吳海濤 張 勇 蘇伯鴻 Lamlom F Sobhi 邱麗娟

大豆分枝數(shù)相關(guān)分子標記開發(fā)及位點精細定位

吳海濤1,3,**張 勇2,**蘇伯鴻1,3,**Lamlom F Sobhi3,4邱麗娟3,*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030;2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院, 黑龍江齊齊哈爾 161606;3農(nóng)作物基因資源與遺傳改良國家重大科學(xué)工程/ 農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源利用重點實驗室 / 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;4埃及亞歷山大大學(xué)農(nóng)業(yè)學(xué)院Saba Basha植物生產(chǎn)部, 埃及亞歷山大市

分枝數(shù)是影響大豆產(chǎn)量的重要因素之一, 與植株結(jié)莢率直接相關(guān); 同時也是決定大豆株型的重要組成因子, 并通過調(diào)節(jié)群體結(jié)構(gòu)、種植密度等進一步影響產(chǎn)量。目前關(guān)于大豆分枝數(shù)QTL (quantitative trait loci)精細定位與圖位克隆的報道極少。因此, 發(fā)掘參與調(diào)控大豆分枝的基因/QTL對于株型建成的基礎(chǔ)研究和高產(chǎn)品種培育的應(yīng)用研究都具有重要意義。本研究在少分枝品種墾豐19 (KF19)與多分枝品種墾農(nóng)24 (KN24)組合F2的基礎(chǔ)上, 培育出由606個株系組成的F7:8重組自交系(recombinant inbred lines, RIL)群體, 以及由1486個單株KF19-BC3F2和1150個單株KN24-BC2F2組成的2個回交群體。在18號染色體分枝數(shù)QTL新位點()的定位區(qū)間內(nèi)篩選出多態(tài)性SSR標記11個, 利用RIL群體將的定位區(qū)間由1.6 Mb縮小到113 kb。在定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)了2個InDel標記BR69與BR77。進一步利用回交群體篩選交換單株, 將定位區(qū)間縮小到63.7 kb, 包括9個基因。本研究結(jié)果為大豆分枝數(shù)的基因圖位克隆及分子標記輔助育種創(chuàng)造了條件。

大豆; 分枝數(shù); QTL定位; 候選基因

大豆是世界重要的糧食和經(jīng)濟作物, 是人類植物脂肪和蛋白質(zhì)的重要來源, 在日常膳食結(jié)構(gòu)中占有重要地位。目前大豆和其他高產(chǎn)作物相比, 相對產(chǎn)量偏低, 提高大豆產(chǎn)量潛力是大豆育種的重要任務(wù)[1]。分枝數(shù)與大豆產(chǎn)量密切相關(guān), 是構(gòu)成大豆產(chǎn)量的重要因子[2]。分枝數(shù)影響植株結(jié)實數(shù)與群體通風(fēng)透光狀況, 進而影響植株對光能的利用, 還可以通過改善株型、調(diào)整大豆群體結(jié)構(gòu)間接影響大豆產(chǎn)量[3-4]。同時, 大豆分枝發(fā)育對出苗不齊起到補償作用, 分枝上種子產(chǎn)量的提高, 可以有效彌補單位土地面積主莖種子產(chǎn)量下降引起的損失, 從而補充了群體的產(chǎn)量[5-6]。因此發(fā)掘調(diào)控大豆分枝發(fā)育的相關(guān)基因?qū)τ谂嘤弋a(chǎn)大豆品種具有重要意義。

大豆分枝數(shù)由多基因調(diào)控, 分枝的發(fā)生受遺傳因子、激素和環(huán)境等多種因素的影響[7]。迄今為止, 利用大豆的F2群體與重組自交系群體定位了數(shù)十個大豆分枝數(shù)相關(guān)QTL[8-21]。其中在SoyBase (https:// www.soybase.org)中已列出21個分枝數(shù)QTL[9,18-19,21]。這些QTL大多分布在10個染色體上, 包括4號、5號、6號、10號、11號、14號、15號、17號、18號和19號染色體。其中在不同世代中表現(xiàn)穩(wěn)定的QTL有11個[13-14,16-17]。在不同環(huán)境中檢測到2個穩(wěn)定QTL[15]。雖然定位的大豆分枝數(shù)QTL比較多, 但分枝相關(guān)基因研究的報道較少, 譚冰等[22]通過Blastp分析183個植物分枝相關(guān)基因的氨基酸序列, 在大豆基因組中獲得406個同源基因, 經(jīng)過共定位分析有57個基因位于20個QTL區(qū)間內(nèi), 其中2個基因位于多次被檢測到的QTL區(qū)間, 即COBL1的2個同源基因(和)定位在標記Satt294~Satt399之間。Sangrea等[21]對400份大豆品種進行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)分析, 并通過少分枝品種Jiyu 69和多分枝品種SS0404-T5-76雜交構(gòu)建近等基因系群體進行精細定位, 將分枝數(shù)QTL ()精細定位到6號染色體的460 kb區(qū)間內(nèi), 包含13個候選基因, 結(jié)合表達分析和基因序列分析推測,()可能是調(diào)控大豆分枝發(fā)育的候選基因。

本研究以前期定位在18號染色體的分枝數(shù)QTL新位點為基礎(chǔ), 以構(gòu)建的RIL群體和回交群體為材料, 通過鑒定F7:8群體基因型將的定位區(qū)間由1.6 Mb縮小到113 kb, 并利用回交群體篩選交換單株將其精細定位在63.7 kb區(qū)間內(nèi)。為大豆分枝數(shù)基因克隆、調(diào)控機制解析和分子標記選擇奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 定位群體構(gòu)建及表型調(diào)查

在張霞等[20]以少分枝大豆品種墾豐19 (KF19)和多分枝大豆品種墾農(nóng)24 (KN24)構(gòu)建的F2群體基礎(chǔ)上, 本研究通過單粒傳培育出由606個家系組成的F7:8重組自交系。以KN24為輪回親本, 與KN24和KF19的F1植株回交2次, 獲得17個BC2F1單株, 自交獲得BC2F2群體, 共1150個單株。同時, 以KF19為輪回親本回交3次獲得42個BC3F1單株, 自交獲得BC3F2群體, 共1486個單株。在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院試驗站種植2個親本、RIL群體和回交群體。行長3 m, 行距0.4 m, 株距0.1 m。田間按常規(guī)管理, 大豆植株成熟后, 去除邊緣單株, 參照《大豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[23]考種。分枝數(shù)為每個植株主莖上的有效分枝數(shù), 分枝上有2個或多個節(jié), 收獲時至少有1個成熟的種子莢。2018年與2019年親本分別考種25株與35株。F7群體每行考種4個單株, F7:8群體每行考種8個單株。采集F7單株葉片, 干冰冷凍后保存在-80℃冰箱備用。

1.2 大豆基因組DNA提取

利用改良的CTAB法提取大豆基因組DNA。取大約100 mg的大豆葉片或組織, 加入2.0 mL離心管中, 到每孔裝有一顆5 mm鋼珠, 在液氮中迅速冷凍, 放在高通量組織研磨機中打樣30 s; 取出后每管加入600 μL CTAB溶液和5 μL RNase A (10 mg mL-1)并振蕩混勻5 min; 65℃水浴鍋中水浴1 h, 每隔10 min顛倒混勻1次; 水浴完成后加入600 μL酚/氯仿, 輕輕混勻10 min再室溫靜置10 min, 12,000′離心10 min, 吸取上清; 加入等體積氯仿, 輕輕混勻10 min再室溫靜置10 min, 12,000′離心10 min, 吸取上清; 加入等體積異丙醇,-20℃靜置1 h或過夜; 再12,000′離心10 min, 棄上清; 用75%乙醇洗滌2次, 12,000′離心后棄上清并進行甩干, 用移液器吸除管底殘留的乙醇; 風(fēng)干20 min后加入100 μL滅菌的蒸餾水溶解DNA, 使用NanoDrop 2000/ 2000c超微量分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA濃度和質(zhì)量。

1.3 分子標記的選擇及分析

從SoyBase數(shù)據(jù)庫(https://soybase.org/)中選擇位于大豆18號染色體定位區(qū)間內(nèi)的55對SSR標記, 由博邁德生物技術(shù)有限公司合成, 用KN24和KF19進行多態(tài)性引物篩選(表1)。PCR總反應(yīng)體系為20 μL, 包括10×Easybuffer 2.0 μL、2.5 mmol L-1dNTPs 1.5 μL、無菌水12.3 μL、Easy酶0.2 μL、引物(2 μmol L-1) 2.0 μL和DNA (70 ng μL-1) 2.0 μL。反應(yīng)程序為95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 34個循環(huán); 72℃ 5 min, 4℃保存。用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SSR標記的擴增產(chǎn)物。

表1 精細定位所用分子標記

1.4 InDel標記開發(fā)與鑒定

根據(jù)親本定位區(qū)間隨機測序發(fā)現(xiàn), 55,882,277與55,946,270位點分別存在1個InDel標記, 從Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載含InDel變異位點的序列, 利用Primer3web (http://primer3.ut.ee/)網(wǎng)站分別設(shè)計包含InDel的標記BR69與BR77的引物(表2)。為檢測2個標記的靈敏度, 用特異引物擴增12個不同濃度的KN24與KF19, DNA濃度分別為100、80、60、40、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng μL-1。PCR總反應(yīng)體系為20 μL, 包括10×Easybuffer 2.0 μL、2.5 mmol L-1dNTPs 1.5 μL、無菌水12.3 μL、Easy酶0.2 μL、引物(2 μmol L-1) 2.0 μL和DNA 2.0 μL。反應(yīng)程序為95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 54℃ 30 s, 72℃ 30 s, 36個循環(huán); 72℃ 5 min, 4℃保存。用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測InDel標記的擴增產(chǎn)物。篩選最適DNA濃度用于鑒定RIL群體基因型。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2016計算KF19與KN24分枝數(shù)的平均值與標準差, 利用SAS9.4軟件進行單因素方差分析, 利用ggplot2 (R語言程序包)中的vioplot程序分析定位區(qū)間內(nèi)InDel標記BR69與BR77各個基因型對應(yīng)的分枝數(shù)分布。

1.6 分枝數(shù)QTL定位及驗證

利用軟件QTL IciMapping V4.1[24]完備區(qū)間作圖(inclusive composite interval mapping, ICIM)法對分枝數(shù)進行QTL定位, 經(jīng)1000次排列確定LOD閾值, 當實際求得的LOD值大于LOD閾值時, 就認為該區(qū)段存在1個QTL。

1.7 候選基因預(yù)測

根據(jù)定位區(qū)間物理位置查詢SoyBase (https:// www.soybase.org/)獲得基因注釋。使用Phytozome v12.1獲得的定位區(qū)間內(nèi)基因的表達模式, 使用Sangerbox生成熱圖。

表2 兩個InDel標記的位置、引物序列及預(yù)期擴增片段長度

2 結(jié)果與分析

2.1 KN24和KF19及其群體分枝數(shù)表型分析

KF19為少分枝材料, KN24為多分枝材料(圖1-A)。2018年和2019年KF19平均分枝數(shù)分別為0.5和0.7, KN24平均分枝數(shù)分別為5.5和6.8 (表3)。KF19和KN24的分枝數(shù)性狀存在極顯著差異, 并且在不同年份間表型穩(wěn)定, 表明KF19和KN24分別為穩(wěn)定的多分枝和少分枝品種, 適合作為大豆分枝數(shù)QTL定位群體的親本。KF19×KN24的群體F7和F7:8均有606個株系, 分枝數(shù)的變異范圍為0~10個, 多分枝特性存在超親現(xiàn)象。F7、F7:8與回交群體F2(KN24-BC2F2、KF19-BC3F2)的分枝數(shù)均呈連續(xù)性變異, 符合正態(tài)分布(圖1)。表明分枝數(shù)性狀是典型的多基因控制的數(shù)量性狀。

表3 2018年、2019年KF19和KN24及其F7、F7:8群體的分枝數(shù)(BN)統(tǒng)計分析

(圖1)

A: 親本植株; B~C: 分別為2018年與2019年KN24與KF19分枝數(shù)表型; D~E: 分別為F7與F7:8分枝數(shù)頻率分布直方圖; F: 2018年回交群體F2分枝數(shù)頻率分布直方圖。垂直虛線表示兩親本表型的平均值和標準差。曲線代表密度圖。***:<0.001。

A: parent plant; B–C: KN24 and KF19 branch number phenotypes in 2018 and 2019, respectively; D–E: histogram of frequency distribution of F7and F7:8branch numbers, respectively; F: histogram of the frequency distribution of branch number F2in the backcross population in 2018. Mean value and standard deviation of parental phenotypes are indicated by vertical dotted lines. Curve represents density plot. ***:< 0.001.

2.2 用RIL群體精細定位分枝數(shù)相關(guān)QTL

張霞等[20]利用墾豐19和墾農(nóng)24雜交構(gòu)建的F2群體定位到2個分枝數(shù)相關(guān)QTL, 分別位于6號和18號染色體上, 其中18號染色體QTL位點()介于標記BARCSOYSSR_18_1777和BARCSOYSSR_18_ 1858之間, 約1.6 Mb, 解釋8.0%的遺傳變異, 是一個新的QTL位點。為了精細定位, 將墾豐19和墾農(nóng)24的F2構(gòu)建成1個由606個株系組成的F7:8重組自交系群體。在標記BARCSOYSSR_18_1777和BARCSOYSSR_18_1858之間選擇55個SSR標記分析2個親本發(fā)現(xiàn), 多態(tài)性的SSR標記共有14個。根據(jù)物理位置選擇均勻分布的11個SSR標記鑒定群體基因型, 利用QTL IciMapping 4.1軟件繪制遺傳連鎖圖譜并定位QTL (臨界閾值LOD=2.5)(圖2), 獲得了一個LOD值為19.33的分枝數(shù)QTL (表4), 將的定位區(qū)間由1.6 Mb縮小至113 kb位于標記BARCSOYSSR_18_1834與BARCSOYSSR_18_1841之間, 解釋14.24%的遺傳變異, 區(qū)間內(nèi)包含14個基因。

圖2 用墾豐19和墾農(nóng)24構(gòu)成的RIL群體在大豆18號染色體定位分枝數(shù)QTLqBN-18

表4 KF19×KN24的F7:8群體中鑒定到的分枝數(shù)QTL

2.3 InDel標記開發(fā)與鑒定

2.3.1 InDel標記開發(fā)與靈敏度檢測 在定位區(qū)間內(nèi)基因間隔區(qū)隨機測定KF19與KN24 2個親本序列, 在55,882,277與55,946,270位點分別發(fā)現(xiàn)1個InDel位點, 在兩親本間分別有6個、12個堿基的差異, 從Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal. html)下載含InDel變異位點的序列, 利用Primer3web網(wǎng)站設(shè)計BR69與BR77的特異擴增引物(表2)。BR69位于基因的上游, 其物理位置與標記BARCSOYSSR_18_1834相距4.5 kb, 與標記BARCSOYSSR_18_1841相距108.5 kb。BR77位于基因的下游, 其物理位置與標記BARCSOYSSR_18_1834相距68.3 kb, 與標記BARCSOYSSR_18_1841相距44.7 kb。BR69與BR77相距63.7 kb。

為了鑒定所開發(fā)的InDel標記的實用性, 設(shè)置了12個DNA濃度檢測BR69與BR77的靈敏度。BR69在DNA≥2 ng的8個濃度時均可以擴增出兩親本目標條帶, 且兩親本間差異明顯。在DNA≤1 ng的4個濃度時兩親本均出現(xiàn)雜帶, 特異性差。BR77在DNA≥5 ng的7個濃度時均可以擴增出兩親本目標條帶, 且兩親本間差異明顯, 在DNA≤2 ng的5個濃度時條帶不清晰。表明BR69和BR77 2個標記在親本DNA濃度為5~100 ng μL-1之間均擴增出清晰條帶, 可用于群體基因型鑒定。

2.3.2 RIL群體基因型鑒定 用2個InDel標記BR69與BR77鑒定RIL群體基因型。在BR69位點, 多分枝基因型(aa)有290個株系, 平均分枝數(shù)為5.22; 少分枝基因型(bb)有274個株系, 平均分枝數(shù)為3.80。在BR77位點, 多分枝基因型(aa)有271個株系, 平均分枝數(shù)為5.22; 少分枝基因型(bb)有259個株系, 平均分枝數(shù)為3.85 (圖3)。表明2個標記與分枝數(shù)緊密連鎖, 可用于分枝數(shù)改良的標記輔助育種。

圖3 RIL群體中標記BR69與BR77的基因型與表型相關(guān)性分析

A: BR69的基因型與表型相關(guān)性分析; B: BR77的基因型與表型相關(guān)性分析。圖中橫坐標為基因型, 多分枝記為a, 少分枝記為b, 縱坐標為分枝數(shù)。***< 0.001。

A: correlation analysis between genotype and phenotype of BR69; B: correlation analysis between genotype and phenotype of BR77. The abscissa is the genotype, the multiple branches are denoted as a, the few branches are denoted as b, and the vertical ordinate is the number of branches. ***< 0.001.

2.4 利用回交群體驗證定位結(jié)果

為了進一步驗證和縮小定位區(qū)間, 分別以兩親本為輪回親本構(gòu)建了2個回交群體KN24-BC2F2與KF19-BC3F2, 用兩側(cè)標記BARCSOYSSR_ 18_1777與BARCSOYSSR_18_1875鑒定1150株KN24-BC2F2與1486株KF19-BC3F2的基因型, 篩選出在2個標記間基因型不同的單株有568株。然后用4個SSR標記BARCSOYSSR_18_1791、BARCSOYSSR_ 18_1803、BARCSOYSSR_18_1827與BARCSOYSSR_ 18_1856鑒定2個標記之間的重組單株, 其中, 在BARCSOYSSR_18_1827與BARCSOYSSR_18_1856之間發(fā)生交換的單株有225個。然后用7個SSR標記BARCSOYSSR_ 18_1825、BARCSOYSSR_18_1831、BARCSOYSSR_ 18_1832、BARCSOYSSR_18_1834、BARCSOYSSR_ 18_1841、BARCSOYSSR_18_1847、BARCSOYSSR_ 18_1852與2個InDel標記BR69、BR77鑒定篩選出來的225個重組單株, 結(jié)合表型分析, 最終將由BARCSOYSSR_18_1777與BARCSOYSSR_ 18_1875之間的1.6 Mb縮小到BR69與BR77之間, 約為63.7 kb (圖4)。

2.5 候選基因預(yù)測

根據(jù)定位區(qū)間物理位置查詢SoyBase (https:// www.soybase.org/)發(fā)現(xiàn), 定位區(qū)間內(nèi)共有9個假定基因, 其中6個基因在SoyBase有基因注釋(表5)。從Phytozome v12.1獲得這9個基因的表達模式, 用Sangerbox生成熱圖(圖5),在豆莢、種子與花中有表達。與在豆莢、根、種子、莖、葉、莖頂端分生組織(shoot apical meristem, SAM)、花、節(jié)、根毛9個組織中均有表達。在根、節(jié)、根毛中有表達。在根中有表達。與在各組織中均無表達。在豆莢、根、莖、花、節(jié)、根毛中有表達。在根、莖、莖頂端分生組織、花、節(jié)、根毛中有表達。

圖4 qBN-18位點的驗證

A:利用KF19-BC3F2的1486個單株和KN24-BC2F2的1150個單株鑒定了標記BARCSOYSSR_18_1777和BARCSOYSSR_18_1875之間的位點; B:利用BARCSOYSSR_18_1791、BARCSOYSSR_18_1803、BARCSOYSSR_18_1827與BARCSOYSSR_18_1856 4個標記鑒定BARCSOYSSR_18_1777和BARCSOYSSR_18_1875之間的568個重組單株; C:位于標記BR69與標記BR77之間。H: 雜合基因型。

A:loci between marker BARCSOYSSR_18_1777 and BARCSOYSSR_18_1875 was identified using 1486 individuals of KF19-BC3F2and 1150 individuals of KN24-BC2F2; B: BARCSOYSSR_18_1791, BARCSOYSSR_18_1803, BARCSOYSSR_18_1827 and BARCSOYSSR_18_1856 were used to identify 568 recombinant strains between BARCSOYSSR_18_1777 and BARCSOYSSR_18_1875; C:is located between tag BR69 and tag BR77. H: heterozygous genotype.

植物的分枝是由莖頂端分生組織衍生出的腋生分生組織分化來的, 因此初步確定在莖頂端分生組織有表達的3個基因、、可能與分枝數(shù)相關(guān)。

表5 定位區(qū)間內(nèi)基因的同源基因及基因注釋

圖5 用Phytozome v12.1獲得9個基因的表達譜

3 討論

3.1 RIL群體與回交群體共同定位的優(yōu)勢

QTL定位所用的群體有F2、重組自交系(recombinant inbred lines, RILs)、回交重組自交系(backcross inbred lines, BILs)或雙單倍體系(double inbred lines, DHLs), 以及基于多個分子標記生成的連鎖圖譜[25]。由于QTL分析是建立在統(tǒng)計計算的基礎(chǔ)上的, 即使使用大量的群體和許多遺傳標記, 也很難確定單個QTL的精確位置, 因此, 精細定位需要其他群體[26]。F2群體為暫時性分離群體, 與RIL群體相比, 其株系內(nèi)基因型還未達到純合, 因此不能永久使用[27]?；亟粚?dǎo)入系是通過與一個親本多代回交, 并結(jié)合系統(tǒng)的標記輔助選擇(molecular marker-assisted selection, MAS)產(chǎn)生的。在獨特的基因組背景下包含少量供體片段(或QTL)的導(dǎo)入, 有助于對目標QTL進行全面分析, 可以評估QTL在輪回親本基因組背景下的作用[26]。而且回交群體家系間的遺傳背景相似, 供體背景對目標性狀QTL效應(yīng)檢測的影響較小, QTL檢測更為準確[28]。目前大豆分枝數(shù)QTL定位所使用的群體多為F2與RIL群體[8-21]。本研究在利用F2群體進行初定位的基礎(chǔ)上, 通過鑒定RIL群體基因型進行精細定位, 用2個回交群體驗證定位結(jié)果, 經(jīng)過多重驗證, 定位結(jié)果可信度更高。

3.2 大豆分枝數(shù)QTL精細定位

大豆分枝數(shù)是由多基因控制的數(shù)量性狀[29], 不僅與產(chǎn)量關(guān)系密切, 同時也是影響大豆株型的重要因子, 定位并克隆分枝發(fā)育相關(guān)基因?qū)ε嘤弋a(chǎn)大豆新品種具有重要意義。然而, 大豆分枝數(shù)的QTL定位研究尚處于起步階段[22]。雖然已經(jīng)定位的大豆分枝數(shù)QTL較多[8-21]。但精細定位僅有1例, Sangrea等[21]利用近等基因系將6號染色體上的分枝數(shù)位點精細定位到的460 kb區(qū)間內(nèi)。

本研究是在張霞等[20]定位分枝數(shù)的新QTL基礎(chǔ)上, 用11個SSR標記鑒定KN24×KF19 F7:8, 將定位區(qū)間縮小到113 kb, 解釋14.24%的遺傳變異; 并用回交群體將定位區(qū)間進一步縮小至63.7 kb, 包含9個基因。該位點尚未見相關(guān)報道。因此, 本研究精細定位在18號染色體的大豆分枝數(shù)QTL是迄今為止定位區(qū)間小、包含候選基因少的QTL, 為該位點的圖位克隆提供了重要信息, 也為分子標記選擇分枝數(shù)創(chuàng)造了條件。

3.3 大豆分枝數(shù)候選基因

植物的分枝是由莖頂端分生組織衍生出的腋生分生組織分化來的, 腋芽形成后可能發(fā)育形成分枝, 也可能一直保持休眠狀態(tài)直到生長被激活[30]。腋芽的生長受基因、激素、發(fā)育狀況和環(huán)境等多種因素的影響, 各因素的相互作用共同決定腋芽處于休眠狀態(tài)還是繼續(xù)發(fā)育[31]。植物的頂端優(yōu)勢會抑制側(cè)芽的生長。由于生長素是在莖頂端合成的, 它被植物的下半部分所吸收, 抑制了分枝的生長, 所以去掉莖頂端后可以消除頂端優(yōu)勢, 促進一個或多個腋芽的生長[32]?？紤]到莖頂端分生組織與分枝的發(fā)育有關(guān), 用Phytozome v12.1獲得的定位區(qū)間內(nèi)9個基因的表達模式, 使用Sangerbox生成熱圖。其中有3個基因、、在莖頂端分生組織中有表達, 這些基因在本研究群體中的表達情況還有待檢測。

根據(jù)SoyBase (https://www.soybase.org/)提供的信息對區(qū)間內(nèi)基因進行注釋(表5), 其中是一個WPP蛋白家族基因, WPP蛋白家族表達的減少導(dǎo)致擬南芥根系有絲分裂活性降低, 導(dǎo)致根長縮短, 側(cè)根數(shù)量減少[33]。是一個bZIP (basic leucine zipper)家族基因。bZIP TFs是一個高度保守家族, 調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中的多種現(xiàn)象, 并參與脅迫反應(yīng)和激素信號傳導(dǎo)[34]。許多真核生物(包括酵母、動物和植物)的基因組已經(jīng)鑒定或預(yù)測到了bZIP TFs家族成員[35-37]。在正常條件下, bZIP TFs參與各種生物過程。例如, 它們在器官和組織分化[38]、細胞伸長[39]和體細胞胚發(fā)生[40]中起重要作用。它們還在響應(yīng)各種生物/非生物脅迫和信號(如激素和糖信號)方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用, 如光反應(yīng)[41]和滲透脅迫[42]。是一個6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)蛋白家族基因。磷酸戊糖途徑(PPP)對于植物代謝至關(guān)重要[43], 在PPP的氧化部分中, 葡萄糖-6-P脫氫酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)催化葡萄糖-6-P的不可逆氧化, 產(chǎn)生兩分子NADPH和一分子CO2。Gertraud等[44]在玉米葉綠體中定位到了氧化戊糖磷酸途徑中6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)功能缺失的2個等位基因, 這些突變導(dǎo)致胚乳種子表型粗糙, 胚乳油和胚乳淀粉減少。目前定位區(qū)間內(nèi)的基因尚無與分枝數(shù)相關(guān)的報道, 因此候選基因的選擇還有待于進一步的鑒定和驗證。

4 結(jié)論

利用11個SSR標記鑒定到1個由606個株系組成的KF19×KN24F7:8RIL群體基因型并構(gòu)建遺傳圖譜, 在18號染色體精細定位到1個大豆分枝數(shù)相關(guān)QTL, 位于標記BARCSOYSSR_18_1834與BARCSOYSSR_18_1841之間, 解釋14.24%的遺傳變異。通過開發(fā)BR69和BR77 2個InDel標記, 結(jié)合回交群體, 將區(qū)間從113 kb縮小至63.7 kb。本研究結(jié)果為大豆分枝數(shù)的基因克隆及分子標記輔助育種創(chuàng)造了條件。

[1] 黃中文, 趙團結(jié), 喻德躍, 陳受宜, 蓋鈞鎰. 大豆產(chǎn)量有關(guān)性狀QTL的檢測. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42: 4155–4165. Huang Z W, Zhao T J, Yu D Y, Chen S Y, Gai J Y. Detection of QTLs of yield related traits in soybean., 2009, 42: 4155–4165 (in Chinese with English abstract).

[2] 劉金剛, 孫恩玉, 曹永強, 劉艷輝, 劉鳳麗. 大豆主要生育性狀與產(chǎn)量間的關(guān)系分析. 雜糧作物, 2005, 25(2): 81–83. Liu J G, Sun E Y, Cao Y Q, Liu Y H, Liu F L. Correlation analysis of the major breeding traits and yield of soybean., 2005, 25(2): 81–83 (in Chinese with English abstract).

[3] 胡珀, 韓天富. 植物莖稈性狀形成與發(fā)育的分子基礎(chǔ). 植物學(xué)通報, 2008, 25(1): 1–13. Hu B, Han T F. Molecular basis of stem trait formation and development in plants., 2008, 25(1): 1–13 (in Chinese with English abstract).

[4] 張永強, 張娜, 王娜, 唐江華, 徐文修, 李亞杰. 種植密度對夏大豆光合特性及產(chǎn)量構(gòu)成的影響. 核農(nóng)學(xué)報, 2015, 29: 1386–1391. Zhang Y Q, Zhang N, Wang N, Tang J H, Xu W X, Li Y J. Effects of plant population on photosynthetic characteristics and yield components of summer soybean., 2015, 29: 1386–1391 (in Chinese with English abstract).

[5] 董鉆, 孫卓韜. 大豆株型、群體結(jié)構(gòu)與產(chǎn)量關(guān)系的研究, 第一報: 大豆群體的自動調(diào)節(jié)和群體內(nèi)光強、CO2的分布. 大豆科學(xué), 1984, 3(2): 110–119. Dong Z, Sun Z T. Research on the relation of soybean plant form, group structure and output I. The automatic regulation of soybean group and the distribution of light intensity and CO2., 1984, 3(2): 110–119 (in Chinese).

[6] Agudamu, Yoshihira T, Shiraiwa T.Branch development responses to planting density and yield stability in soybean cultivars., 2016, 19: 331–339.

[7] Beveridge C A. Axillary bud outgrowth: sending a message., 2006, 9: 35–40.

[8] 關(guān)榮霞. 大豆重要農(nóng)藝性狀的QTL定位及中國大豆與日本大豆的遺傳多樣性分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后研究工作報告, 北京, 2004. Guan R X. QTL Mapping of Soybean Agronomic Characters and Genetic Diversity Analysis of Soybean Cultivars from China and Japan. Post Doctoral Working Repor of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2004 (in Chinese with English abstract).

[9] 陳慶山, 張忠臣, 劉春燕, 辛大偉, 單大鵬, 邱紅梅, 單彩云. 大豆主要農(nóng)藝性狀的QTL分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 40: 41–47. Chen Q S, Zhang Z C, Liu C Y, Xin D W, Shan D P, Qiu H M, Shan C Y. QTL analysis of major agronomic traits in soybean., 2007, 40: 41–47 (in Chinese with English abstract).

[10] 王珍. 大豆SSR遺傳圖譜構(gòu)建及重要農(nóng)藝性狀QTL分析. 廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文, 廣西南寧, 2004. Wang Z. Construction of Soybean SSR Based Map and QTL Analysis of Important Agronomic Traits. MS Thesis of Guangxi University, Nanning, Guangxi, China, 2004 (in Chinese with English abstract).

[11] 位艷麗. 大豆農(nóng)藝和品質(zhì)性狀遺傳模型分析與QTL定位. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 河南鄭州, 2011. Wei Y L. Genetic Model Analysis and QTL Mapping of Agronomic and Quality Traits in Soybean. MS Thesis of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan, China, 2011 (in Chinese with English abstract).

[12] 梁慧珍, 余永亮, 楊紅旗, 張海洋, 董薇, 李彩云. 大豆產(chǎn)量及主要農(nóng)藝性狀QTL的上位性互作和環(huán)境互作分析. 作物學(xué)報, 2014, 40: 37–44. Liang H Z, Yu Y L, Yang H Q, Zhang H Y, Dong W, Li C Y. Epistatic effects and QTL × environment interaction effects of QTLs for yield and agronomic traits in soybean., 2014, 40: 37–44 (in Chinese with English abstract).

[13] 何冉, 關(guān)榮霞, 劉章雄, 朱曉麗, 常汝鎮(zhèn), 邱麗娟. 用分離群體中的殘余雜合系定位大豆C1連鎖群的分枝數(shù)位點. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42: 1152–1157.He R, Guan R X, Liu Z X, Zhu X L, Chang R Z, Qiu L J. Mapping thelocus to LG C1 for soybean branching using residual heterozygous lines derived from a segregation population., 2009, 42: 1152–1157 (in Chinese with English abstract).

[14] 程立國. 大豆遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀的QTL定位.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 江蘇南京, 2008. Cheng L G. Construction of Genetic Linkage Map and QTL Mapping of Important Traits in Soybean [(L.) Merrill]. MS Thesis of Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu, China, 2008 (in Chinese with English abstract).

[15] 丁卉. 利用SSR標記研究大豆對胞囊線蟲抗性和主要農(nóng)藝性狀的自然選擇效應(yīng). 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 江蘇南京, 2009. Ding H. The Natural Selection Effect on Resistance to SCN and Major Agronomic Characters of Soybean by SSR Analysis. MS Thesis of Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu, China, 2009 (in Chinese with English abstract).

[16] 洪雪娟, 黃婧, 丁卉, 侯金鋒, 李永春, 蓋鈞鎰, 邢邯. 大豆異地衍生重組自交系群體產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL定位. 中國油料作物學(xué)報, 2014, 36: 572–579. Hong H J, Huang J, Ding H, Hou J F, Li Y C, Gai J Y, Xing H. Detection of soybean QTLs on yield-related traits in RIL populations derived from Peking × 7605 in two sites.,2014, 36: 572–579 (in Chinese with English abstract).

[17] 袁道華. 大豆抗胞囊線蟲基因遺傳機制及育種價值分析. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 河南鄭州, 2010. Yuan D H. Genetic Mechanisms and Breeding Value Analysis of Soybean Cyst Nematode Resistance Gene. MS Thesis of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan, China, 2010 (in Chinese with English abstract).

[18] Sayama T, Hwang T Y, Yamazaki H, Yamaguchi N, Komatsu K, Takahashi M, Suzuki C, Miyoshi T, Tanaka Y, Xia Z J, Tsubokura Y, Watanabe S, Harada K, Funatsuki H, Ishimoto M. Mapping and comparison of quantitative trait loci for soybean branching phenotype in two locations., 2010, 60: 380–389.

[19] Yao D, Liu Z Z, Zhang J, Liu S Y, Qu J, Guan S Y, Pan L D, Wang D, Liu J W, Wang P W. Analysis of quantitative trait loci for main plant traits in soybean., 2015, 14: 6101–6109.

[20] 張霞. 大豆分枝相關(guān)基因的發(fā)掘與利用. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文, 北京, 2017. Zhang X. Identification and Utilization of Genes Related to Branching in Soybean. MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2017 (in Chinese with English abstract).

[21] Shim S, Kim M Y, Ha J, Lee Y H, Lee S H. Identification of QTLs for branching in soybean [(L.) Merrill]., 2017, 213: 225–233.

[22] 譚冰, 郭勇, 邱麗娟. 大豆全基因組分枝相關(guān)基因發(fā)掘及與QTL共定位. 遺傳, 2013, 35: 793–804. Tan B, Guo Y, Qiu L J. Whole genome discovery of genes related to branching and co-localization with QTLs in soybean.(Beijing), 2013, 35: 793–804 (in Chinese with English abstract).

[23] 邱麗娟. 大豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006. p 22. Qiu L J. Description and Data Standards for Soybean [(L.) Merrill]. Beijing: China Agriculture Press, 2006. p 22 (in Chinese).

[24] Meng L, Li H H, Zhang L Y, Wang J K. QTL IciMapping: Integrated software for genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping in biparental populations., 2015, 3: 269–283.

[25] Yano M. Genetic and molecular dissection of naturally occurring variation., 2001, 4: 130–135.

[26] Ashikari M, Matsuoka M. Identification, isolation and pyramiding of quantitative trait loci for rice breeding., 2006, 11: 344–350.

[27] 魯寧寧, 趙云雷, 王紅梅, 陳偉, 趙佩, 龔海燕, 崔艷利, 桑曉慧, 張凱. 基于RIL群體鑒定棉花抗黃萎病相關(guān)QTLs. 棉花學(xué)報, 2019, 31: 254–262. Lu N N, Zhao Y L, Wang H M, Chen W, Zhao P, Gong H Y, Cui Y L, Sang X H, Zhang K. Identification of QTLs related to Verticillium wilt resistance based on RIL population., 2019, 31: 254–262 (in Chinese with English abstract).

[28] Kim K S , Diers B W, Hyten D L, Rouf Mian M A, Shannon J G, Nelson R L. Identification of positive yield QTL alleles from exotic soybean germplasm in two backcross populations., 2012, 125: 1353–1369.

[29] Takagi H, Abe A, Yoshida K, Kosugi S, Natsume S, Mitsuoka C, Uemura A, Utsushi H, Tamiru M, Takuno S, Innan H, Cano L M, Kamoun S, Terauchi R. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations., 2013, 74: 174–183.

[30] 鞏鵬濤, 李迪. 植物分枝發(fā)育的遺傳控制. 分子植物育種, 2005, 3: 151–162. Gong P T, Li D. Genetic control of plant shoot branching., 2005, 3: 151–162 (in Chinese with English abstract).

[31] Kebrom T H, Spielmeyer W, Finnegan E J. Grasses provide new insights into regulation of shoot branching., 2013, 18: 41–48.

[32] Thimann K V, Skoog F. Studies on the growth hormone of plants: III. The inhibiting action of the growth substance on bud deve-lopment., 1933, 19: 714–716.

[33] Patel S, Rose A, Meulia T, Dixit R, Cyr R J, Meier I.WPP-domain proteins are developmentally associated with the nuclear envelope and promote cell division., 2005, 16: 3260–3273.

[34] Cao L R, Lu X M, Zhang P Y, Wang G R, Wei L, Wang T C. Systematic analysis of differentially expressed maizegenes between drought and rewatering transcriptome reveals bZIP family members involved in abiotic stress responses., 2019, 20: 4103–4127.

[35] Riechmann J L, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang C Z, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe D J, Yu G.transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes., 2000, 290: 2105–2110.

[36] Jakoby M, Weisshaar B, Dr?ge-Laser W, Vicente-Carbajosa J, Tiedemann J, Kroj T, Parcy F. bZIP transcription factors in., 2002, 7: 106–111.

[37] Nijhawan A, Jain M, Tyagi A K, Khurana J P. Genomic survey and gene expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice., 2008, 146: 333–350.

[38] Silveira A B, Gauer L, Tomaz J P, Cardoso P R, Carmello- Guerreiro S, Vincentz M. Theprotein fused to the VP16 transcriptional activation domain alters leaf and vascular development.(Oxford), 2007, 172: 1148–1156.

[39] Fukazawa J, Sakai T, Ishida S, Yamaguchi I, Kamiya Y, Takahashi Y. Repressionr of shoot growth, a bZIP transcriptional activator, regulates cell elongation by controlling the level of gibberellins., 2000, 12: 901–915.

[40] Guan Y C, Ren H B, Xie H, Ma Z Y, Chen F. Identification and characterization of bZIP-type transcription factors involved in carrot (L.) somatic embryogenesis., 2009, 60: 207–217.

[41] Ulm R, Baumann A, Oravecz A, Mate Z, Adam E, Oakeley E J, Schafer E, Nagy F. Genome-wide analysis of gene expression reveals function of the bZIP transcription factor HY5 in the UV-B response of., 2004, 101: 1397–1402.

[42] Weltmeier F, Ehlert A, Mayer C S, Dietrich K, Wang X, Schutze K, Alonso R, Harter K, Vicente-Carbajosa J, Droge-Laser W. Combinatorial control ofproline dehydrogenase transcription by specific heterodimerisation of bZIP transcription factors., 2006, 25: 3133–3143.

[43] Kruger N J, Schaewen A V. The oxidative pentose phosphate pathway: Structure and organisation., 2003, 6: 236–246.

[44] Spielbauer G, Li L, R?misch M L, Do P T, Fouquet R, Fernie A R, Eisenreich W, Gierl A, Settles A M. Chloroplast- localized 6-phosphogluconate dehydrogenase is critical for maize endosperm starch accumulation., 2013, 64: 2231–2242.

Development of molecular markers and fine mapping oflocus related to branch number in soybean (L.)

WU Hai-Tao1,3,**, ZHANG Yong2,**, SU Bo-Hong1,3,**, Lamlom F Sobhi3,4, and QIU Li-Juan3,*

1College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China;2Keshan Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Qiqihar 161606, Heilongjiang, China;3National Key Facility for Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Germplasm Utilization, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;4Plant Production Department, Faculty of Agriculture Saba Basha, Alexandria University, Alexandria, Egypt

The branch number is one of the important factors influencing soybean yield, which is directly related to pod setting rate. At the same time, it is also an important component of soybean plant type, and further affects the yield by adjusting the population structure and planting density. At present, there is few report related to map-based cloning of genes related to branch number. Therefore, the discovery of genes/QTL involved in the regulation of soybean branching is of great significance for the basic research on the establishment of plant type and the applied research on the development of high-yielding varieties. In this study, based on the F2of crossing low-branched variety Kenfeng 19 (KF19) and high-branched variety Kennong 24 (KN24), we developed the F7:8recombinant inbred line (RIL) population, consisting of 606 lines, and two backcrossing populations consisting of 1486 individuals for KF19-BC3F2and 1150 individuals for KN24-BC2F2. Within the localization interval of the new QTL of the branch number of chromosome 18 (), 11 polymorphism SSR markers were screened out to identify the RIL population, and region ofwas reduced from 1.6 Mb to 113 kb. After developing two InDel markers BR69 and BR77 in the mapping region, the backcross population was used to screen the exchange individuals, the interval ofwas further reduced to 63.7 kb, including 9 genes. Those results provide the information for gene map-based cloning and molecular marker assisted breeding of branch number in soybean.

soybean; branch number; QTL mapping; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2020.04043

本研究由“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0100201), 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程和大豆種質(zhì)資源保護與利用項目(2019NWB036-05)資助。

The study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100201), the Agricultural Science and Technology Innovation Program ofChinese Academy of Agricultural Sciences, and the Protection and Utilization of Soybean Germplasm Resources (2019NWB036-05).

邱麗娟, E-mail: qiulijuan@caas.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

吳海濤, E-mail: 1960478192@qq.com

2020-02-25;

2020-06-02;

2020-06-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200622.1346.010.html