張亞平， 劉智， 段玉龍， 趙軍， 范蒙蒙， 劉玲

（1.平頂山市第二人民醫(yī)院慢性病門診，河南省平頂山市 467000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南省衛(wèi)輝市 453100）

缺血性心力衰竭（ischemic heart failure，IHF）是臨床常見的危重疾病，屬于中醫(yī)學“胸痹”“心悸”“怔忡”“喘證”“水腫”等病證的范疇，病機復(fù)雜，證候多樣。IHF的基本病機為氣虛血瘀、虛實夾雜。隨著我國人口老齡化的趨勢，心力衰竭的發(fā)病率逐年升高，因此，探尋新的抗心力衰竭藥物是臨床研究的重要問題[1]。燈盞花是菊科植物短 亭飛 蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz 的干燥全草，味甘，性溫，有散寒解表、活血舒筋、止痛、消積等功效。燈盞乙素（Breviscapine）是從燈盞花中提取的黃酮類化合物，具有抗凝血、抗血栓形成，改善血液流變性及微循環(huán)，并增加腦血流量，保護心肌缺血/再灌注損傷，提高機體耐缺氧能力等作用[2]。已有報道燈盞乙素與西藥可聯(lián)合用于冠心病、心肌梗死、高血壓、房顫、高脂血癥、病毒性心肌炎、肺心病等心血管疾病的治療[3]。心肌重構(gòu)是IHF 發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)[4]。因此，本研究觀察了燈盞乙素對IHF 大鼠心肌重構(gòu)的影響及其機制，以期為IHF的預(yù)防和治療及燈盞乙素的開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物90 只成年雄性Sprague-Dawley 大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g，購自河南省實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號：SYXK（豫）2016-0002。所有大鼠于平頂山市第二人民醫(yī)院心內(nèi)四科動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，溫度25 ℃左右、濕度50%左右，給予大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑燈盞乙素（純度≥98%，上海邦景實業(yè)有限公司）；卡托普利（純度≥99%，上海恒遠生物科技有限公司）。RIPA 裂解緩沖液（南京?？藸柹锟萍加邢薰荆欢姿幔˙CA）試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司）；Bax蛋白抗體（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；Bcl-2 蛋白抗體、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）抗體（碧云天生物技術(shù)研究所）；膠原蛋白（Collagin）Ⅰ抗體、Collagin Ⅲ抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1 抗體、MMP-2 抗體、MMP-9 抗體（上海艾博抗生物科技有限公司）；山羊抗兔二抗（上?？蹬嗫萍加邢薰荆?；白細胞介素（IL）-18酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海撫生實業(yè)有限公司）；IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海聯(lián)碩生物刻科技有限公司）；細胞間粘附分子1（ICAM-1）ELISA試劑盒（上海和序生物科技有限公司）。

1.3 儀器流式細胞儀（美國碧迪醫(yī)療器械有限公司）；DB128型無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司）；MyLabTMSix 型彩色多普勒超聲診斷儀（意大利百勝集團）。

1.4 分組、模型構(gòu)建與給藥將90只大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，燈盞乙素低、中、高劑量組，陽性對照組，每組15 只。除假手術(shù)組外，其他組別大鼠采用約翰斯法建立IHF 模型[5]。方法：首先將大鼠麻醉并在無菌手術(shù)條件下打開胸腔，心包分離，然后輕擠心臟，并用棉簽輕撫左心耳，在左心耳與肺動脈圓錐之間結(jié)扎左前降支冠狀動脈。觀察大鼠的心電圖變化，當出現(xiàn)S-T段水平向上或向下偏移0.1 mV 以上且結(jié)扎線以下心肌顏色變暗時，可判斷為造模成功。假手術(shù)組不結(jié)扎左前降支冠狀動脈，其他操作同上。從造模第3 天開始至8 周末，燈盞乙素低、中、高劑量組大鼠腹腔注射燈盞乙素（0.3、3、30 mg·kg-1·d-1）[6]，陽性對照組每天灌胃卡托普利（180 mg·kg-1·d-1）[7]，假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 血壓測量 應(yīng)用DB128型無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)記錄尾部收縮壓、舒張壓和心率。每個參數(shù)測量3次。

1.5.2 超聲心動相關(guān)指標檢測 所有大鼠在術(shù)后8周接受超聲心動檢測。用異氟醚麻醉大鼠，仰臥位固定，剃光胸部毛發(fā)，測量心室舒張末期室間隔厚度（iIVSd）、左心室收縮末期直徑（LVIDs）、左心室舒張末期直徑（LVIDd）、舒張早期二尖瓣血流速度/舒張晚期二尖瓣血流速度（E/A）比值。應(yīng)用Teichholtz 方程導(dǎo)出射血分數(shù)（EF）和收縮分數(shù)（FS），并評估左心室舒張末期容積（LVEDV）和左心室收縮末期容積（LVESV）。

1.5.3 左心室質(zhì)量/體質(zhì)量 稱左心室質(zhì)量、體質(zhì)量、計算左心室質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.5.4 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌病理損傷 每組隨機剖取6只大鼠心臟，用40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)脫水制成石蠟切片。然后脫蠟、蘇木素液染色。1% 鹽酸酒精分化，0.6%氨水返藍，0.5%伊紅液染色。接著常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在400倍顯微鏡下觀察心肌病理損傷情況。

1.5.5 流式細胞術(shù)檢測大鼠心肌細胞凋亡 加入適量胰酶細胞消化液消化細胞，離心棄上清，收集細胞，按1×106個/mL的細胞濃度重懸。細胞懸液中加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，在暗室里孵化15 min，然后，用流式細胞儀分析細胞的凋亡情況。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測心肌細胞凋亡標志蛋白cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及心肌重構(gòu)相關(guān)蛋白CollaginⅠ、Collagin Ⅲ、MMP-1、MMP-2、MMP-9 蛋白的表達 使用RIPA 裂解緩沖液從心肌組織中提取總蛋白質(zhì)，并用BCA 試劑盒檢測濃度。將10 μg 蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用50 g/L脫脂乳封閉膜1 h。加入對應(yīng)一抗（cleaved Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、 CollaginⅠ1∶500、 Collagin Ⅲ1∶500、 MMP-1 1∶1 000、MMP-2 1∶1 000和MMP-9 1∶500稀釋），在4 ℃過夜。將膜與辣根過氧化物酶綴合的二抗一起溫育。通過使用電化學發(fā)光系統(tǒng)顯示蛋白質(zhì)條帶，使用Image J 軟件進行蛋白質(zhì)條帶灰度的定量分析。

1.5.7 ELISA法檢測心肌中炎癥因子IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量選取大鼠心臟同一部位的組織，按質(zhì)量體積比為1∶9 加入生理鹽水，以3 000 r·min-1離心10 min后，取上清液加入各反應(yīng)孔，37 ℃反應(yīng)45 min。接著用洗滌液洗滌4 次，再加入生物素標記的抗體（IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α），在 37 ℃孵育 30 min。洗滌后加HRP 標記的鏈霉親和素混合均勻，在37 ℃反應(yīng)30 min，接著加入顯色劑避光顯色，最后加終止液終止反應(yīng)，應(yīng)用酶標儀進行檢測。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù) ± 標準差（±s）表示。多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步組間兩兩比較采用LSD-t方法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較模型組大鼠除了呼吸困難甚至喘息、體質(zhì)量減輕、毛發(fā)光澤減少外，還存在活動減少、精神萎靡；而燈盞乙素各劑量組和陽性對照組大鼠的這些情況均得到明顯改善。在實驗結(jié)束時，模型組和燈盞乙素低劑量組中各有1只大鼠死于慢性心力衰竭。模型組大鼠手術(shù)8 周后的體質(zhì)量為（369.85± 47.26）g 明顯低于假手術(shù)組（478.40±28.30）g（P＜ 0.05）；與模型組比較，燈盞乙素低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量（389.12 ± 33.57）g、（423.55 ± 38.81）g、（457.24 ±42.34）g和陽性對照組大鼠體質(zhì)量（468.34±29.87）g均明顯增加，其中，燈盞乙素高劑量組和陽性對照組大鼠體質(zhì)量與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明燈盞乙素可改善IHF 大鼠的一般情況。

2.2 各組大鼠收縮壓、舒張壓和心率比較圖1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的收縮壓、舒張壓和心率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞乙素各劑量組和陽性對照組大鼠的收縮壓、舒張壓和心率均有不同程度的升高，且燈盞乙素高劑量組和陽性對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明燈盞乙素可改善IHF大鼠的血壓和心率。

圖1 各組大鼠收縮壓、舒張壓和心率比較（±s，n=9）Figure 1 Comparison of the systolic blood pressure，diastolic blood pressure，heart rate in rats of various groups（±s，n=9）

2.3 各組大鼠超聲心動相關(guān)指標比較表1 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠EF、FS、E/A明顯降低（P＜ 0.05），LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs 明顯升高（P＜ 0.05），IVSd 無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，燈盞乙素各劑量組和陽性對照組大鼠EF、FS、E/A 均有不同程度的升高，LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs 均有不同程度的降低，且燈盞乙素高劑量組和陽性對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明燈盞乙素可改善IHF大鼠的心臟功能。

表1 各組缺血性心力衰竭大鼠超聲心動相關(guān)指標比較Table 1 Comparison of the echocardiography related indexes in rats of various groups （±s）

表1 各組缺血性心力衰竭大鼠超聲心動相關(guān)指標比較Table 1 Comparison of the echocardiography related indexes in rats of various groups （±s）

①P ＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組燈盞乙素低劑量組燈盞乙素中劑量組燈盞乙素高劑量組陽性對照組n/只9 9 9 9 9 9 EF（p/%）68.2±9.3 48.7±7.2①50.2±7.6 55.5±8.4 61.4±7.8②62.2±8.5②FS（p/%）39.5±7.1 26.3±10.5①28.7±7.6 31.5±8.9 36.4±9.4②36.8±10.2②E/A 2.02±0.15 0.98±0.14①1.21±0.23 1.64±0.31 1.87±0.24②1.96±0.21②LVEDV 222.1±18.9 337.2±19.4①312.5±17.6 286.4±18.3 247.5±17.5②231.7±18.8②LVESV 72.5±9.8 118.4±17.5①102.3±15.6 95.6±14.7 78.2±12.3②74.3±11.2②IVSd 1.35±0.13 1.51±0.21 1.49±0.19 1.43±0.18 1.38±0.15 1.36±0.13 LVIDd 6.59±0.32 8.01±0.29①7.72±0.25 7.44±0.23 7.03±0.28②6.94±0.30②LVIDs 4.05±0.56 5.94±0.38①5.62±0.42 5.03±0.49 4.62±0.34②4.41±0.36②

2.4 各組大鼠心肌病理變化、左心室質(zhì)量/體質(zhì)量比較圖2-A結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，胞核清晰可見，排列整齊；模型組心肌細胞核嚴重濃縮，排列疏松、紊亂，有多處斷裂，間質(zhì)增寬并伴隨有水腫現(xiàn)象；而燈盞乙素可呈劑量依賴性改善該損傷。圖2-B 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的左心室質(zhì)量/體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞乙素各劑量組和陽性藥對照組大鼠的左心室質(zhì)量/體質(zhì)量均有不同程度的減小，且燈盞乙素高劑量組和陽性對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明燈盞乙素可修復(fù)IHF大鼠的心肌損傷。

圖2 各組大鼠心肌病理變化、左心室質(zhì)量/體質(zhì)量比較Figure 2 Comparison of the myocardial pathological features and ventriculus mass/body mass ratio in rats of various groups

2.5 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較圖3-A，-B結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，燈盞乙素各劑量組和陽性對照組大鼠心肌細胞凋亡率均有不同程度的減小，且燈盞乙素中、高劑量組和陽性對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。圖3-B，-C 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心肌細胞凋亡標志蛋白cleaved Caspase-3和Bax/Bcl-2表達水平明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，燈盞乙素各劑量組和陽性對照組大鼠的心肌細胞cleaved Caspase-3和Bax/Bcl-2 表達水平均有不同程度的下調(diào)，且燈盞乙素高劑量組和陽性對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。表明燈盞乙素可降低IHF大鼠的心肌細胞凋亡。

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較Figure 3 Comparison of the cardiomyocyte apoptosis in rats of various groups

2.6 各組大鼠心肌重構(gòu)相關(guān)蛋白Collagin I、Collagin Ⅲ、MMP-1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達比較圖4結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心肌細胞CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-2 和MMP-9 表達水平明顯上調(diào)（P＜ 0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，燈盞乙素各劑量組和陽性對照組大鼠的心肌細胞CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-2和MMP-9表達水平均有不同程度的下調(diào)，且燈盞乙素高劑量組和陽性對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果表明燈盞乙素可調(diào)節(jié)IHF大鼠心肌重構(gòu)相關(guān)蛋白的表達。

圖4 各組大鼠心肌重構(gòu)相關(guān)蛋白CollaginⅠ、Collagin Ⅲ、MMP-1、MMP-2和MMP-9蛋白表達比較Figure 4 Comparison of the expression levels of rat myocardial remodeling-related protein Collagin I，Collagin Ⅲ，MMP-1，MMP-2 and MMP-9 in various groups

2.7 各組大鼠心肌中炎癥因子IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量比較圖5結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌中炎癥因子IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α 含量明顯增加（P＜0.05），IL-6含量亦增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，燈盞乙素各劑量組和陽性對照組大鼠心肌IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量均有不同程度的減少，且燈盞乙素高劑量組和陽性對照組心肌IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α 含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，燈盞乙素可減輕IHF 大鼠心肌細胞炎癥反應(yīng)。

圖5 各組大鼠心肌細胞中IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α含量比較Figure 5 Comparison of the contents of IL-18，IL-1β，IL-6，ICAM-1 and TNF-α in rat cardiocytes of various groups

3 討論

心力衰竭是指由于心臟的收縮功能或舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙的癥候群[8]。血壓和心功能相關(guān)指標均可作為衡量缺血性心力衰竭（IHF）的指標[9]。本研究結(jié)果顯示，IHF 大鼠收縮壓、舒張壓和心率及EF、FS、E/A 明顯降低，LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs 明顯升高，表明IHF 大鼠出現(xiàn)明顯的心功能障礙，這與Xing 等[5]的研究結(jié)果相一致。而燈盞乙素可明顯提高IHF大鼠的收縮壓、舒張壓和心率及EF、FS、E/A，降低LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs，表明燈盞乙素可改善IHF大鼠的血壓和心功能。

心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)是心室重構(gòu)。心室重構(gòu)是心力衰竭患者發(fā)病率和死亡率的決定因素，預(yù)示著心力衰竭從代償走向失代償[10]。心肌重構(gòu)的變化包括心肌細胞的肥大、凋亡等心肌損傷。本研究觀察了IHF 大鼠心肌病理形態(tài)學的HE染色結(jié)果，可見心肌細胞核嚴重濃縮、排列疏松、紊亂，有多處斷裂、間質(zhì)增寬并伴隨有水腫現(xiàn)象，而燈盞乙素可改善IHF大鼠的上述心肌病理變化。本研究結(jié)果還顯示，IHF 大鼠左心室質(zhì)量/體質(zhì)量明顯升高，而燈盞乙素可明顯降低缺血性心力衰竭大鼠的左心室質(zhì)量/體質(zhì)量。這都表明燈盞乙素可減輕IHF大鼠的心肌損傷，抑制心肌重構(gòu)。

心肌損傷一般伴隨著細胞的凋亡[11]?；罨腃aspase-3能降解DNA復(fù)制相關(guān)蛋白、凋亡抑制蛋白和細胞骨架蛋白等，促使細胞凋亡[12]。Bcl-2 蛋白能夠抑制細胞的凋亡，Bax 蛋白與Bcl-2 結(jié)合形成復(fù)合體，能促進Bcl-2 的降解，解除Bcl-2 對細胞凋亡抑制作用，Bax/Bcl-2 反映細胞凋亡的情況[13]。本研究結(jié)果顯示，IHF大鼠心肌細胞凋亡率及心肌細胞凋亡標志蛋白cleaved Caspase-3和Bax/Bcl-2表達水平均顯著增加，而燈盞乙素能夠降低IHF大鼠心肌細胞凋亡率及心肌細胞凋亡標志蛋白cleaved Caspase-3 和Bax/Bcl-2 表達水平。表明燈盞乙素可能通過降低IHF大鼠心肌細胞凋亡從而抑制心肌重構(gòu)。

心室重構(gòu)主要由心肌間質(zhì)的變化引起，心肌間質(zhì)主要由膠原蛋白和糖蛋白組成，而在心肌膠原 中 Collagen Ⅰ 占 80% ～85% ， Collagen Ⅲ 占11%[14]。心室重構(gòu)時，膠原蛋白會發(fā)生沉積，有效地抑制Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ沉積以抑制心力衰竭[15]。本研究結(jié)果表明，IHF 大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達水平明顯上調(diào)，而燈盞乙素能夠明顯下調(diào)IHF 大鼠心肌Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是蛋白水解酶，其功能是針對膠原蛋白和間質(zhì)成分的降解[16]。MMP-1、MMP-2和MMP-9在心室重塑過程發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。既往有研究[17]表明，心室重構(gòu)過程中MMP-1、MMP-2 和 MMP-9 表達增強。本研究結(jié)果顯示，IHF大鼠心肌MMP-1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯上調(diào)，而燈盞乙素能夠明顯下調(diào)IHF 大鼠心肌 MMP-1、MMP-2 和 MMP-9 表達水平。表明燈盞乙素可調(diào)控IHF大鼠心肌間質(zhì)成分的變化，抑制心肌重構(gòu)。

炎癥和心力衰竭緊密相關(guān)，相互促進。心力衰竭會激發(fā)心肌細胞內(nèi)源性的炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)釋放大量的炎癥因子，從而進一步引起心肌受損重構(gòu)，進而加重心力衰竭[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠炎癥因子IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量明顯升高[19]。本研究結(jié)果顯示，IHF大鼠炎癥因子IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α 含量明顯升高，而燈盞乙素能夠明顯降低IHF大鼠炎癥因子IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α含量。表明燈盞乙素可能通過降低IHF大鼠炎癥因子的釋放從而抑制心肌重構(gòu)。

綜上所述，燈盞乙素可改善IHF大鼠的血壓和心功能，其機制可能與降低心肌細胞凋亡、炎癥反應(yīng)從而抑制心肌重構(gòu)有關(guān)。但其作用通路和相關(guān)分子機制還有待進一步研究。