王祿星，王曉敏，2，3，宋建宇，張雪艷，2，3，田 梅，于 蓉

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021； 2.寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心 銀川 750021；3.寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室 銀川 750021； 4.寧夏農(nóng)林科學(xué)院種質(zhì)資源研究所 銀川 750002）

甜瓜白粉病是一種廣泛發(fā)生的世界性氣傳病害，已成為瓜類作物綠色生產(chǎn)的主要障礙之一[1]。該病從苗期到成株均可發(fā)生，但進(jìn)入中后期最為嚴(yán)重，主要危害葉片，嚴(yán)重時亦可危害葉柄和莖蔓[2]。在發(fā)病期白粉病菌呈指數(shù)增長且迅速傳播，使植株葉片大面積枯死，導(dǎo)致甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降，造成重大經(jīng)濟損失[3]。

甜瓜產(chǎn)業(yè)是寧夏回族自治區(qū)“1+4”特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一。近年來，寧夏甜瓜產(chǎn)業(yè)集約化、規(guī)模化效益顯著，栽培總面積超過8.6 萬hm2，種植規(guī)模和影響力在全國尤為突出[4]。但隨著種植面積的擴大，露地及設(shè)施甜瓜白粉病危害日益嚴(yán)重。種植抗病品種是防治甜瓜白粉病的最經(jīng)濟、有效、環(huán)保、可持續(xù)的措施[5-6]。而篩選和培育抗白粉病的甜瓜品種需要科學(xué)、簡便、精準(zhǔn)的抗性鑒定技術(shù)體系。因此，開展甜瓜白粉病抗病性鑒定方法研究，以及篩選優(yōu)質(zhì)抗源，對于開展甜瓜抗白粉病育種至關(guān)重要。雖然前人對于甜瓜白粉病室內(nèi)苗期抗性鑒定的苗齡[7-9]、孢子懸浮液濃度[10-11]、接種方法[7-8]等因素都分別進(jìn)行研究，但均以單因素試驗設(shè)計為主，以上幾個因素之間存在的交互作用卻被忽視，造成研究結(jié)果一致性較差，且接種白粉病菌后的保濕時間這一因素尚未在甜瓜上進(jìn)行研究，所以以上接種方法并不能成為甜瓜白粉病抗病性評價通用的最佳鑒定方法。

因此，筆者以前人對室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法單因素研究篩選的最佳結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇苗齡：2 葉1 心、3 葉1 心和4 葉1 心；孢子懸浮液濃度：104個·mL-1、105個·mL-1和106個·mL-1；接種方法：噴霧法、摩擦法和刷葉法；接種后保濕時間：12 h、24 h 和36 h；采用四因素三水平（L9（3）4）正交試驗設(shè)計篩選甜瓜白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法，并通過篩選出的最佳方法對23 份甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行苗期白粉病抗性評價及田間自然發(fā)病評價，然后對甜瓜抗性種質(zhì)資源進(jìn)行綜合評價，以期為有效開展寧夏甜瓜白粉病防治與白粉病抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甜瓜白粉病病原樣本 于2017 年5 月從寧夏銀川市溫室內(nèi)發(fā)病的甜瓜病株上隨機采集的白粉病病葉上分離出的甜瓜白粉病菌（Podosphaera xanthii）作為病原樣本。

1.1.2 甜瓜種質(zhì)資源 23 份甜瓜種質(zhì)資源由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝課題組和寧夏農(nóng)林科學(xué)院種質(zhì)資源研究所提供。具體來源信息詳見表1。其中，‘中原新羊角蜜’為感病對照品種，‘抗病F-3800’為抗病對照品種。

表1 23 份甜瓜種質(zhì)資源品種信息

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌的分離純化與擴繁 將采集的甜瓜白粉病病葉樣本先用無菌水洗掉表面灰塵，然后用軟毛刷將病菌孢子刷入含0.05%吐溫-20 的無菌水中，充分震蕩，用血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)，制成約1×105個·mL-1孢子懸浮液，詳見王萍等[11]的方法。用刷葉法接種到寧夏大學(xué)農(nóng)科實訓(xùn)基地溫室盆栽種植的感病甜瓜‘中原新羊角蜜’的葉片上。待葉片發(fā)病后，于發(fā)病初期通過單病斑分離、純化白粉病菌，經(jīng)鑒定后，再進(jìn)行擴繁與保存[8]。

1.2.2 室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法正交試驗 試驗于2017 年5—9 月在寧夏大學(xué)農(nóng)科實訓(xùn)基地溫室進(jìn)行，以室內(nèi)盆栽種植的‘中原新羊角蜜’為試驗材料，對苗齡（A）、孢子懸浮液濃度（B）、接種方法（C）[9]、保濕時間（D）采用四因素三水平（L9（3）4）的正交試驗設(shè)計，從而進(jìn)一步優(yōu)化甜瓜白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法，設(shè)計因素和水平詳見表2～3。每個試驗處理3 次重復(fù)，種植3 個口徑為15 cm、高13.5 cm 的育苗缽，每個育苗缽種3 株幼苗。

接種后7 d 開始觀察記錄發(fā)病情況，接種后15～20 d 病情充分發(fā)生并穩(wěn)定后調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)，分級標(biāo)準(zhǔn)按照《中國蔬菜病蟲預(yù)測預(yù)報》的方法[12]，詳見表4。病情指數(shù)（DI）＝∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）×100[12]。以病情指數(shù)最高的方法為最優(yōu)的鑒定方法。

表2 甜瓜白粉病苗期抗性鑒定試驗因素與水平

表3 甜瓜白粉病苗期抗性鑒定實施方案

表4 室內(nèi)苗期抗病性鑒定病情分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 甜瓜種質(zhì)資源的室內(nèi)苗期抗病性鑒定 采用1.2.2 中篩選的最佳的室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法于2018 年6 月對23 份種質(zhì)資源材料進(jìn)行抗病性鑒定，每份材料種植3 個育苗缽，每個育苗缽種植5株幼苗。設(shè)計完全隨機試驗，發(fā)病率和病情指數(shù)的調(diào)查詳見1.2.2。最終根據(jù)病情指數(shù)，對23 份甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行抗感分級[13]，詳見表5。

表5 甜瓜白粉病抗感分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 甜瓜種質(zhì)資源的田間自然發(fā)病抗病性調(diào)查 23 份甜瓜種質(zhì)資源于2018 年3—7 月種植在寧夏農(nóng)林科學(xué)院種質(zhì)資源研究所園林場大拱棚中，半高壟雙行栽植，壟高20 cm，畦寬90 cm，溝心距1.5 m，株距35 cm，小區(qū)面積24.75 m2（5.5 m×1.5 m×3 m）。在甜瓜成熟期前10 d（白粉病發(fā)病相對穩(wěn)定），每個種質(zhì)資源隨機選取10 株，每株隨機選取3片葉進(jìn)行田間抗病性調(diào)查，病情指數(shù)和抗感分級標(biāo)準(zhǔn)同室內(nèi)苗期抗病性鑒定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 本試驗所測數(shù)據(jù)全部采用Excel 2010 處理并作圖，同時利用SPSS 20.0 進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于正交試驗設(shè)計的室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法篩選

接種后15 d，感病甜瓜‘中原新羊角蜜’充分發(fā)病。首先對單個因素直觀分析，從圖1-A 可知，3 葉1 心和4 葉1 心的發(fā)病率無顯著差異，但均顯著高于2 葉1 心；從2 葉1 心到4 葉1 心，隨著甜瓜苗齡的增加，病情指數(shù)呈增長趨勢，4 葉1 心的病情指數(shù)顯著高于2 葉1 心，與3 葉1 心的無顯著性差異。由圖1-B 可知，隨著孢子懸浮液濃度的增加，發(fā)病率和病情指數(shù)存在先升高后降低的變化趨勢，不同處理下發(fā)病率之間無顯著性差異；105個·mL-1孢子懸浮液接種的病情指數(shù)顯著高于104個·mL-1，與106個·mL-1的無顯著性差異。接種方法和保濕時間不同處理之間發(fā)病率和病情指數(shù)均無顯著性差異（圖1-C 和1-D）。如圖1-E 所示，處理組合8（A3B2C2D3）發(fā)病率為100%，且病情指數(shù)顯著高于其他8 個處理組合，為70.00，其發(fā)病速度適中，病癥明顯，易于調(diào)查病害，所以該處理是甜瓜苗期白粉病抗病性鑒定最好的方法，即接種苗齡為4 葉1心，孢子懸浮液濃度105個·mL-1，摩擦法接種，接種后暗保濕36 h。

2.2 23份甜瓜種質(zhì)資源室內(nèi)苗期白粉病抗病性鑒定

采用室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法對甜瓜23 份種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗病性鑒定（表6），結(jié)果表明，‘15T41’‘中原新羊角蜜’‘15TZH-25’‘15TZH-01’表現(xiàn)為高感（HS），在接種后20 d 的發(fā)病率和病情指數(shù)較高且之間無顯著性差異，發(fā)病嚴(yán)重程度依次為‘15T41’＞‘中原新羊角蜜發(fā)病’＞‘15TZH-25’＞‘15TZH-01’；‘NT-1’‘日本蘭網(wǎng)’‘15T38’‘15TZH-16’‘15TZH-46’‘15TZH-23’‘15TZH-39’‘TZH-26’表現(xiàn)為中感（MS）；‘15TZH-24’表現(xiàn)為感?。⊿）；‘天蜜’‘ND-1’表現(xiàn)為抗?。≧）；‘玉露’表現(xiàn)為中抗（MR）；‘新密45 號’‘1464’‘綠洲紅’‘Sweet’‘美玉25 號’表現(xiàn)為高抗（HR），其中‘新密45 號’雖然發(fā)病率較高，但是病情指數(shù)較低；‘抗病F-3800’‘1489’表現(xiàn)為免疫（IM），發(fā)病率和病情指數(shù)均為0?？共☆愋鸵恢碌姆N質(zhì)資源材料之間的病情指數(shù)無顯著性差異。

圖1 室內(nèi)苗期抗性鑒定方法各組合的抗性鑒定結(jié)果（15 d）

表6 23 份甜瓜種質(zhì)資源室內(nèi)苗期白粉病抗病性鑒定（接種20 d）

2.3 寧夏地區(qū)23 份甜瓜種質(zhì)資源田間白粉病抗病性調(diào)查

如 表7 所 示，‘玉 露’‘天 蜜’‘15TZH-24’‘TZH-26’‘15TZH-39’在田間自然發(fā)病條件下的病情指數(shù)較室內(nèi)苗期發(fā)病條件下的有所下降，其中‘玉露’表現(xiàn)為高抗（HR）、‘天蜜’表現(xiàn)為中抗（MR）、‘15TZH- 24’表 現(xiàn) 為 抗 ?。≧）、‘TZH- 26’‘15TZH-39’表現(xiàn)為感?。⊿），以上材料較室內(nèi)苗期鑒定結(jié)果均提高了抗病類型的一個級別。其他甜瓜材料田間自然發(fā)病與室內(nèi)苗期抗病性鑒定結(jié)果一致。綜合室內(nèi)和田間鑒定結(jié)果，23 份甜瓜種質(zhì)資源中對白粉病免疫的材料有‘抗病F-3800’和‘1489’共2 份（發(fā)病率和病情指數(shù)均為0），高抗材料有‘新密45 號’‘1464’‘綠洲紅’‘Sweet’和‘美玉25 號’共5 份（發(fā)病率低且病情指數(shù)均在10 以下）。

表7 23 份甜瓜種質(zhì)資源田間白粉病抗病性鑒定

3 討論與結(jié)論

有效的接種方法是進(jìn)行病害抗性遺傳分析和抗病育種的基礎(chǔ)。筆者采用正交試驗，通過調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)，篩選出甜瓜苗期白粉病最佳的接種方法為：在4 葉1 心用105個·mL-1孢子懸浮液摩擦法接種白粉病菌，接種后保濕36 h。張玉勛等[7]發(fā)現(xiàn)，厚皮甜瓜苗期白粉病接種以子葉展開時為宜；臧全宇等[8]以不同抗性的甜瓜品種為試材，確定甜瓜2 片真葉期接種可以較好地表現(xiàn)品種之間的差異，同時也指出子葉期和4～5 片真葉期某些材料的苗期抗性會提高；張若緯等[9]通過接種后發(fā)病率對比，發(fā)現(xiàn)薄皮甜瓜接種苗齡2 葉1 心時為最佳接種苗齡；筆者通過研究4 個因素的交互作用，得出最佳的接種苗齡為4 葉1 心，這可能是因為采用試驗材料抗性不同，或鑒定方法的其他因素互相影響的結(jié)果。筆者發(fā)現(xiàn)，隨著孢子懸浮液濃度增加，發(fā)病率和病情指數(shù)呈現(xiàn)低—高—低的變化趨勢，這與張若緯等[9]的研究結(jié)果一致。關(guān)于苗期抗病性鑒定接種方法的比較研究中，臧全宇等[8]和張若緯等[9]的研究結(jié)果均表明噴霧法最佳，王迪等[10]卻認(rèn)為刷葉法發(fā)病率最高，最適宜進(jìn)行甜瓜白粉病抗病鑒定研究，而筆者在本研究的單因素分析中發(fā)現(xiàn)，不同接種方法之間并無顯著性差異，正交試驗的結(jié)果為摩擦法最佳，前兩者研究均為單因素試驗設(shè)計，未考慮其他接種因素的交互作用對研究結(jié)果的影響，推測這是研究結(jié)果不一致的主要原因。關(guān)于甜瓜白粉病鑒定方法接種后保濕時間的研究未見報道，筆者研究發(fā)現(xiàn)最佳保濕時間是36 h，與劉秀波等[14]對南瓜白粉病鑒定的保濕時間一致。此方法為甜瓜白粉病的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

選育抗病品種是防治甜瓜白粉病最經(jīng)濟、有效、環(huán)保、可持續(xù)的措施。筆者以23 份甜瓜種質(zhì)資源作為試驗材料，采用室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法和田間自然發(fā)病病情調(diào)查對其進(jìn)行評價，篩選出抗寧夏銀川地區(qū)白粉病菌的甜瓜抗源7 份，其中免疫材料2 份（‘1489’‘抗病F-3800’），高抗材料5 份（‘新密45 號’‘1464’‘綠洲紅’‘Sweet’‘美玉25 號’）。其中‘抗病F-3800’含糖量高、果肉厚，產(chǎn)量高[15]，適合在沙漠日光溫室春茬沙培種植[16]，‘綠洲紅’[15]屬于晚熟品種，產(chǎn)量較高，‘新密45 號’[17]抗寒力弱，建議在寧夏地區(qū)設(shè)施條件下推廣種植。以上抗性資源可通過與感病品種或品系的雜交與自交分離創(chuàng)新抗病種質(zhì)，為寧夏選育甜瓜抗白粉病優(yōu)良品種（系），也有助于對甜瓜白粉病抗性遺傳機制的深入了解。