龍利 張繼波 余建峰 覃慧群 金晟 徐敏

湖北省第三人民醫(yī)院腎病內(nèi)科（武漢430033）

原發(fā)性高尿酸血癥患病率逐年攀升，成為影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。腎臟為尿酸主要代謝場(chǎng)所，90%高尿酸患者屬于“尿酸代謝不足”[1-2]。人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)因子（human urate transporter，hUAT）又名人生電型的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要將尿酸鹽通過(guò)腎小管分泌入管腔，50%尿酸鹽由其介導(dǎo)，經(jīng)腎臟排出體外[3-4]。hUAT 蛋白表達(dá)水平過(guò)低是原發(fā)性高尿酸血癥的重要發(fā)病機(jī)制[5]。陳艷梅等[6]發(fā)現(xiàn)，替米沙坦通過(guò)促進(jìn)hUAT表達(dá)起到降尿酸作用，但具體機(jī)制未明。過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體-γ（peroxidosome proliferator activated type receptor-γ，PPAR-γ）屬Ⅱ型核受體超家族，在腎臟表達(dá)豐富，與配基結(jié)合后可調(diào)控腎內(nèi)髓集合管和間質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7-8]。而替米沙坦有類(lèi)似PPAR-γ相同結(jié)構(gòu)，能夠激活PPAR-γ 受體，誘導(dǎo)血清、腎組織PPAR-γ mRNA表達(dá)，從而起到腎臟保護(hù)作用[9]。而替米沙坦對(duì)于高尿酸血癥腎臟保護(hù)作用是否也是通過(guò)PPAR-γ途徑介導(dǎo)，目前尚未明確。本研究擬通過(guò)對(duì)高尿酸鹽刺激下腎小管上皮細(xì)胞對(duì)PPAR-γ和hUAT的表達(dá)，研究替米沙坦降尿酸機(jī)制，以進(jìn)一步論證和完善PPAR-γ/hUAT 蛋白表達(dá)通路。

1 材料與方法

1.1 材料HK-2人腎小管上皮細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)置于美國(guó)Thermo公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)于GIBCO公司；0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）、青霉素-鏈霉素購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；尿酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Trizol RNA 提取試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；TaqTMⅡPCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；引物購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組用完全培養(yǎng)液，在培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2 細(xì)胞，選第3- 5 代細(xì)胞，取同步處于G0期的細(xì)胞，隨機(jī)分為7組，分別為對(duì)照組（培養(yǎng)基，NC組）、模型組[尿酸（600 μmol/L），UM組]、高尿酸+替米沙坦組[尿酸（600 μmol/L）+替米沙坦（10 μmol/L），UT組]、高尿酸+羅格列酮組[尿酸（600 μmol/L）+羅格列酮（10 μmol/L），UR組]、高尿酸+GW9662組[預(yù)先用5 000 nmol/L PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸（600 μmol/L），UG組]、高尿酸+替米沙坦+GW9662組[預(yù)先用5 000 nmol/L PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸（600 μmol/L）+替米沙坦（10 μmol/L），UTG組]和高尿酸+羅格列酮+GW9662組[預(yù)先用5 000 nmol/L PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸（600 μmol/L）+羅格列酮（10 μmol/L），URG組]。各組刺激培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞融合約90%～95%。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡情況終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)基吸出，用PBS 清洗、0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞（1×106）。離心去上清，用70%冰乙醇沉淀，4℃懸浮固定24 h。固定細(xì)胞經(jīng)碘化丙啶綜合染料（PI、Rnase、Triton X-100）一步法染色30 min后，300 目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)DNA 含量，計(jì)數(shù)在G1 峰前出現(xiàn)的DNA含量下降的亞二倍體峰的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)終止培養(yǎng)后收集細(xì)胞（1×106）。離心、洗滌、棄上清，加1∶100 稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ蛋白單克隆抗體100 μL；37℃水浴、離心、棄上清，加1∶20 稀釋的羊抗鼠IgG-FITC 100 μL，水浴、離心洗滌、去上清，除去未結(jié)合熒光抗體，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/L，上機(jī)（FACSCalibur，BD）檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照：用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替1∶100 稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ 單抗。陰性對(duì)照：只加1∶100 稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ 單抗而不加IgG-FITC 抗體的陰性對(duì)照。結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞率表示。

1.2.4 Q-PCR 法檢測(cè)HK-2細(xì)胞hUAT、PPAR-γ、TGF-β1的表達(dá)情況Trizol 法提取總RNA：RNA溶液在-80℃條件下保存。取1 μL RNA 溶液，用紫外分光光度計(jì)于260 nm和280 nm 處測(cè)吸光度，OD260/OD280比值在1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄cDNA：合成后的cDNA 在-20℃或更低溫度下保存。熒光定量PCR反應(yīng)：通過(guò)GenBank查找hUAT、PPAR-γ和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）序列，選取GAPDH 作為內(nèi)參。應(yīng)用CFX96TM 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，取平均擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ct值。以?xún)?nèi)參GAPDH為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)定量ΔCt值。以對(duì)照組為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)定量ΔΔCt值。采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法比較三個(gè)基因的mRNA的表達(dá)差異。2-ΔΔCt代表實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。ΔΔCt值=實(shí)驗(yàn)組（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）-對(duì)照組（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）。熒光定量PCR 擴(kuò)增基因引物序列，hUAT：上游（5′→3′）GACTTCCTAGTGGGTGTGAA，下 游（5′→3′）AATGTCATTTCCACTGAAGC，產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度225 bp；PPAR-γ：上游（5′→3′）AGCCAACACTAAACCACA，下游（5′→3′）AGAAACCCTTGCATCCT，產(chǎn)物長(zhǎng)度337 bp；TGF-β1：上 游（5′→3′）AGCGACTCGCCAGAGTGGTTA，下游（5′→3′）GCAGTGTGTTATCCCTGCTGTCA，產(chǎn)物長(zhǎng)度130 bp；GAPDH：上游（5′→3′）CCTTCCGTGTTCCTAC，下游（5′→3′）GACAACCTGGTCCTCA，產(chǎn)物長(zhǎng)度152 bp。

1.2.5 Western blot檢測(cè)正常及高尿酸條件下HK-2 細(xì)胞hUAT、PPAR-γ、TGF-β1的表達(dá)取出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)處理組的培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 沖洗2遍，按照6孔板每孔加入100～200 μL（6 cm 培養(yǎng)皿200～300 μL）裂解液的比例加入裂解液。充分裂解，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，通過(guò)TANONGIS 軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）及t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HK-2細(xì)胞凋亡的結(jié)果與NC組相比，UM組凋亡率明顯增加（P＜0.05），提示尿酸鹽刺激腎小管上皮細(xì)胞存在明顯凋亡表現(xiàn)；與UM組相比，UT組、UR組凋亡率下降明顯（P＜0.05），替米沙坦、羅格列酮能抑制尿酸鹽刺激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡；與NC組相比，UG組凋亡率增加（P＜0.05），而在應(yīng)用PPAR-γ抑制劑后聯(lián)合替米沙坦、羅格列酮，與單純應(yīng)用抑制劑（UG組）相比，則凋亡率下降明顯（P＜0.05）；與單獨(dú)應(yīng)用替米沙坦（UT組）、羅格列酮（UR組）相比，UTG組（P＜0.05）、URG組（P＞0.05）凋亡率存在輕度升高，提示替米沙坦無(wú)法逆轉(zhuǎn)PPAR-γ抑制劑的促凋亡作用。見(jiàn)表1。

表1 各組HK-2 細(xì)胞凋亡的結(jié)果Tab.1 Apoptosis of HK-2 cells in each group x±s

2.2 各組HK-2細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)的結(jié)果通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛋白表達(dá)（以陽(yáng)性細(xì)胞率表示），與NC組相比，UM組hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率比例減少（P＜0.05）；經(jīng)替米沙坦（10 μmol/L）、羅格列酮（10 μmol/L）干預(yù)后，與模型組比較，UT組、UR組兩組患者h(yuǎn)UAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率比例均有增加（P＜0.05），其中UT組尤為明顯（P＜0.05），表明替米沙坦增加hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率比例較羅格列酮更顯著；用PPAR-γ 阻斷劑GW9662 處理后，與NC組相比，UG組hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率比例明顯減少（P＜0.05），與UM組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加入PPAR-γ 抑制劑，同時(shí)用替米沙坦或羅格列酮干預(yù)后，與UT組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率比例均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與UR組相比，URG組在hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 各組HK-2 細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率Fig.1 Protein positive cell rate in hk-2 cells among all groups

表2 各組HK-2 細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率Tab.2 Protein positive cell rate among all groups ±s

表2 各組HK-2 細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率Tab.2 Protein positive cell rate among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

組別NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值hUAT（%）34.42±5.17 14.86±2.87a 30.63±2.39b 24.10±1.26b 12.46±1.19ab 21.57±1.64c 19.53±1.51d 89.807***PPAR-γ（%）33.44±6.76 17.20±4.92a 30.59±8.08b 27.73±5.46b 14.15±1.07ab 24.12±4.66c 24.45±3.73d 16.657***

2.3 各組HK-2細(xì)胞hUAT、PPAR-γ基因表達(dá)（QPCR）的結(jié)果與NC組相比，UM組hUAT、PPAR-γ基因表達(dá)明顯減少（P＜0.05），提示高尿酸可抑制hUAT、PPAR-γ基因表達(dá)；經(jīng)替米沙坦或羅格列酮干預(yù)刺激，與UM組相比，UT組、UR組兩組hUAT、PPAR-γ基因表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）；給予PPAR-γ 抑制劑刺激后，與NC相比，UG組hUAT、PPAR-γ基因表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；給予PPAR-γ 抑制劑處理，同時(shí)給予替米沙坦或羅格列酮后，與UT組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ基因表達(dá)下降（P＜0.05）；與UR組相比，URG組hUAT、PPAR-γ基因表達(dá)下降（P＜0.05）。見(jiàn)表3、4和圖2。

表3 各組HK-2 細(xì)胞PPAR-γ mRNA表達(dá)Ct值結(jié)果Tab.3 Results of Ct value of mRNA expression of PPAR-γ in HK-2 cells among all groups ±s

表3 各組HK-2 細(xì)胞PPAR-γ mRNA表達(dá)Ct值結(jié)果Tab.3 Results of Ct value of mRNA expression of PPAR-γ in HK-2 cells among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值PPAR-γ Ct值24.41±0.16 25.69±0.1 27.05±0.08 26.06±0.06 26.38±0.2 24.22±0.3 24.67±0.04內(nèi)參Ct值20.62±0.05 19.37±0.02 22.33±0.09 21.98±0.16 20.57±0.19 19.42±0.15 19.47±0.07△Ct 3.79±0.19 6.32±0.09 4.72±0.08 4.08±0.11 5.81±0.11 4.80±0.19 5.20±0.04△△Ct 0±0.19 2.53±0.09 0.92±0.08 0.28±0.11 2.02±0.11 1.01±0.19 1.41±0.04 2-△△Ct 1.00±0.19 0.17±0.09a 0.53±0.08b 0.82±0.11b 0.25±0.11a 0.50±0.19c 0.38±0.04d 59.614***

表4 各組HK-細(xì)胞hUAT mRNA表達(dá)Ct值結(jié)果Tab.4 Results of Ct value of hUAT mRNA expression in HK-cells among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值UAT Ct值23.75±0.12 24.91±0.26 26.58±0.08 26.24±0.12 27.74±0.15 24.25±0.13 24.37±0.03內(nèi)參Ct值20.62±0.05 19.37±0.02 22.33±0.09 21.98±0.16 20.57±0.19 19.42±0.15 19.47±0.07△Ct 3.13±0.07 5.54±0.25 4.25±0.01 4.26±0.04 7.17±0.04 4.82±0.26 4.90±0.09△△Ct 0±0.07 2.41±0.25 1.12±0.01 1.13±0.04 4.04±0.04 1.69±0.26 1.77±0.09 2-△△Ct 1.0±0.07 0.19±0.25a 0.46±0.01b 0.46±0.04b 0.06±0.04a 0.31±0.26c 0.29±0.09d 328.336***

2.4 各組HK-2細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)的結(jié)果與NC組相比，UM組hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；經(jīng)替米沙坦、羅格列酮刺激后，與UM組相比，UT組、UR組hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；給予PPAR-γ 抑制劑后，與NC組相比，UG組hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；加入PPAR-γ 抑制劑后，應(yīng)用替米沙坦或羅格列酮干預(yù)后，與UT組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與UR組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、4。

圖2 各組HK-2 細(xì)胞PPAR-γ mRNA、hUAT mRNA 熒光定量PCR 結(jié)果Fig.2 Fluorescence quantitative PCR results of PPAR-γ mRNA and hUATmRNA from HK-2 cells among all groups

圖3 各組HK-2 細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)灰度值Fig.3 Gray values of hUAT and PPAR-γ protein expression in HK-2 cells among all groups

圖4 各組HK-2 細(xì)胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達(dá)相對(duì)量Fig.4 Relative levels of hUAT and PPAR-γ protein expression in HK-2 cells among all groups

2.5 各組HK-2腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)情況從Q-PCT及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，UM組TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），提示尿酸鹽刺激腎小管上皮細(xì)胞容易誘發(fā)腎間質(zhì)纖維化；而單獨(dú)應(yīng)用替米沙坦及羅格列酮后，與UM組相比，mRNA及蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），表明替米沙坦及羅格列酮存在抗纖維化作用；應(yīng)用PPAR-γ抑制劑后，與NC組相比表達(dá)增加明顯（P＜0.05），與UM組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PPAR-γ抑制劑聯(lián)合替米沙坦、羅格列酮治療后，與UG組相比，表達(dá)有所減少（P＜0.05），而分別與UT組（P＜0.05）、UR組（P＞0.05）相比，仍呈高表達(dá)，提示抑制PPAR-γ表達(dá)，替米沙坦無(wú)法逆轉(zhuǎn)TGF-β1 蛋白表達(dá)增強(qiáng)。見(jiàn)表5和圖5-7。

表5 各組HK-細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)Ct值結(jié)果Tab.5 Results of Ct value of TGF-β1 mRNA expression in HK-cells among all groups ±s

表5 各組HK-細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)Ct值結(jié)果Tab.5 Results of Ct value of TGF-β1 mRNA expression in HK-cells among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值TGF-β1 Ct值23.13±0.1 19.46±0.13 23.72±0.64 23.49±0.44 20.88±0.13 20.04±0.15 20.35±0.31內(nèi)參Ct值20.62±0.05 19.37±0.02 22.33±0.09 21.98±0.16 20.57±0.19 19.42±0.15 19.47±0.07△Ct 2.51±0.07 0.09±0.11 1.39±0.67 1.51±0.43 0.31±0.10 0.62±0.23 0.88±0.37△△Ct 0±0.07-2.42±0.09-1.11±0.7-1.0±0.48-2.19±0.04-1.89±0.24-1.63±0.35 2-△△Ct 1.00±0.07 5.35±0.33a 2.16±1.18b 1.99±0.67b 4.57±0.11a 3.72±0.64c 3.09±0.78d 25.263***

3 討論

體內(nèi)嘌呤代謝紊亂或尿酸鹽排泄失常，導(dǎo)致血尿酸水平升高，與痛風(fēng)、高血壓、心血管和腎臟疾病關(guān)系密切[10]。近曲腎小管對(duì)尿酸的重吸收增加或分泌減少是其排泄減少的重要原因[11]。hUAT是具有高選擇性的尿酸鹽單向轉(zhuǎn)運(yùn)通道，主要將尿酸鹽通過(guò)近曲腎小管分泌入管腔[12]，此外腸道中的UAT 也發(fā)揮類(lèi)似的分泌功能[13]。因此，UAT 在調(diào)節(jié)全身尿酸穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。高尿酸環(huán)境下，人腎小管上皮細(xì)胞hUAT表達(dá)顯著增高，主要表達(dá)于近端腎小管刷狀緣側(cè)，遠(yuǎn)端小管、間質(zhì)無(wú)陽(yáng)性表達(dá)[14]。早期可能表現(xiàn)為代償性增加，當(dāng)血尿酸達(dá)到600 μmol/L時(shí)，UAT 蛋白表達(dá)明顯減弱，提示通過(guò)調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞UAT的表達(dá)，降低血尿酸水平，對(duì)腎臟有保護(hù)作用[6]。

圖5 各組HK-2 細(xì)胞TGF-β1 mRNA 熒光定量PCR 結(jié)果Fig.5 Fluorescence quantitative PCR results of TGF-β 1mRNA from HK-2 cells among all groups

圖6 各組HK-2 細(xì)胞TGF-β1 蛋白表達(dá)灰度值Fig.6 Gray values of TGF-β1 protein expression in HK-2 cells among all groups

圖7 TGF-β1 蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative levels of TGF-β1 protein expression in HK-2 cells among all groups

PPAR-γ屬Ⅱ型核受體超家族，通過(guò)與配基（或配體）結(jié)合后調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。生理情況下，集合管強(qiáng)表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞弱表達(dá)[15]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其激動(dòng)劑，通過(guò)與配基結(jié)合，具有抗炎、抗增殖、抗纖維化及減少蛋白尿等腎臟保護(hù)作用[16-18]。羅格列酮/吡格列酮為PPAR-γ受體激動(dòng)劑代表藥，可抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）分泌、抑制TLR/NF-κB信號(hào)通路激活，下調(diào)趨化因子表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎、腎臟保護(hù)作用[19-20]。在急性腎損傷、糖尿病腎病模型中，羅格列酮可提高大鼠腎組織PPAR-γ蛋白的活性，抑制大鼠的腎損傷[21-22]。以羅格列酮為參照發(fā)現(xiàn)，尿酸鹽刺激腎小管上皮細(xì)胞后PPAR-γ、hUAT表達(dá)下調(diào)，羅格列酮干預(yù)能提高PPAR-γ及hUAT表達(dá)，加入PPAR-γ抑制劑同時(shí)應(yīng)用羅格列酮，PPAR-γ、hUAT 變化不顯著，羅格列酮無(wú)法逆轉(zhuǎn)PPAR-γ抑制后尿酸鹽所致腎小管上皮細(xì)胞hUAT表達(dá)下降，提示通過(guò)刺激PPAR-γ受體可調(diào)節(jié)hUAT表達(dá)。

陳艷梅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦有提高h(yuǎn)UAT表達(dá)，減少TGF-β1表達(dá)，起到降尿酸、抗腎間質(zhì)纖維化作用，而替米沙坦也能部分激活PPAR-γ 受體[24]，其激活PPAR-γ 能力不依賴(lài)于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用。臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦能上調(diào)組織中PPAR-γ mRNA及蛋白表達(dá)，對(duì)心梗后心衰、肥胖相關(guān)腎病及5/6 腎切除大鼠有保護(hù)作用[9，25-26]。替米沙坦對(duì)尿酸性腎病患者的腎臟保護(hù)作用，除外與血尿酸降低有關(guān)（血尿酸是慢性腎臟疾病發(fā)生、進(jìn)展獨(dú)立危險(xiǎn)因素[26]），是否與激活PPAR-γ有關(guān)，它們之間是否存在相關(guān)性，目前尚未明確，因此筆者建立尿酸鹽刺激下腎小管上皮細(xì)胞模型，以之來(lái)論證這種機(jī)制是否存在。

TGF-β1為公認(rèn)致纖維化因子，能夠反映腎臟損傷程度，在尿酸鹽刺激腎小管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)明顯表達(dá)[27]，此外，隨著尿酸鹽濃度增加，腎小管上皮細(xì)胞增殖能力下降，凋亡率升高，尿酸還可通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡[28]，加劇腎臟損傷。因此監(jiān)測(cè)TGF-β1表達(dá)和HK-2腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況，能直接反映腎臟損傷情況。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率及TGF-β1 增加（P＜0.05），hUAT、PPAR-γ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率、基因及蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），替米沙坦能顯著減少細(xì)胞凋亡及TGF-β1表達(dá)，提高h(yuǎn)UAT及PPAR-γ表達(dá)；PPAR-γ抑制劑聯(lián)合替米沙坦應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)尿酸鹽刺激所致細(xì)胞凋亡及TGF-β1 增加未逆轉(zhuǎn)，而且hUAT及PPAR-γ仍然減少，因此得出結(jié)論：尿酸鹽刺激HK-2腎小管上皮細(xì)胞PPAR-γ蛋白表達(dá)，替米沙坦具有激活PPAR-γ受體作用；替米沙坦能調(diào)節(jié)尿酸鹽刺激腎小管上皮細(xì)胞后所致hUAT蛋白下降，起到腎臟保護(hù)作用，這種作用是通過(guò)PPAR-γ調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及TGF-β1蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。