。前人研究表明野生蔥屬植物在高溫、多風(fēng)及干燥等氣候特征的荒漠草原上生長(zhǎng)時(shí)，8 h 后花粉基本失去活力，并且柱頭只在開(kāi)花后2 d 內(nèi)具有較強(qiáng)可授性，可授性能持續(xù)5 d[11]。下一步可將針對(duì)細(xì)香蔥柱頭的可授性、細(xì)香蔥花粉保存等內(nèi)容繼續(xù)開(kāi)展香蔥種質(zhì)創(chuàng)制的基礎(chǔ)工作。

表3 不同細(xì)香蔥種質(zhì)的花粉活力測(cè)定結(jié)果

4 結(jié) 論

在TTC 染色法、聯(lián)苯胺染色法、離體萌發(fā)法中，采用聯(lián)苯胺染色法對(duì)細(xì)香蔥花粉活力進(jìn)行測(cè)定快速準(zhǔn)確，可作為細(xì)香蔥花粉活力快速測(cè)定的最佳方法。29 份細(xì)香蔥種質(zhì)中AF14 花粉活力最高，其次為AF93 和AF94，種質(zhì)間花粉活力存在顯著差異，可參考用于種質(zhì)配組及創(chuàng)制工作。