孫 琦 趙志超 張瑾暉 張 鋒 程治軍,* 鄒德堂

水稻包穗突變體的遺傳分析和基因精細(xì)定位

孫 琦1,**趙志超2,**張瑾暉2張 鋒2程治軍2,*鄒德堂1,*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江哈爾濱 150030;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

水稻穗下倒一節(jié)間的伸長(zhǎng)和發(fā)育對(duì)株型的形成起著重要作用, 在水稻不育系中常見的包穗現(xiàn)象是由于穗下倒一節(jié)間的伸長(zhǎng)和發(fā)育受阻造成的, 深入研究水稻包穗分子機(jī)制能為水稻不育系株型的改良提供一定的理論意義。我們?cè)诰綤itaake的組織培養(yǎng)后代中獲得了1個(gè)包穗突變體, 其穗部被劍葉葉鞘包裹程度處于半包裹和全包裹之間, 倒一節(jié)間嚴(yán)重縮短細(xì)胞學(xué)形態(tài)分析表明, 倒一節(jié)間的縮短是由于節(jié)間薄壁細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)不足造成的。通過對(duì)與IRAT129雜交后代分析表明,為單基因顯性突變。對(duì)該組合F2的608個(gè)正常單株遺傳定位分析結(jié)果表明, 候選基因被精細(xì)定位在4號(hào)染色體長(zhǎng)臂端, 由InDel標(biāo)記S4-14.1和S4-14.2界定的110 kb的區(qū)域內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)的編碼基因在基因組序列水平上無差異, 而基因LOC_Os04g39430表達(dá)量在突變體中升高了264倍, 該基因編碼1個(gè)參與油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BR)合成的細(xì)胞色素P450蛋白, 是的等位基因。qRT-PCR分析結(jié)果表明, 突變體中BR信號(hào)途徑的基因表達(dá)量增高, 預(yù)示著BR信號(hào)途徑的基因可能參與了穗下倒一節(jié)間的伸長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)控。

水稻; 包穗; 精細(xì)定位;; BR信號(hào)途徑的基因

雜交水稻不育系普遍存在包穗現(xiàn)象, 主要表現(xiàn)在穗頸節(jié)縮短、穗部約30%~60%潁花包裹在劍葉葉鞘內(nèi)而無法伸出[1]。在大田生產(chǎn)實(shí)際中, 一般通過外部噴施一定濃度赤霉素(GA3)的方法來解除包穗現(xiàn)象[2]。但噴施GA3不僅在一定程度上增加了制種成本、降低了雜交種質(zhì)量, 而且其噴施效果在很大程度上依賴噴施者的相關(guān)技術(shù)、天氣情況及施用時(shí)期等[3-4]。因此利用包穗突變體, 克隆包穗相關(guān)基因, 研究包穗形成的分子生物學(xué)機(jī)制, 對(duì)于降低制種成本, 提高雜交種產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的理論指導(dǎo)意義。

水稻倒一節(jié)間的縮短導(dǎo)致了包穗現(xiàn)象, 該性狀不僅受主效基因的控制, 而且同時(shí)受微效基因的影響。至今12個(gè)控制倒一節(jié)間長(zhǎng)度的QTL已被檢測(cè)到, 并且通過自然變異、理化誘變、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)獲得了11種包穗突變體, 這些突變體包括、、、、、、、、、和[5-17]。根據(jù)穗部被包裹的程度可分為全包穗和部分包穗。、、、、、和為部分包穗的突變體,和為全包穗的突變體其中各節(jié)間均表現(xiàn)出不同程度的縮短, 而,和的節(jié)間縮短僅特異地發(fā)生在倒一節(jié)間。和均已經(jīng)被克隆, 且為同一個(gè)基因[10,15],和分別定位在4號(hào)染色體上和2號(hào)染色體上[14,16]。除此之外, 有關(guān)水稻包穗突變體相關(guān)基因的研究報(bào)道極少。因此, 通過突變體挖掘新的包穗基因, 為深入探究水稻倒一節(jié)間生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

Zhu等[11]報(bào)道了2個(gè)突變體和, 其倒一節(jié)間發(fā)育受阻。Ma等[15]也發(fā)現(xiàn)了倒一節(jié)間縮短的突變體, 并命名為本實(shí)驗(yàn)的突變體材料表型和前人報(bào)道突變體表型相似, 因此我們將突變體命名為。突變體在表型上屬于1個(gè)半包穗和全包穗之間的突變體, 表現(xiàn)出倒一節(jié)間縮短, 遺傳上表現(xiàn)為顯性。通過與正常抽穗品種IRAT129雜交, 構(gòu)建了對(duì)該突變位點(diǎn)的遺傳作圖群體, 利用圖位克隆的方法, 我們最終獲得了目標(biāo)基因。初步結(jié)果表明, 該基因表達(dá)量增加導(dǎo)致了包穗的表型, 該突變體為深入研究BR (brassinolide)信號(hào)通路基因控制水稻包穗表型提供了材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻包穗突變體來源于日本粳稻品種Kitaake的組織培養(yǎng)后代。以粳稻品種IRAT129為父本, 以突變體為母本進(jìn)行雜交, 雜交種種于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所順義試驗(yàn)基地。同年, 將F2分離群體種植于海南省三亞實(shí)驗(yàn)基地, 常規(guī)水肥管理。成熟時(shí), 田間隨機(jī)選取野生型Kitaake和突變體各10株, 考察株高、分蘗數(shù)、倒一節(jié)間長(zhǎng)度、粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚、每穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀, 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 倒一節(jié)間細(xì)胞學(xué)觀察

抽穗后取Kitaake和突變體的倒一節(jié)間, 徒手用刀片切3 mm左右的節(jié)間組織, 放置于50%甲醇和10%乙酸混合固定液中, 4℃固定12 h。固定后, 轉(zhuǎn)移至80%乙醇中, 80℃孵育5 min, 再移至固定液固定1 h, 用水洗凈后置于1%高碘酸中, 室溫靜置40 min。洗凈后置于100 μg mL–1碘化丙啶希夫試劑中染色1~2 h, 再置于水合氯醛溶液過夜透明。用激光共聚焦顯微鏡(ZEISS Microsystems LSM 700)觀察并照相。

1.3 包穗突變基因的精細(xì)定位與候選基因分析

在田間分別取樣2個(gè)親本IRAT129、及總共608個(gè)F2分離群體中隱性(正常表型)單株的葉片, 進(jìn)行突變基因精細(xì)定位。葉片全基因組DNA的提取采用改進(jìn)的CTAB法。首先, 隨機(jī)選取取樣的F2單株9株與2個(gè)親本的DNA一起構(gòu)建混池, 利用均勻分布于12條染色體上, 且在雙親間有多態(tài)性的186個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行基因連鎖分析。隨后, 再隨機(jī)選取66個(gè)隱性單株驗(yàn)證連鎖的分子標(biāo)記, 進(jìn)行初定位。最后, 在初定位的基礎(chǔ)上, 用新開發(fā)的多態(tài)性InDel標(biāo)記對(duì)全部608個(gè)隱性單株基因型進(jìn)行精細(xì)定位。新標(biāo)記開發(fā)參考網(wǎng)站Gramene (http://ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html)上秈稻和粳稻日本晴的基因組序列, 在初定位區(qū)間內(nèi)進(jìn)行序列對(duì)比尋找插入/缺失位點(diǎn), 用Premier3在線軟件(http: //primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)InDel分子標(biāo)記, 委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成(表1)。采用北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司的Premix進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 染色顯色后觀察。利用網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/ gbrowse/rice/)確定區(qū)間內(nèi)ORF, 利用南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase擴(kuò)增, 委托北京博邁德基因技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 新開發(fā)的多態(tài)性InDel和SNP引物

1.4 候選基因及油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因表達(dá)量分析

成熟期分別取野生型和突變體的倒一節(jié)間基部組織。采用TIANGEN公司的RNA試劑盒提取植物組織總RNA, FastKing cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司的TB Green Premix ExII試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 在Applied Biosystems 7500 Real-time PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng), 評(píng)價(jià)油菜素內(nèi)酯合成及信號(hào)相關(guān)基因(引物表2)在野生型和突變體倒一節(jié)間基部組織中的表達(dá)情況, 內(nèi)參基因?yàn)?NCBI Locus: XM_020816636), 每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

表2 qRT-PCR所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 包穗突變體sui2的表型分析

在成熟期, 突變體的穗部被劍葉葉鞘包裹, 其包裹的程度介于半包裹的和全包裹之間(圖1-A, B)。的包穗表型是由于節(jié)間的伸長(zhǎng)與葉鞘的伸長(zhǎng)不同步造成的, 在突變體中, 除倒三、倒四節(jié)間沒有表現(xiàn)出明顯的差異外, 倒一、倒二節(jié)間長(zhǎng)度都相應(yīng)縮短, 尤其是倒一節(jié)間的長(zhǎng)度僅為對(duì)照Kitaake的50% (圖1-C, 表3)。此外, 突變體還表現(xiàn)植株矮化、分蘗數(shù)增加、每穗粒數(shù)減少、結(jié)實(shí)率下降、籽粒變大和劍葉變窄(表3), 尤為特別的是,的倒一和倒二葉的夾角顯著增大(圖1-G, H)。

圖1 野生型與突變體sui2的表型比較

A: 野生型野生型(左)與突變體(右)成熟期表型; B: 成熟期野生型(左)與突變體(右)的1個(gè)典型的包穗的表型比較; C: 成熟期野生型(左)與突變體(右)的各節(jié)間表型比較, 自左至右為倒一、二、三、四節(jié)間; D, E: 野生型(D)和突變體(E)倒一節(jié)間橫切面細(xì)胞學(xué)比較; F: 野生型和突變體倒一節(jié)間縱切面細(xì)胞學(xué)比較; G, H: 野生型(G)與突變體(H)苗期倒一和倒二葉葉片夾角。標(biāo)尺: (A) 15 cm; (B) 5 cm; (C) 5 cm, (D, E) 200 μm; (F) 50 μm。

A: Phenotypes of WT (left) and(right) plants at rippenperiod; B: Phenotype comparison of the sheathed panicle of WT (left) and(right) at the maturationperiod; C: Comparison of internodes between WT (left) and(right), from left to right is the uppermost internode, penultimate internode, antepenult internode, fourth internode from top down; D, E: Transverse sections of the first internode of WT (D) and(E); F: Longitudinal sections of the uppermost internode of wild type and; G, H: The leaf angles between the last and penultimate leaf in the WT (G) and(H) at the seedlingstage. Scale bars: (A) 15 cm; (B) 5 cm; (C) 5 cm; (D, E) 200 μm; (F) 50 μm.

表3 野生型Kitaake和突變體sui2農(nóng)藝性狀比較

*表示在< 0.05水平差異顯著;**表示在< 0.01水平差異顯著。

*represents significantly different at< 0.05;**represents significantly different at< 0.01.

2.2 sui2節(jié)間形態(tài)分析

突變體株型矮化, 成熟期株高約43 cm, 只有野生型的80%左右。突變體倒一節(jié)間縮短嚴(yán)重, 其長(zhǎng)度僅為野生型倒一節(jié)間的50% (表3)。由于節(jié)間細(xì)胞數(shù)量減少或細(xì)胞伸長(zhǎng)受到抑制, 造成了矮稈突變體節(jié)間縮短的表型。為了深入研究細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目對(duì)突變體倒一節(jié)間長(zhǎng)度的影響, 我們通過PI染色處理成熟期野生型和突變體的倒一節(jié)間并進(jìn)行顯微觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 相對(duì)于野生型, 在橫截面上, 突變體薄壁細(xì)胞數(shù)目沒有明顯增多(圖2-B), 薄壁細(xì)胞的體積變小, 莖稈壁增厚, 空氣髓腔明顯減小, 維管束數(shù)目減少(圖1-D, E); 在縱切面上, 突變體的細(xì)胞長(zhǎng)度明顯縮短, 突變體的細(xì)胞寬度也變窄(圖1-F, 圖2-A)。因此, 突變體倒一節(jié)間的薄壁細(xì)胞伸長(zhǎng)出現(xiàn)了障礙, 突變體表現(xiàn)出的矮稈及其包穗表型是細(xì)胞伸長(zhǎng)受阻所導(dǎo)致。

圖2 野生型和突變體節(jié)間組織薄壁細(xì)胞體積和數(shù)目比較

A: 野生型和突變體倒一節(jié)間縱切面薄壁細(xì)胞長(zhǎng)度及寬度; B: 野生型和突變體倒一節(jié)間橫截面半徑含有的細(xì)胞數(shù)目。* 表示在<0.05水平差異顯著; ** 表示在< 0.01水平差異顯著。

A: Comparisons of the length and width of stem parenchyma cells from longitudinal sections of the uppermost internode in wild type and; B: comparison of cell numbers of the radius in the transverse sections of the uppermost internode in wild type and. * represents significantly different at< 0.05; ** represents significantly different at< 0.01.

2.3 遺傳分析

對(duì)與抽穗正常的IRAT129品種的雜交組合后代分析結(jié)果表明, F1植株全部包穗, 為突變體表型。F2群體出現(xiàn)明顯的性狀分離。隨機(jī)調(diào)查927個(gè)單株, 217株表現(xiàn)為正常表型, 710株表現(xiàn)為包穗表型, 經(jīng)卡方(χ2)測(cè)驗(yàn)(χ2= 1.25, χ20.05= 3.84), 該表型符合1對(duì)顯性基因3 (顯性)∶1 (隱性)的分離比。

2.4 基因定位與候選基因分析

從F2群體中隨機(jī)選取9個(gè)隱性(正常抽穗)單株葉片構(gòu)建DNA混池。選用實(shí)驗(yàn)室186對(duì)均勻分布在水稻12條染色體上, 且在雙親間具有多態(tài)性InDel或SSR引物, 對(duì)DNA混池進(jìn)行連鎖分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂端的2個(gè)標(biāo)記S4-14和S4-15與混池DNA的單株連鎖。之后進(jìn)一步用66個(gè)F2取樣單株對(duì)這兩個(gè)標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證, 并確定了物理距離為0.83 Mb初定位區(qū)間(圖3-A)。利用Gramene網(wǎng)站(http://ensembl.gramene.org/genome_browser/index. html)的秈粳稻基因組序列對(duì)比信息, 在初定位區(qū)間新開發(fā)了2個(gè)分子標(biāo)記S4-14.1和S4-14.4, 利用全部F2單株將基因定位在S4-14.1與S4-14.4之間, 物理距離為287 kb的范圍。進(jìn)一步開發(fā)2個(gè)SNP分子標(biāo)記S4-14.2和S4-14.3, 將基因最終定位在了標(biāo)記S4-14.1和S4-14.2之間物理距離為110 kb區(qū)間內(nèi)(圖3-B)。

根據(jù)水稻基因組注釋信息數(shù)據(jù)庫(http://rice. plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/), 該區(qū)間內(nèi)共包含14個(gè)基因和2個(gè)轉(zhuǎn)座子(表4和圖3-C)。對(duì)所有14個(gè)基因的基因組測(cè)序在野生型和突變體之間均沒有發(fā)現(xiàn)差異, 說明的突變表型并不是由于DNA水平上的差異引起的。由于基因表達(dá)量的差異也會(huì)引起植株表型的變化, 我們進(jìn)一步分析了區(qū)間內(nèi)14個(gè)基因在成熟期的表達(dá)水平。如圖4所示, 與野生型相比, 在中有4個(gè)基因明顯上調(diào), 1個(gè)基因明顯下調(diào), 而其他候選基因的表達(dá)量在兩者之間無明顯差異。鑒于該突變體為顯性, 我們重點(diǎn)關(guān)注表達(dá)量差異較大的2個(gè)基因LOC_Os04g39420 (上調(diào)9倍)和LOC_ Os04g39430 (上調(diào)264倍)。經(jīng)查閱文獻(xiàn), LOC_ Os04g39420編碼了6-磷酸果糖激酶-2 (6-phosphofructokinase-2), 可能參與水稻籽粒淀粉的理化性質(zhì)形成[17]; LOC_Os04g39430編碼了1個(gè)細(xì)胞色素450蛋白, 為的1個(gè)等位基因, 該基因的過表達(dá)植株的表型除了有包穗外, 其他表型也與本實(shí)驗(yàn)的突變體相似[18]。因此, 我們認(rèn)定LOC_Os04g39430是參與調(diào)控水稻包穗表型的候選基因。

表4 定位區(qū)間內(nèi)基因的功能注釋

圖3 候選基因SUI2基因的圖位克隆示意圖

A:初步定位在4號(hào)染色體標(biāo)記S4-14和S4-15之間; B:被精細(xì)定位在S4-14.1和S4-14.2之間的110 kb范圍內(nèi); C:精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)包含的14個(gè)基因和2個(gè)轉(zhuǎn)座子。橫線的上方為定位所用的分子標(biāo)記, 橫線下方為交換單株數(shù)。

A: Rough mapping of the geneflanked by two markers S4-14 and S4-15; B:was fine mapped to a 110 kb interval delimited by two markers S4-14.1 and S4-14.2 region; C: 14 ORFs and 2 transposons within the fine-mapped fragment. The molecular markers used in linkage analysis were indicated above the bold lines, and the umbers beneath the bold lines represented the recombinants identified by the corresponding markers.

對(duì)不同組織中表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果表明,在突變體的幼穗、葉枕、莖稈中表達(dá)水平均顯著提高,在幼穗中表達(dá)量為514倍, 在莖中表達(dá)量為369倍, 在葉枕表達(dá)量為214倍(圖5)。

圖4 候選基因的qRT-PCR檢測(cè)

圖5 SUI2在不同組織中的表達(dá)量變化情況

2.5 突變體油菜素內(nèi)酯合成及信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)量分析

LOC_Os04g39430編碼了1個(gè)細(xì)胞色素P450酶, 它在油菜素內(nèi)酯合成通路中發(fā)揮作用, 可能參與了油菜素內(nèi)酯生物合成通路中6-DeoxoTY和TY的合成[18]。為了檢測(cè)突變體中其他油菜素內(nèi)酯合成及信號(hào)通路基因表達(dá)量的變化, 我們利用qRT-PCR分析了野生型和突變體中油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因[19][20][21]及信號(hào)通路相關(guān)基因[22][23][24][25][26]在莖稈中的表達(dá)情況。結(jié)果表明, 與野生型相比, 3個(gè)合成基因在突變體的表達(dá)量沒有一致變化規(guī)律, 1個(gè)表達(dá)量上調(diào)()、1個(gè)下調(diào)()、1個(gè)沒有明顯變化()。而被檢測(cè)的6個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因中, 有4個(gè)基因的表達(dá)量明顯上調(diào), 尤其是基因BU1的表達(dá)量增加了6倍多, 預(yù)示著可能一些BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因參與了穗頸節(jié)的伸長(zhǎng)和包穗表型的調(diào)控。

3 討論

水稻的穗外露主要由倒一節(jié)間的長(zhǎng)度決定, 由于突變體倒一節(jié)間顯著縮短, 導(dǎo)致穗頸節(jié)伸出度降低, 從而產(chǎn)生包穗。包穗突變體來自于粳稻品種Kitaake的組織培養(yǎng)后代, 突變體籽粒增大、單穗粒數(shù)減少、結(jié)實(shí)率下降明顯。對(duì)的莖稈細(xì)胞生物學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 株高變矮和包穗產(chǎn)生的原因可能與細(xì)胞的縱向伸長(zhǎng)不足有關(guān)。對(duì)該突變體的遺傳分析結(jié)果表明, 它為1個(gè)顯性突變體, 突變基因被定位在第4號(hào)染色體的標(biāo)記S4-14.1和S4-14.2之間, 物理距離為110 kb的區(qū)間內(nèi)。區(qū)間內(nèi)的基因LOC_Os04g39430的表達(dá)量在突變體內(nèi)發(fā)生了明顯的上調(diào), 高達(dá)230倍。由于LOC_Os04g39430是的等位基因, 加之該基因的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致包穗現(xiàn)象[27], 我們認(rèn)為L(zhǎng)OC_Os04g39430是引起包穗表型的關(guān)鍵基因。由于LOC_Os04g39430的基因組和啟動(dòng)子沒有DNA序列水平上的差異, 該包穗表型可能不是由于DNA水平上的差異引起的, 我們推測(cè)可能是由于表觀遺傳修飾引起的基因表達(dá)量升高而造成包穗表型。表觀遺傳學(xué)修飾涉及到DNA甲基化、非編碼RNA的調(diào)控、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等多種類型[28-29], 具體哪種現(xiàn)象導(dǎo)致突變體的表型差異, 尚不明確, 需要對(duì)該基因進(jìn)行深入研究。

圖6 油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因在野生型和突變體中的表達(dá)量變化情況

A: 野生型及的莖稈中油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因的表達(dá)水平; B: 野生型及的莖稈中油菜素內(nèi)酯信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)水平。*表示在< 0.05水平差異顯著;**表示在< 0.01水平差異顯著。

A: Relative expression levels of the genes related to BR biosynthesis in WT andculms. B: Relative expression levels of the genes related to BR signaling in the young WT andyoung culms.*represents significantly different at< 0.05;**represents significantly different at< 0.01.

基因LOC_Os04g39430最初被Tanabe等[18]命名為基因, 它編碼了1種細(xì)胞色素P450蛋白, 是BR生物合成過程中的1種關(guān)鍵酶。后來研究又陸續(xù)報(bào)道了幾種的等位基因, Wu等[27]研究表明表現(xiàn)為株高降低、葉夾角變小、籽粒變小, 突變體中表達(dá)量上調(diào)了5倍; Shi等[30]研究表明,表現(xiàn)籽粒變小且為黃褐色, 植株高于野生型, 葉片直立, 該基因在突變體的葉中的表達(dá)量為野生型的2.5倍, 而在莖、根、葉鞘、小穗中該基因表現(xiàn)為下調(diào); Guo等[31]報(bào)道突變體表現(xiàn)為半包穗、葉夾角變小、葉寬增加、籽粒發(fā)育不正常。以上3個(gè)突變體均為隱性突變體。而本實(shí)驗(yàn)中為顯性突變體, 表現(xiàn)為株高降低, 第1節(jié)間縮短, 籽粒變長(zhǎng), 自苗期之后的全生育期葉夾角明顯增大, 葉寬減少。這與之前報(bào)道的其他幾個(gè)突變體明顯不同。Tanabe等[18]又發(fā)現(xiàn)基因與BR生物合成有關(guān), 本研究對(duì)野生型和突變體莖稈組織中的BR合成與信號(hào)通路相關(guān)基因進(jìn)行了表達(dá)量分析, 結(jié)果表明與野生型相比,中BR合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)量無一致的變化趨勢(shì), 而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào), 因此過表達(dá)該類基因可能導(dǎo)致了BR信號(hào)途徑基因表達(dá)量增加。

GA是調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng)和最上節(jié)間長(zhǎng)度的主要植物激素[32]。Zhu等[33]和Luo等[34]研究發(fā)現(xiàn),與具有生物活性赤霉素GA4代謝有關(guān), 同時(shí)發(fā)現(xiàn)穗下倒一節(jié)間伸長(zhǎng)與赤霉素積累有關(guān), 穗下倒一節(jié)間伸長(zhǎng)突變體在節(jié)間部位積累了過量的赤霉素。Oikawa等[35]研究結(jié)果表明基因突變可以抑制植株體內(nèi)赤霉素合成, 體內(nèi)赤霉素含量降低, 最終導(dǎo)致細(xì)胞伸長(zhǎng)受阻, 使植株矮化, 但噴施外源GA可恢復(fù)其表型。此外, 一些研究也指出磷脂酰絲氨酸合酶也參與了倒一節(jié)間伸長(zhǎng)[15]。但是, 關(guān)于BR途徑基因?qū)λ胂碌挂还?jié)間伸長(zhǎng)影響的報(bào)道極少, 它們具體作用的分子機(jī)制仍待探究。BR相關(guān)途徑的基因表達(dá)水平分析表明, 有可能信號(hào)途徑的基因參與了倒一節(jié)間伸長(zhǎng)的表達(dá)調(diào)控,也為這方面深入研究提供了難得的材料。

4 結(jié)論

通過對(duì)來源于組織培養(yǎng)后代的包穗突變體研究發(fā)現(xiàn), 突變體倒一節(jié)間長(zhǎng)度縮短是包穗的主要原因。此外,還表現(xiàn)植株矮化、分蘗數(shù)增加、每穗粒數(shù)減少、結(jié)實(shí)率下降、籽粒變大、劍葉變窄、倒一和倒二葉的夾角顯著增大等表型。該性狀受1對(duì)顯性基因控制,基因被定位在水稻4號(hào)染色體上標(biāo)記S4-14.1和S4-14.2之間物理距離為110 kb區(qū)間內(nèi), 候選基因LOC_Os04g39430編碼了1個(gè)細(xì)胞色素P450蛋白。本研究同時(shí)也證明了油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑的基因有可能參與了倒一節(jié)間伸長(zhǎng)的表達(dá)調(diào)控, 這為進(jìn)一步研究BR信號(hào)通路基因控制水稻包穗機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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Genetic analysis and fine mapping of a sheathed panicle mutantin rice (L.)

SUN Qi1,**, ZHAO Zhi-Chao2,**, ZHANG Jin-Hui2, ZHANG Feng2, CHENG Zhi-Jun2,*, and ZOU De-Tang1,*

1Key Laboratory of Germplasm Enhancement, Physiology and Ecology of Food Crops in Cold Region, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

The elongation and development of rice uppermost internode plays an important role in plant architecture development. In general, the sheathed panicle phenomenon in rice sterility line is caused by the elongation and development hindrance of the uppermost internode. The study on molecular mechanisms underlying sheathed panicle would be helpful for improving plant architecture in sterility line. At the present study, we reported the study on a sheathed panicle mutant, named, originated from a tissue-culture progeny. Its uppermost internode severely shortened, resulted in its pancleen closed by flag leaf sheath, without significantly length alternation at other internodes. The cytological analysis demonstrated that the shorten of the uppermost internode is caused by insufficient elongation of the parenchyma cells. Genetic analysis of the progeny derived from the cross-combination ofand IRAT129 revealed thatis a single gene dominant mutant. Linkage analysis to 608 normal individuals from F2generation showed thatwas located in a 110 kb region delimited by InDel marks S4-14.1 and S4-14.2 on the end of chromosome 4 long arm. The annotated genes on this region did not display any difference in genomic sequence, while the expression level of, encoding a cytochrome P450 protein and an allele of, increased by 264 times expression amount in mutant. Analysis of qRT-PCR for several crucial genes on BR (brasssinolide) signaling pathway showed that in mutant the expression level of all these genes increased, indicating that genes in BR signaling pathway may be involved in the regulation to the elongation and development of uppermost internode.

rice; sheathed panicle; fine mapping;; BR signaling pathway

10.3724/SP.J.1006.2020.02009

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31871603)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31871603).

鄒德堂, E-mail: zoudtneau@126.com; 程治軍, E-mail: chengzhijun@caas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

孫琦, E-mail: 517596634@qq.com; 趙志超, E-mail: zhaozhichao@caas.cn

2020-02-14;

2020-06-02;

2020-06-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200622.1052.002.html