張德廣，李 貞，劉 霞，王啟帥

（1. 揚子江藥業(yè)集團上海海尼藥業(yè)有限公司，上海 浦東 201318；2. 揚子江藥業(yè)集團，江蘇 泰州 225321）

多發(fā)性骨髓瘤主要是因為骨髓漿細胞異常克隆增殖所致的一種惡性漿細胞病，在造血系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率占比約為 13%，且具有臨床治療效果差，治療后復發(fā)率高等特點[1]。已有多項研究表明：在臨床治療多發(fā)性骨髓瘤中，應用硼替佐米藥物可以取得良好治療效果[2-3]。原料藥的質(zhì)量與制劑的質(zhì)量息息相關(guān)，硼替佐米原料藥在存儲過程中會降解產(chǎn)生異戊醛（圖 1），而異戊醛作為一種潛在基因毒性雜質(zhì)，會對原料藥的質(zhì)量產(chǎn)生影響[4-5]。因此，建立硼替佐米中異戊醛的分析方法對于原料藥的質(zhì)量控制十分必要。根據(jù) ICH M7《評估和控制藥物中 DNA 反應性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風險》等相關(guān)指導原則及注射用硼替佐米的用法用量，得出硼替佐米原料藥中異戊醛的限度為質(zhì)量分數(shù) 0.03%。

異戊醛無明顯紫外吸收，無法用紫外檢測器直接測定，同時由于硼替佐米對熱不穩(wěn)定，會降解產(chǎn)生異戊醛，不宜采用頂空-氣相法測定。2, 4-二硝基苯肼作為一種常用的檢測羰基化合物（-CO）的試劑，在酸性介質(zhì)中，羰基化合物與 2, 4-二硝基苯肼反應，生成具有紫外吸收的 2, 4-二硝基苯腙，從而可以采用液相色譜檢測，間接測定樣品中的醛類。本研究利用上述原理，檢測硼替佐米中的異戊醛。

Fig. 1 Degradation pathways of bortezomib圖 1 硼替佐米降解途徑

1 儀器與材料

1260 高效液相色譜儀（配四元梯度泵，DAD 檢測器和 Empower?3 色譜工作站，美國，安捷倫公司），XP205 電子分析天平（瑞士，梅特勒-托利多集團）。

異戊醛對照品（質(zhì)量分數(shù)為 99.78%，批號 20151227，天津市光復精細化工研究所），硼替佐米原料藥（批號 15012801，揚子江藥業(yè)集團江蘇海慈生物醫(yī)藥有限公司），乙腈（色譜級，默克兩合股份有限公司），甲酸（分析級，國藥集團化學試劑有限公司），磷酸（分析級，山東西亞化學工業(yè)有限公司），2, 4-二硝基苯肼鹽酸鹽（DNPH·HCl 分析級，東京化成工業(yè)株式會社），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 衍生條件

醛類常見的檢測方法有氣相色譜法、高效液相色譜法等[6]。由于硼替佐米對熱不穩(wěn)定，不宜采用氣相色譜法檢測。馬慶國等[7]以 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑，采用高效液相色譜法檢測甲醛，并探討了衍生溫度和緩沖液等對衍生化反應的影響；俞凌云等[8]以 2, 4-二硝基苯肼作為衍生化試劑，采用超高效液相色譜法檢廢水中乙二醛、甲醛等 7 種醛，具有良好回收率和靈敏度，同時專屬性也比較好。本研究選擇 2, 4-二硝基苯肼為衍生試劑，磷酸為酸催化劑，乙腈-水（20︰80，體積比）為溶劑，在室溫條件下，衍生化 30 min 即得。（試驗顯示，衍生物峰面積 24 h 內(nèi)無明顯變化）。

2.2 色譜條件

色譜柱為 Waters symmetry C18（250 mm × 4.6 mm，5μm）；以乙腈（體積分數(shù)0.1%甲酸）為流動相 A，以水（體積分數(shù) 0.1% 甲酸）為流動相 B，按表1進行線性梯度洗脫；流速為 1.0 mL?min-1；柱溫為 30 ℃；檢測波長為 364 nm；進樣量為 5μL[9-10]。

Table 1 Linear gradient elution table表 1 線性梯度洗脫表

2.3 溶液的制備

2.3.1 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液的制備

稱取 2, 4-二硝基苯肼鹽酸鹽約 40 mg，置于 50 mL 量瓶中，加乙腈約 30 mL，再加磷酸 1 mL，超聲使之溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 異戊醛標準品溶液的制備

取異戊醛標準品約 30 mg，精密稱定，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取 1 mL，置 50 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 異戊醛-DNPH 對照品溶液的制備

精密量取異戊醛標準品溶液 1 mL，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈 3 mL，再精密加入 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。室溫放置 30 min，作為異戊醛-DNPH對照品溶液。

2.3.4 供試品溶液制備

取硼替佐米約 100 mg，精密稱定，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈 4 mL，水 1 mL，超聲使溶解，精密加入 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。室溫放置 30 min，作為供試品溶液。

2.3.5 空白溶液的制備

精密量取 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL，置于 20 mL 量瓶中，加乙腈 4 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗

取本品約 100 mg，精密稱定，置于 20 mL 量瓶中，精密加乙腈 3 mL，異戊醛標準品溶液 1 mL，2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液 1 mL 和水 1 mL，超聲使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為分離度溶液。取空白溶液，異戊醛-2, 4-二硝基苯肼對照品溶液，供試品溶液和分離度溶液，按“2.2”項方法檢測，記錄色譜圖，見圖 2。結(jié)果顯示：空白溶液色譜圖中在異戊醛-2, 4-二硝基苯肼峰位置無明顯干擾峰，供試品溶液和分離度溶液色譜圖中，異戊醛-2, 4-二硝基苯肼峰與相鄰峰之間的分離度均大于 1.5，滿足分離度要求，方法的專屬性良好。

2.4.2 檢測限和定量限考察

精密量取異戊醛-2, 4-二硝基苯肼對照品溶液 1 mL，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 25 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為定量限溶液。精密量取定量限溶液 2 mL，置 10 mL 量瓶中，加乙腈3 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為檢測限溶液。分別量取定量限溶液和檢測限溶液各 5μL 進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明：異戊醛檢測限為 0.016 ng，定量限為 0.080 ng，說明方法的靈敏度良好。

2.4.3 線性關(guān)系考察

按表2量取規(guī)定體積的異戊醛標準品溶液和 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液，置于 20 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。分別進樣 5μL 測定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度ρ（mg?L-1）為橫坐標，以峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為A= 1.397 × 105ρ– 1.203 × 103，r=1.000 0。研究結(jié)果表明，異戊醛在質(zhì)量濃度 0.015～2.998 mg?L-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

Fig. 2 HPLC chromatograms of blank (A), reference substances (B), resolution solutions (C) and samples (D)圖 2 空白溶液（A），對照品溶液（B），分離度溶液（C）和供試品溶液（D）的HPLC色譜圖

Table 2 Preparation of linear solutions表 2 線性溶液配制

2.4.4 精密度試驗

取同一批次的硼替佐米，按“2.3.4”項下方法平行配制 6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣 5μL，記錄供試品溶液中異戊醛-2, 4-二硝基苯肼的峰面積，按外標法以峰面積計算6 份供試品溶液中的異戊醛的含量。結(jié)果表明：6 份平行配制的供試品中異戊醛的含量的最大值為質(zhì)量分數(shù) 0.000 7%，最小值為質(zhì)量分數(shù) 0.000 6%，最大值與最小值之間的差值為 0.000 1%，表明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗

取同一批次的硼替佐米，精密稱定 9 份，分成 3 組，每組 3 份，各組分別加入異戊醛標準品溶液適量（相當于限度濃度 0.03% 的 50%、100%、150%）和 2, 4-二硝基苯肼衍生化試劑溶液1 mL，加乙腈 3 mL，用水稀釋至刻度。按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算異戊醛的回收率和 RSD，結(jié)果見表3，表明方法的回收率良好。

Table 3 Results of recovery test (n = 9)表 3 加標回收率結(jié)果（n = 9）

2.4.6 耐用性試驗

精密量取對照品溶液和供試品溶液各 5μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)流動相流速（0.8 mL?min-1和1.2 mL?min-1）、柱溫（25 ℃和35 ℃）、甲酸體積分數(shù)（0.09%和0.11%）和更換不同批號的色譜柱，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各變化條件下系統(tǒng)適用性符合要求，與正常條件相比，供試品的異戊醛含量無明顯差異，本方法耐用性良好。

3 結(jié)論與討論

a. 由于異戊醛無明顯紫外吸收，無法用液相直接測定，同時硼替佐米受高溫不穩(wěn)定，易降解產(chǎn)生異戊醛，因此亦不能采用氣相色譜測定。本方法利用異戊醛與 2, 4-二硝基苯肼反應，生成穩(wěn)定的腙類衍生物，建立了柱前衍生、高效液相色譜法測定硼替佐米中異戊醛含量的方法。

b. 該方法的靈敏度高，檢測限可達到 0.016 ng，線性范圍較寬，重復性好，異戊醛的回收率為 101.1%，耐用性好，可用于硼替佐米中異戊醛含量的測定。