柳海東 潘云龍 杜德志

甘藍型春油菜早花位點加密及位點聚合創(chuàng)建優(yōu)異早花資源

柳海東**潘云龍**杜德志*

青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 / 青海省春油菜遺傳改良重點實驗室 / 國家油菜改良中心青海分中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部春油菜科學(xué)觀測實驗站 / 青海省春油菜工程技術(shù)研究中心, 青海西寧 810016

前期在甘藍型春油菜NNDH群體中定位到和2個早花主效QTL, 分別開發(fā)了與緊密連鎖的SSR標記G1803、InDel標記IA7-4, 以及與緊密連鎖的SSR標記S035。本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了早花QTL位點的BC2F2群體, 進一步對該位點加密, 開發(fā)了與緊密連鎖的標記SNP11。利用開發(fā)的與兩個位點緊密連鎖的4個標記對93個甘藍型春油菜自然資源進行早花基因型鑒定, 從中篩選出含有位點的資源3164和2216, 含有位點的資源3484和2857, 兩位點資源之間兩兩正反雜交進行位點聚合。通過小孢子培養(yǎng)和標記輔助選擇快速獲得聚合DH系, 篩選出性狀優(yōu)良且早花的聚合系與波里馬細胞質(zhì)雄性不育系配置雜交組合, 連續(xù)2年多點進行測產(chǎn)試驗, 對聚合系利用價值進一步分析。加密結(jié)果顯示, 該位點被定位于SNP11和SNP12區(qū)間中, 與SNP11共分離。自然資源早花基因型鑒定結(jié)果顯示, 含有位點的單株50個, 平均初花期58.1 d, 含有位點的單株16個, 平均花期58.3 d, 同時含有兩位點的單株16個, 平均花期55.2 d, 表明同時包含兩早花位點株系比只含有一個早花位點株系早開花。聚合結(jié)果顯示, 早花位點和的聚合單株開花時間比單位點親本單株的開花時間提前2~3 d, 其中來自位點的3164和位點的3484聚合后的DH18比親本早開花3 d, 產(chǎn)量相關(guān)性狀都優(yōu)于其他品系。進一步利用DH18與波里馬細胞質(zhì)雄性不育系025A配置組合, 將該組合定名為TZG18, 2年9點測產(chǎn)結(jié)果表明, TZG18比青藏高原白菜型主栽品種浩油11號增產(chǎn)17.5%以上。綜上研究結(jié)果說明, 早花位點聚合品系比早花單位點品系在開花時間上有著明顯的優(yōu)勢, 同時對增加油菜產(chǎn)量也有影響。本研究是甘藍型春油菜早花性狀MAS育種的初步探索, 為春油菜區(qū)特早熟甘藍型春油菜品種替代白菜型油菜提供了材料支持, 也為基因聚合育種技術(shù)提供了新途徑。

甘藍型春油菜; 早花位點; 基因聚合; 早花資源

分子標記輔助選擇(molecular marker-assisted selection, MAS)是從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成, 實現(xiàn)對基因型的直接選擇[3]。目前, MAS技術(shù)應(yīng)用主要集中在基因聚合(gene pyramiding)、基因滲入(gene transgression)、根據(jù)育種計劃構(gòu)建基因系等方面。魯守平等[4]以高油玉米自交系By804為供體, 利用MAS技術(shù), 將2個主效QTL分別回交轉(zhuǎn)育至普通玉米自交系lx9801、lx03-2及l(fā)x00-1中, 結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)育目標QTL后自交系絕對含油量較輪回親本平均增加0.72%。楊海峰等[5]利用分子標記輔助篩選洋蔥不育系并配制雜交組合, 隨后利用分子標記檢測雜交種的育性, 共選育出101A、A1、D-9、A3和T五套不育系。付蓉[6]利用MAS技術(shù), 將抗根腫病位點和導(dǎo)入到不含抗根腫病位點的高油酸材料中, 通過回交選育得到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗根腫病高油酸新材料。Abhilash等[7]利用分子標記輔助回交育種(molecular marker-assisted backcross breeding，MABB), 將水稻中抗細菌性白葉枯病基因和、抗瘟性基因和導(dǎo)入到中纖細谷物型雜交水稻的穩(wěn)定恢復(fù)系RPHR-1005中, 提高了水稻對細菌性白葉枯病和稻瘟病的抗性。李旭[8]利用油菜9012AB核不育資源, 通過分子標記輔助選擇, 將抗根腫病基因?qū)隯H5和ZS9三系高油酸材料中, 育性表現(xiàn)和高油酸核不育系相似, 實現(xiàn)了抗根腫病高油酸ZH5材料和ZS9材料的三系配套?；蚓酆鲜菍⒎稚⒃诓煌贩N中的優(yōu)良性狀基因通過雜交、回交、復(fù)合雜交等手段聚合到同一個品種中, 已經(jīng)成為現(xiàn)代作物育種的一個重要的育種手段[9]。Zhong等[10]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法將甜菜孢囊線蟲的抗性基因BvHs1和轉(zhuǎn)移到油菜中, 獲得不同的轉(zhuǎn)基因品系, 并將Hs1基因聚合到同一植物內(nèi)。侯富恩等[11]將抗番茄黃化曲葉病基因、和進行聚合, 利用MAS技術(shù)選擇, 分別獲得含與和與的聚合系, 2份株系整個生育期在田間對番茄黃化曲葉病都表現(xiàn)抗病, 并且園藝性狀優(yōu)良穩(wěn)定。

在油菜眾多的農(nóng)藝性狀中, 早花是早熟的前提條件, 早熟性狀是當前油菜品種選育的一個重要性狀指標[12], 在高海拔春油菜產(chǎn)區(qū)早熟育種尤為重要, 該類地區(qū)白菜型油菜產(chǎn)量較低, 品質(zhì)差, 而甘藍型春油菜產(chǎn)量和品質(zhì)方面都優(yōu)于白菜型油菜, 但在生育期上不具優(yōu)勢, 因此, 選育出早熟的甘藍型油菜代替青海等高海拔地區(qū)的白菜型油菜, 對提高和改善現(xiàn)有高海拔地區(qū)油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)意義重大, 這也是春油菜產(chǎn)區(qū)研究的主要內(nèi)容[13-14]。前期利用NNDH群體定位到和2個主效QTL, 分別位于A7和C8染色體, 共同解釋花期表型變異的23%, 兩主效QTL等位基因都來自于早花親本, 能促進晚花材料提前開花2~3 d, 且分別開發(fā)了與緊密連鎖的SSR標記G1803 (0.1 cM)[15]、InDel標記IA7-4 (共分離)[16], 以及與緊密連鎖的SSR標記S035 (0.4 cM)[15]。本研究進一步構(gòu)建BC2F2群體對該位點加密, 開發(fā)緊密連鎖標記, 并通過分子標記輔助選擇(MAS)育種技術(shù)和位點聚合技術(shù), 將不同早花主效QTL位點導(dǎo)入聚合到一個品系中, 以期為春油菜區(qū)特早熟甘藍型春油菜品種替代白菜型油菜提供材料支持, 為基因聚合育種技術(shù)提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用已構(gòu)建完成的包含527個單株的BC2F2分離群體(NN DH系中的早花材料DH189為母本, 晚花親本No.5246輪回親本)對位點進行加密。甘藍型春油菜資源93份, 波里馬細胞質(zhì)雄性不育系025A, 對照材料為白菜型地方品種浩油11號, 以上材料均由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用CTAB法[17]提取DNA, 每個材料苗期取新鮮嫩葉5 g。

1.2.2主效位點SNP和InDel標記開發(fā)

選取早花親本No.4512、晚花親本No.5246、NNDH系中極端早花和晚花的株系各20株, 等量混合構(gòu)建的早花混合池(E池)和晚花池(L池) 4個測序樣本, 送北京諾和致源Illumina HiSeqPE150平臺測序。測序數(shù)據(jù)與甘藍型油菜基因組(http://www. genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/Brassica_napus_ v4.1.chromosomes.fa.gz)比對, 結(jié)果經(jīng)SAMTOOLS 0.1.19去除重復(fù)[18]。采用GATK3.3軟件[19]的Unified Genotyper模塊進行多個樣本SNP的檢測, 使用Variant Filtration過濾。再根據(jù)混池間的基因型頻率差異進行SNP-index計算, 用Δ(SNP-index)統(tǒng)計候選區(qū)間[20-21], 根據(jù)候選區(qū)間SNP和InDel信息開發(fā)標記。

調(diào)取SNP和InDel位點上下游各150 bp的序列, 使用軟件Primer 5設(shè)計引物, CG含量在40%~50%之間,m值為55℃左右, 長度為18~22 bp, 由上海生工生物工程有限公司[Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.]合成引物。SSR標記PCR擴增體系為10 μL, 包含DNA 1 μL、dNTP 0.8 μL、10×TE buffer 1 μL、酶0.2 μL、primer 0.5 μL、超純水(ddH2O) 6.5 μL。SNP和InDel標記PCR擴增體系為10 μL, 包含DNA 2.5 μL、dNTP 1 μL、10×TE buffer 1 μL、酶0.2 μL、primer 1 μL、ddH2O 4.3 μL。通過6%聚丙烯酰胺凝膠電泳, 然后使用銀染法檢測基因型。

1.2.3區(qū)間加密及定位 利用已設(shè)計的SNP和InDel標記對BC2F2群體進一步掃描。采用JoinMap 4.0 軟件[22]構(gòu)建連鎖圖譜, 選用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為圖距單位(centi-Morgan, cM)[23]。利用Mapchart 2.1軟件繪制連鎖圖譜[24]。利用WinQTLcartographer 2.5軟件中復(fù)合區(qū)間作圖法(composite interval mapping, CIM)進行QTL分析定位, 操作步驟參照Doerge和Churchill[25]描述進行。

4.我產(chǎn)奶，我有犄角，但我不是奶牛。我是誰？（答案：a milk truck 奶車。horn 既有“犄角”的意思，又有“喇叭”的意思。）

1.2.4 甘藍型春油菜資源早花基因型鑒定及兩早花位點聚合 利用已開發(fā)的與早花主效QTL緊密連鎖的標記SSR G1803和InDel IA7-4、與QTL緊密連鎖的標記SSR S035及本試驗中開發(fā)的緊密連鎖的SNP標記對93份春性甘藍型油菜資源進行基因型鑒定。與早花材料No.4512基因型相同的用AA表示, 與晚花材料No.5246基因型相同的用BB表示; 從93份基因型庫中篩選到分別含有和的單株各2株, 不同單位點的單株兩兩雜交獲得F1, 通過小孢子培養(yǎng)快速獲得DH系, 并進行基因型鑒定、花期和農(nóng)藝性狀考察。

1.2.5 農(nóng)藝性狀考察 于2016年將BC2F2群體及親本種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院試驗地, 統(tǒng)計初花期, 初花期 = 25%開花時間 ? 播種期[26], 以小區(qū)內(nèi)每個植株第1朵花開為標準, 當小區(qū)中25%的植株達到開花標準后則認為該材料達到初花期。于2017年春季將93個自然資源、聚合后兩位點聚合系及其親本種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院試驗地, 隨機區(qū)組設(shè)計3個重復(fù), 每重復(fù)3行, 行長1.6 m, 行間距30 cm, 株距20 cm, 每行苗期定苗8株。材料成熟時, 每小區(qū)在中間1行隨機取樣6株考種, 考察角果長度、每角粒數(shù)、全株角果數(shù)、千粒重、單株產(chǎn)量和初花期等農(nóng)藝性狀。角果長度: 果身長度(不包括果柄和果喙); 每角粒數(shù): 在主軸及上、中、下分枝花序上隨機取10個正常角果, 計算其平均每果飽滿和略欠飽滿的種子數(shù); 全株角果數(shù): 全株具有1粒以上飽滿或略欠飽滿種子的角果總數(shù); 千粒重: 將整個小區(qū)完熟種子混勻稱千粒重量; 單株產(chǎn)量: 整株所有種子稱量結(jié)果[26]。田間管理按常規(guī)進行。

1.2.6 與不育系配制雜交組合產(chǎn)量分析 于2017年秋季將篩選出的聚合后產(chǎn)量、品質(zhì)性狀優(yōu)良及早花的DH系與波里馬細胞質(zhì)雄性不育系025A在云南元謀配制雜交組合, 于2018年將F1、浩油11號分別種植于門源沙溝梁(36°48′N, 101°06′E, 海拔3030 m)、門源后院(36°45′N, 101°15′E, 海拔2863 m)、湟源(36°31′N, 101°07′E, 海拔3132 m)、同德(35°09′N, 100°09′E, 海拔3280 m), 2019年種植于門源后院、湟源、同德、貴南牧場(35°45′N, 101°35′E, 海拔3315 m)和海北(35°25′N, 101°25′E, 海拔3150 m)。各品種(系)在不同地方按3個重復(fù)種植, 每重復(fù)0.0015 hm2, 栽培管理按常規(guī)進行, 各地水肥措施一致。成熟后收獲并稱取產(chǎn)量, 最終產(chǎn)量(kg hm-2) = 小區(qū)產(chǎn)量/0.0015, 增產(chǎn)比率 = (試驗組產(chǎn)量 ? 對照組)/對照組產(chǎn)量×100%。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用Microsoft Excel和SPSS 22.0進行產(chǎn)量及花期相關(guān)數(shù)據(jù)的檢驗和方差分析(ANOVE), 數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 早花位點cqDTFC8加密

2.1.1 SNP和InDel標記的開發(fā)及篩選 結(jié)合NNDH群體定位結(jié)果和BSA重測序結(jié)果,位于C8染色體SSR標記S033和S035之間, 其物理位置為1.6~6.0 Mb[27], 根據(jù)該區(qū)間候選SNP和InDel信息開發(fā)標記, 共開發(fā)標記32對, 其中SNP標記12對, InDel標記20對。進一步對32對標記在早花親本DH189和晚花親本No.5246中進行多態(tài)性篩選, 雙親采取2對2的方式進行篩選, 即同時添加2個早親模板和2個晚期模板, 發(fā)現(xiàn)有6對SNP標記和3對InDel標記在2對早親中帶型一致, 同樣在2對晚親中帶型相同, 且雙親中差異明顯, 帶型清晰、易讀, 都表現(xiàn)為共顯性。序列信息如表1。

表1 SNP和Indel引物序列信息

2.1.2 局部遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及定位

利用側(cè)翼及區(qū)間標記S033、S034、S035 (圖1-A)以及上述篩選出的6對SNP和3對InDel標記對BC2F2群體進行掃描, 以及鑒定群體單株基因型并構(gòu)建局部遺傳連鎖圖譜。通過對12對標記數(shù)據(jù)連鎖分析發(fā)現(xiàn), 新開發(fā)的9個標記被定位在原區(qū)S033和S035區(qū)間之內(nèi)。局部遺傳圖譜遺傳距離為0~11.6 cM, 平均遺傳距離0.97 cM, 遺傳距離最小的區(qū)間為InDel 60~InDel 55 (0.2 cM) (圖1-B)。

位點在NNDH群體中被定位于P7MC5-285~S035之間, 置信區(qū)間為131.0~133.5 cM,區(qū)間距離2.5 cM (圖1-A)。結(jié)合局部遺傳連鎖圖譜和BC2F2群體表型, 進一步將定位于2.2 cM的位置, 置信區(qū)間為2.1~2.7 cM, 介于SNP11與SNP12之間, 區(qū)間距離0.6 cM, 且與SNP11共分離, 解釋表型貢獻率為34% (圖1-B)。通過進一步加密, 將原來區(qū)間縮小到0.6 cM。通過與新開發(fā)標記物理圖譜共線性分析發(fā)現(xiàn), 4個標記SNP6、SNP11、SNP12、SNP14在新遺傳圖譜上的排布與物理圖譜一致, 共線性較好, 但SNP20、SNP21和3個InDel標記在新遺傳圖譜上的排布較之物理圖譜稍有變化(圖1-B, C)。表明本研究有效地將9對新開發(fā)標記定位于候選區(qū)間之內(nèi), 并進一步加密了早花主效QTL位點。

圖1 加密前后分子標記遺傳連鎖圖譜主要位點對比及新標記共線性分析

A: NNDH群體中構(gòu)建的C8染色體局部遺傳連鎖圖譜; B: BC2F2群體中加密位點后的局部遺傳連鎖圖譜; C: 加密標記的物理圖譜。

A: partial genetic linkage map of chromosome C8 constructed in the NNDH population; B: partial genetic linkage map after encryptinglocus in BC2F2population; C: the physical map of the encrypted markers.

2.2 自然資源中早花基因型鑒定

利用加密前距離最近的共顯性SSR標記S035 (0.4 cM)、加密后與共分離的標記SNP11、與位點緊密連鎖的標記G1803 (0.1 cM)及共分離標記IA7-4對93個甘藍型春油菜資源進行不同位點基因型鑒定。93個自然資源被4個標記分為AA和BB 2種基因型(表2)。在位點G1803標記下, 有53個攜帶早花等位基因的資源開花時間變幅為53.2~62.1 d, 平均初花期為58.7 d, 40個BB基因型的資源開花時間變幅為63.2~77.3 d, 平均初花期為65.7 d, AA基因型的資源平均初花期顯著短于BB基因型(<0.05); 對IA7-4位點分析顯示, 有50個攜帶早花基因的品系和43個攜帶晚花基因的資源平均開花時間分別為58.1 d和65.9 d, 差異呈顯著水平(<0.05), 初花期變幅與G1803標記下的變幅相差不大。位點S035標記也將93份資源分成AA和BB 2種基因型, 其中AA基因型的資源21個, 初花期變幅為55.7~61.7 d, 平均初花期58.6 d, 72個BB基因型的資源初花期變幅為62.3~77.7 d, 平均初花期64.9 d, 顯著晚于AA基因型的資源初花期(<0.05); SNP11掃描后獲得AA基因型的資源16個, 初花期變幅為52.4~59.3 d, 平均初花期58.3 d, BB基因型的資源77個, 變幅為62.1~79.3 d, 平均初花期64.4 d, 二者初花期差異呈顯著水平(<0.05)。在4個標記中同時呈現(xiàn)AA基因型的資源有16個, 平均初花期55.2 d, 同時呈現(xiàn)BB基因型的資源有30個, 平均初花期65 d, 兩者呈極顯著差異(<0.01), 同時可以看出變幅減小(表2)。說明在自然資源中, 當早花位點或存在時, 早開花; 當不存在兩早花位點等位基因時, 晚開花; 同時包含兩早花位點株系比只含有一個早花位點株系的開花時間早, 花期變幅越小。

表2 93份甘藍型春油菜資源在兩早花位點4個標記中的基因型鑒定結(jié)果

值后的a、b、c、d、e分別表示G1803、IA7-4、S035、SNP11以及同時含有4個標記下的AA、BB基因型的資源平均初花期檢驗。

a,b,c,d, andeafter-values represent average first flowering time by Student’s-test for G1803, IA7-4, S035, SNP11, and the four markers AA and BB genotypes, respectively.

2.3 早花位點聚合及初花期、產(chǎn)量相關(guān)性狀分析

為了快速選育特早熟甘藍型春油菜資源, 從上述93個自然資源中選取初花期較早且相近, 每位點2個標記下都表現(xiàn)早花基因型但不包含另外一個位點的資源進行早花位點聚合, 其中含早花位點的資源為3164和2216, 含早花位點的資源為3484和2857, 不同位點單株兩兩正反雜交, F1進行小孢子培養(yǎng), 共篩選到15個與親本初花期相近或較早的DH系。利用與緊密連鎖的標記G1803、IA7-4和與緊密連鎖的標記S035、SNP11對這15個DH系的基因型鑒定發(fā)現(xiàn), DH2、DH4、DH5、DH12、DH18、DH20和DH23共7個聚合DH系在G1803 (330 bp)、IA7-4 (120 bp)、S035 (170 bp)和SNP11 (105 bp) 4個標記下都表現(xiàn)為早花帶型(圖2)。進一步對單位點親本及7個聚合DH系初花期分析發(fā)現(xiàn), 含有早花位點的資源3164和2216初花期分別為58.3 d和59.2 d, 含有早花位點的資源3484和2857初花期分別為57.6 d和60.0 d, 7個聚合DH系初花期介于54.5 d至57.3 d之間, 比各自親本平均初花期早2~3 d, 其中來自(3484×3164)的DH18初花期最早, 為54.5 d, 比兩親本早開花3 d (表3)。

親本3484 ()角果長度和全株角果數(shù)分別為8 cm和341個, 顯著高于2216 ()和2857 (); 3164 ()角果長度為7.8 cm, 顯著高于2857 (<0.05); 每角粒數(shù)最多的是3164 (296個), 與其他3個親本差異達顯著水平(<0.05); 千粒重除了2857最低之外, 其余3個差異不顯著; 4個親本單株產(chǎn)量無明顯差異(表3)。7個聚合DH系中, DH18在角果長度、每角粒數(shù)、千粒重、全株角果數(shù)等4個性狀上都顯著優(yōu)于其他6個聚合DH系(<0.05); DH18千粒重為21.4 g, 在7個聚合DH系中最高, 除與DH2和DH20無明顯差異外, 與其他4個聚合DH系差異均達顯著水平(<0.05, 表3)。說明在4個親本中, 3484和3164在角果長度、全株角果數(shù)和每角粒數(shù)等產(chǎn)量相關(guān)因子方面優(yōu)于其他兩親本; 通過3484和3164雜交聚合和后, 獲得的DH18不但花期提前, 而且產(chǎn)量性狀表現(xiàn)優(yōu)異。表明親本農(nóng)藝性狀的優(yōu)良決定了子代性狀的好壞。

圖2 4個緊密連鎖標記對聚合DH系基因型鑒定結(jié)果

a: 與連鎖標記G1803鑒定結(jié)果; b: 與連鎖標記IA7-4鑒定結(jié)果; c: 與連鎖標記S035鑒定結(jié)果; d: 與連鎖標記SNP11鑒定結(jié)果。M為marker, 4512為早花親本, No.5246為晚花親本, 兩者基因型為標準, 與4512帶型相同則認為含有早花位點, 與5246帶型相同則不含。箭頭所指的是7個聚合DH系在4個標記下都與4512帶型一致。

a: identification results of G1803 linkage mark with; b: identification results of IA7-4 linkage mark with; c: identification results of S035 linkage mark with; d: identification results of SNP11 linkage mark with. M is marker, 4512 is the parent of early flowering, and 5246 is the parent of late flowering. Both genotypes are considered as standard, and the same as No.4512 band type is considered to contain early flowering locus, while the same as 5246 band type is not considered to contain early flowering locus. The arrow points to seven polymerized DH lines that are consistent with the 4512 band type under four markers.

表3 單位點親本及位點聚合系產(chǎn)量性狀和開花時間表現(xiàn)

各性狀后的小寫字母表示在0.05水平的差異顯著性。

Values not sharing the same lowercase letters are considered statistically significant at the 0.05 probability level.

2.4 聚合系DH18配制雜交種潛力分析

于2017年利用DH18與波里馬細胞質(zhì)雄性不育系025A配置組合, 雜種F1定名為TZG18, 連續(xù)2年進行測產(chǎn)。2018年在青海省門源沙溝梁、門源后院、湟源、同德4地測產(chǎn), 2019年在青海省門源后院、湟源、同德、貴南牧場、海北州5地測產(chǎn)。2018年TZG18在湟源、同德兩地表現(xiàn)增產(chǎn), 較浩油11號產(chǎn)量達到顯著水平(<0.05), 在門源沙溝梁和門源后院略有減產(chǎn), 但與浩油11號差異不明顯; TZG18在4個地方平均產(chǎn)量為1391.7 kg hm-2, 顯著高于浩油11號(1150.0 kg hm-2) 21% (表4)。2019年TZG18在門源后院和貴南牧場產(chǎn)量表現(xiàn)較浩油11號沒有明顯差異(>0.05), 但在湟源、同德和海北產(chǎn)量顯著高于浩油11號(<0.05), 綜合5地的平均產(chǎn)量, TZG18為2488.0 kg hm-2, 浩油11號為2117.3 kg hm-2, TZG18顯著增產(chǎn), 其比率達到17.5% (表4)。

表4 TZG18兩年測產(chǎn)統(tǒng)計

產(chǎn)量后的小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Values not sharing the same lowercase letter are considered statistically significant at the 0.05 probability level.

3 討論

分子標記輔助選擇(MAS)的高可靠性、高效率主要依賴于標記與候選基因緊密連鎖的程度,位點在NNDH群體中定位的置信區(qū)間為2.5 cM, 通過進一步擴大群體, 將定位于0.6 cM范圍之內(nèi), 較初定位縮小了1.9 cM, 通過區(qū)間縮小之后再選緊密連鎖標記提高了MAS選擇的可靠性。此外, 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展, 連鎖標記的選擇類型也由傳統(tǒng)標記向新型標記過度, 使得標記的特異性和準確性逐步提高。張素君等[28]選用在棉花基因組上均勻分布多態(tài)性較好的237個SSR標記對214份陸地棉材料的基因組變異進行掃描, 共檢測到695個等位變異, 發(fā)掘出與黃萎病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點27個, 推測這些穩(wěn)定存在的SSR標記位點有可能與抗病基因緊密連鎖, 為棉花黃萎病抗性材料篩選和抗病基因挖掘奠定了基礎(chǔ)。黃冰艷等[29]改良KASP分子標記檢測體系, 開發(fā)了AS-PCR-MP高油酸分子標記檢測方法, 選擇河南省大面積推廣種植的4個不同類型的花生品種為輪回親本, 定向獲得了4個穩(wěn)定高油酸改良材料24個, 拓展了高油酸花生的遺傳背景, 為快速高效改良花生油酸含量探索了新的方法。SNP標記是隨高通量測序技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運而生的一類標記, 該標記不能直接用于輔助選擇, 而需通過其變異位點或位點附近是否存在酶切位點進一步設(shè)計CAPS、SNP等類型標記[30-31]。本研究通過高通量測序手段, 發(fā)掘出候選SNP和InDel位點, 再根據(jù)變異位點設(shè)計相應(yīng)的SNP和InDel標記, 利用與早花位點緊密連鎖的標記在自然群體中的鑒定發(fā)現(xiàn), 自然資源中同時含有2個早花位點時, 開花時間早于只含有一個早花位點的資源, 說明在春性甘藍型油菜中根據(jù)早花位點開發(fā)的緊密連鎖標記G1803和IA7-4以及根據(jù)開發(fā)的緊密連鎖標記S035和SNP11可用于甘藍型春油菜早花性狀輔助選擇育種。

早花是早熟的先決條件, 早熟性狀有諸多優(yōu)點, 可以避免后期高溫逼熟, 以及在高溫條件下產(chǎn)生的一些病蟲害, 以保證產(chǎn)量。在油菜、水稻等大田作物中, 早熟品種選育是一個主要的方向, 在現(xiàn)實生產(chǎn)中早熟品種不可或缺, 如南方三季稻區(qū)的早熟水稻品種、春油菜高海拔區(qū)的早熟春油菜品種等。通常情況, 作物“高產(chǎn)”與“早熟”是一對矛盾, 早熟又高產(chǎn)品種的選育是一個巨大的挑戰(zhàn), 早熟品種產(chǎn)量一般較低, 因為光合作用產(chǎn)生碳水化合物的速率受到生育期的限制, 而產(chǎn)量較高的品種一般生育期較長[32]。目前, 從基因水平入手探索解決這一矛盾成為行之有效的辦法, 在諸多的早花基因中, 挑選一些對產(chǎn)量有利的早花基因必須具備2個條件, 一是這些早花基因沒有與產(chǎn)量相關(guān)性狀基因連鎖累贅的現(xiàn)象存在, 二是這些早花基因與一些有利基因連鎖或互作, 能增強作物光合效率或氮的高效利用, 如水稻中的早花顯性基因就同時具備這2個條件, 在一些早熟稻明星品種如Ce64、明恢77、R402中都含有該基因, 通過Ce64早熟恢復(fù)系選育的微優(yōu)64和汕優(yōu)64比其近等基因系成熟期縮短7~20 d而不減產(chǎn)[33]。在油菜中, 通過對開花時間和菌核病抗性QTL定位發(fā)現(xiàn), 兩者部分QTL有共有的置信區(qū)間, 共同的遺傳區(qū)域可能同時影響油菜的菌核病抗性和開花時間, 開花時間與菌核病抗性負相關(guān)[34-35], 因此, 在選擇早花基因或QTL聚合時選擇菌核病抗性、產(chǎn)量等性狀比較優(yōu)異的親本對品種改良具有重要的意義。本研究選擇的兩位點聚合資源3484和3164產(chǎn)量相關(guān)性狀優(yōu)良, 聚合后獲得的2個DH系產(chǎn)量相關(guān)性狀較好, 花期較其他聚合系早, 尤其DH18在角果長度、每角粒數(shù), 千粒重、全株角果數(shù)等4個性狀上都顯著優(yōu)于其他聚合DH系, 表明通過花期位點聚合不僅能創(chuàng)建更早花資源, 也可能將親本有利的產(chǎn)量相關(guān)基因進行聚合。當然, 在此過程中, 是否與抗菌核病、抗倒伏等性狀相關(guān)基因有連鎖累贅或聚合后非等位基因之間是否存在互作等還需進一步研究。

在青藏高原腦山地區(qū), 油菜是最主要的經(jīng)濟作物, 由于氣候冷涼, 無霜期較短, 只能種植一些生育期較短的白菜型油菜, 俗稱“小油菜”, 而浩油11號是該地區(qū)主栽的白菜型油菜品種之一, 年種植面積約30萬畝, 如果能選育出特早熟甘藍型油菜來替代白菜型油菜, 產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)量將大幅提高。為將篩選到的資源快速應(yīng)用到育種進程中, 本研究利用青海省農(nóng)林科學(xué)院通過回交轉(zhuǎn)育選育的一個特早熟波里馬細胞質(zhì)雄性不育系025A與DH18配置組合, 對DH18優(yōu)勢潛力進行分析, 并將該組合定名為TZG18, 產(chǎn)量較白菜型油菜增產(chǎn)顯著。通過進一步分析發(fā)現(xiàn), TZG18芥酸含量為0.58%, 硫甙含量為28.62 μmol g-1, 品質(zhì)達到“雙低”, 含油量44.62%。除產(chǎn)量和品質(zhì)外, 生育期是早熟育種的關(guān)鍵, 浩油11號在門源沙溝梁、門源后院、湟源、同德、貴南牧場、海北等6個地區(qū)全生育期在125 d左右, 而TZG18在130 d左右, 基本屬同期成熟。因此, 在今后推廣中, TZG18將有可能大面積替代浩油11號。本研究是甘藍型春油菜早花性狀MAS育種的初步探索, 將MAS技術(shù)與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合, 應(yīng)用于基因聚合等方面, 能夠加快育種研究的進程, 縮短育種年限。本研究為培育高海拔地區(qū)的特早熟甘藍型春油菜品種提供了材料支持, 也為基因聚合育種技術(shù)提供了新途徑。未來應(yīng)將實驗室研究與大田生產(chǎn)相結(jié)合, 利用多種優(yōu)良基因相互聚合, 保留優(yōu)異的種質(zhì)資源, 將基因聚合帶來的社會效益和經(jīng)濟效益最大化。

4 結(jié)論

早花位點被定位于SNP11和SNP12區(qū)間中, 解釋表型變異的34%。通過進一步加密, 將原來區(qū)間距離2.5 cM縮小到0.6 cM, 且與SNP11共分離; 93個自然資源被4個標記分為AA和BB 2種基因型, 同時包含兩早花位點株系比只含有一個早花位點株系早開花; 通過兩早花位點聚合獲得7個聚合DH系, 這些DH系比其親本提前開花2~3 d, 在7個聚合DH系中, DH18產(chǎn)量相關(guān)性狀最優(yōu), 初花期最早, 進一步利用DH18與波里馬細胞質(zhì)雄性不育系025A配置組合, 并定名為TZG18, 連續(xù)2年多地測產(chǎn)分析得出, TZG18比高海拔白菜型油菜主栽品種浩油11號增產(chǎn)17.5%以上。說明早花位點聚合品系比早花單位點品系在開花時間上有著明顯的優(yōu)勢, 同時對增加油菜產(chǎn)量也有著很大影響。

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Locus encryption for early flowering and QTL polymerization to create excellent early flowering resources of springs L.

LIU Hai-Dong**, PAN Yun-Long**, andDU De-Zhi*

Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Qinghai University / Qinghai Spring Rape Engineering Research Center / Spring Rape Scientific Observation Experimental Station of Ministry of Agriculture and Rural Areas / Qinghai Research Branch of the National Rapeseed Genetic Improvement Center / Key Laboratory of Qinghai Province for Spring Rapeseed Genetic Improvement, Xining 810016, Qinghai, China

and, two major effects of early flowering QTL, were identified in the NNDH population of spring, and closely linked markers SSR G1803, InDel IA7-4, and SSR S035 withdeveloped in previous studies. In this study, a BC2F2population for early flowering QTL locuswas constructed, and a closely linked SNP marker was further developed. The early flowering genotypes of one natural resources contained 93 springvarieties were identified used four closely linked markers with two loci, and selected 3164 and 2216 resources withsite, 3484 and 2857 resources withsite. Two site resources were aggregated by site polymerization through reciprocal hybridization. The polymerized DH system was rapidly obtained by microspore culture and maker assisted selection. A hybrid combination was created between polymeric line with good traits and early flowers and the Polima CMS, and the utilization value of the polymeric line was further analyzed by the production test at multiple environments for two consecutive years.encryption results showed that this site was located in the SNP11 and SNP12 interval, and separated from SNP11 altogether. The identification results of early flowering genotypes of natural resources showed that there were 50 individuals containinglocus, with an average initial flowering period of 58.1 days; 16 single plants containinglocus, with an average flowering period of 58.3 days; and 16 single plants containing two loci, with an average flowering period of 55.2 days, indicating the more early flowering sites containing, the earlier flowering. The results of polymerization showed that the flowering time of the polymerized lines ofandwas 2–3 days earlier than that of the single locus parents, among which the polymerized DH18 from 3164 ofand 3484 ofwas 3 days earlier than that of the parents, and the yield-related traits were better than those of other lines. The combination of DH18 and the Polima CMS 025A was further utilized, and the combination was named TZG18. Yield results of two years and nine environments showed that yield of TZG18 was above 17.5% higher than the Haoyou 11, a localvariety on the Qinghai-Tibet plateau. Those results indicated that the early flowering site polymeric lines had an obvious advantage over the single locus lines in flowering time, and had an effect on the increasement of rapeseed yield. This study is a preliminary exploration of MAS breeding for early flowering traits of, providing materials support for replacingvarieties using early maturityvarieties in spring rapeseed region, and approaches for gene polymerization breeding technology.

spring; early flowering locus; gene pyramiding; early flowering resources

10.3724/SP.J.1006.2020.04012

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0100501), 國家自然科學(xué)基金項目(31760395),國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-12), 青海省重點研發(fā)與轉(zhuǎn)化計劃項目(2018-NK-C07), 青海省春油菜遺傳改良重點實驗室(2017-ZJ-Y09)和青海省農(nóng)林科學(xué)院科研專項(2018-NKY-011)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Plan (2018YFD0100501), the National Natural Science Foundation ofChina (31760395), the China Agriculture Research System (CARS-12), the Key Research and Development and Transformation Project of Qinghai Province (2018-NK-C07), the Laboratory of Spring Rape Genetic Improvement of Qinghai Province (2017-ZJ-Y09), and the Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences Research Project (2018-NKY-011).

杜德志, E-mail: qhurape@126.com, Tel: 0971-5366520

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

柳海東, E-mail: dahaima@163.com; 潘云龍, E-mail: pylscorpio@126.com

2020-01-15;

2020-06-02;

2020-06-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200615.1336.002.html