許江濤， 張麗娟， 霍宇航， 程娟娟， 陳鈺婷， 李得堂

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東中山 528400；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是特應(yīng)性個(gè)體接觸致敏原后，由IgE 介導(dǎo)的介質(zhì)釋放、多種細(xì)胞因子參與的鼻黏膜I 型變態(tài)反應(yīng)[1]。臨床上以陣發(fā)性噴嚏、大量清水樣鼻涕、鼻癢和鼻塞為主要特征。變應(yīng)性鼻炎屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”的范疇，肺氣虧虛，衛(wèi)外不固，風(fēng)寒客于鼻竅，肺失宣降，鼻竅不利是變應(yīng)性鼻炎的病機(jī)關(guān)鍵，以肺氣虛型最為常見(jiàn)[2]。中醫(yī)臨床上多以補(bǔ)益肺氣法進(jìn)行治療。中藥黃芪味甘、性微溫，入脾、肺經(jīng)，有健脾補(bǔ)肺、益氣升陽(yáng)、固表的作用，為補(bǔ)氣諸藥之最，在變應(yīng)性鼻炎治療中有不可或缺的作用[3]。黃芪多糖作為黃芪的主要活性成分，能夠調(diào)節(jié)免疫平衡、增強(qiáng)免疫功能、抗菌及抑制病毒[4]，探討黃芪多糖對(duì)變應(yīng)性鼻炎的治療作用對(duì)臨床藥物應(yīng)用具有重要的意義。因此，本研究建立肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎復(fù)合大鼠模型，觀察黃芪多糖對(duì)其干預(yù)的作用及機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40 只SPF 級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，180～220 g，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002]提供。實(shí)驗(yàn)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心ABSL-2 實(shí)驗(yàn)室（實(shí)驗(yàn)室備案證號(hào)：粵廣動(dòng)實(shí)備GZL0004號(hào)）完成。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物、試劑與儀器黃芪多糖（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號(hào)：HA012740198）；氯雷他定片[拜耳醫(yī)藥（上海）有限公司，批號(hào)：JS07620]。卵清蛋白（OVA）（購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號(hào)：1706GYD005）；椰樹(shù)牌香煙（廣東中煙工業(yè)責(zé)任有限公司，批號(hào)：8112110148788116）；白細(xì)胞介素4（IL-4）、干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國(guó)BD 公司）；胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）、OX40 配體（OX40L）、β-actin 等引物（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成）。酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 分組與造模將40 只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、氯雷他定組、黃芪多糖組，每組10 只。先建立肺氣虛證模型，再進(jìn)行變應(yīng)性鼻炎模型的構(gòu)建。肺氣虛證大鼠模型建立：參照《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》“煙熏法肺氣虛證動(dòng)物模型”方法[5]，除正常組不作處理外，其余3 組大鼠放入特制玻璃煙熏造模箱，用椰樹(shù)牌香煙煙熏0.5 h，每天2次，連續(xù)28 d。肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠模型的構(gòu)建：從肺氣虛證大鼠模型建立成功后第2 天開(kāi)始，參考文獻(xiàn)[6]方法造模，分為基礎(chǔ)致敏和局部激發(fā)2 個(gè)步驟?；A(chǔ)致敏： 將OVA 0.3 mg、A1（OH）330 mg 溶于1 mL 生理鹽水配制成致敏液，腹腔注射隔天1 次，共7 次；局部激發(fā)：取50 g/L OVA溶液（作為致敏液）100 μL，連續(xù)14 d滴鼻。

1.4 給藥在局部激發(fā)階段，即造模第14～27天，每次局部激發(fā)前30 min，氯雷他定組給予氯雷他定0.9 mg·kg-1·d-1[7]灌胃，黃芪多糖組給予黃芪多糖400 mg·kg-1·d-1[8]灌胃，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。共給藥14 d。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 肺氣虛證候[9]評(píng)價(jià) 在肺氣虛證造模結(jié)束當(dāng)天，根據(jù)中醫(yī)診斷學(xué)“四診合參”，觀察大鼠相關(guān)證候并記錄。望：精神狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)步態(tài)、毛色、呼吸情況、籠內(nèi)異味、大便情況、進(jìn)食量；聞：籠內(nèi)異味；量：體溫。

1.5.2 變應(yīng)性鼻炎癥狀評(píng)分[10]造模第27天末次鼻腔激發(fā)后30 min內(nèi)，觀察大鼠鼻部過(guò)敏癥狀（鼻癢、噴嚏、流涕）并記錄、評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。若3 項(xiàng)指標(biāo)的總分大于5 分，即判斷造模成功。

表1 大鼠鼻炎癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring standard of rhinitis symptoms in rats

1.5.3 大鼠脾臟指數(shù) 給藥結(jié)束當(dāng)天，大鼠頸椎脫臼處死后，解剖取全脾稱質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)（%）= 大鼠脾質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.5.4 鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 給藥結(jié)束后，將大鼠頸椎脫臼處死，收集鼻黏膜組織制片，分別用蘇木素-伊紅（HE）和天狼猩紅（Sirius Red）染色，顯微鏡下觀察鼻黏膜組織病理學(xué)改變。

1.5.5 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中IL-4、IFN-γ水平 給藥結(jié)束后，用水合氯醛麻醉大鼠，眼底靜脈叢取血，離心收集血清，儲(chǔ)存于-80 ℃。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL-4、IFN-γ水平。

1.5.6 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法檢測(cè)大鼠鼻黏膜組織中TSLP、OX40L 的mRNA表達(dá)水平 給藥結(jié)束后，處死大鼠，取新鮮鼻黏膜組織10 mg，加入TRIzol 裂解液充分研磨，提取總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 檢測(cè) TSLP、OX40L 的 mRNA 表達(dá)水平?？傮w系20 μL：10 μL SYBR Green Supermix，正反向引物各0.5 μL，RNase-free water 8 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算TSLP、OX40L mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表2。

表2 PCR 引物序列Table 2 Primer sequences of PCR

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果判斷及各組大鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀總分比較模型大鼠進(jìn)食量明顯減少，精神萎靡，活動(dòng)量減少，毛色枯黃，呼吸音稍粗，大便偏稀，籠內(nèi)無(wú)明顯異味，體溫偏高，變應(yīng)性鼻炎癥狀總分＞5 分。表明造模成功。圖1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組變應(yīng)性鼻炎癥狀總分升高（P＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀總分顯著降低（P＜0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明黃芪多糖可有效改善變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻癢、噴嚏、流涕等鼻部過(guò)敏癥狀。

圖1 各組大鼠變應(yīng)性鼻炎行為學(xué)總分比較（±s，N=10）Figure 1 Comparison of the total behavioral scores of rat allergic rhinitis in various groups（±s，N=10）

2.2 各組大鼠脾臟指數(shù)比較圖2 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明黃芪多糖可提高變應(yīng)性鼻炎大鼠免疫功能。

圖2 各組大鼠脾臟指數(shù)比較（±s，N=10）Figure 2 Comparison of the rat spleen index in various groups（±s，N=10）

2.3 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化比較圖3、4結(jié)果顯示：正常組鼻黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原沉積較少。模型組鼻黏膜上皮不連續(xù)，部分基底膜脫落，部分纖毛上皮脫落，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和明顯的膠原沉積。與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組鼻黏膜上皮細(xì)胞排列完整，基底膜完整，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原沉積明顯減少。

圖3 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化比較（HE染色，×200）Figure 3 Comparison of the pathological features of rat nasal mucosa in various groups（by HE staining，×200）

圖4 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化比較（天狼猩紅染色，×200）Figure 4 Comparison of the pathological features of rat nasal mucosa in various groups（by Sirius Red staining，×200）

2.4 各組大鼠血清中IL-4、IFN-γ水平比較圖5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清中的IL-4 水平顯著升高（P＜ 0.05），IFN-γ 水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠血清中的IL-4 水平顯著降低（P＜0.05），IFN-γ 水平顯著升高（P＜ 0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠血清中IL-4（A）、IFN-γ（B）水平比較（±s，N=10）Figure 5 Comparison of the serum levels of IL-4，IFN-γ in various groups（±s，N=10）

圖6 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP mRNA（A）、OX40L mRNA（B）相對(duì)表達(dá)量比較（±s，N=8）Figure 6 Comparison of the mRNA expression levels of TSLP，OX40L in rat nasal mucosa of various groups（±s，N=8）

2.5 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP mRNA、OX40L mRNA表達(dá)水平比較圖6結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織的TSLP mRNA、OX40L mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠鼻黏膜組織的TSLP mRNA、OX40L mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），且2 個(gè)治療組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究參考西醫(yī)臨床癥狀指標(biāo)以及曾斌[9]建立的中醫(yī)“四診合參”大鼠肺氣虛寒行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎復(fù)合動(dòng)物模型，該模型動(dòng)物癥狀評(píng)價(jià)指標(biāo)可較好地模擬變應(yīng)性鼻炎典型臨床特征[11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為變應(yīng)性鼻炎的病位在鼻，主要與肺、脾、腎密切相關(guān)。脾虛則失健運(yùn)，水谷之精上升乏門(mén)，頭面清竅失養(yǎng)，無(wú)力御邪，外邪異氣可經(jīng)口鼻之竅侵襲人體而致鼻鼽發(fā)生。脾臟作為最大的免疫器官，其脾臟指數(shù)的高低可初步估計(jì)脾臟免疫功能的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛色枯黃、大便偏稀、進(jìn)食量減少等明顯的肺氣虛證候表現(xiàn)，鼻部過(guò)敏癥狀明顯，脾臟指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。提示煙熏法與OVA致敏可成功建立肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠模型，且變應(yīng)性鼻炎大鼠免疫功能降低。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠肺氣虛寒證候表現(xiàn)有所改善，鼻部過(guò)敏癥狀減輕，脾臟指數(shù)明顯降低（均P＜0.05）。提示黃芪多糖可減輕肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠的過(guò)敏性癥狀，提高脾臟組織免疫力。

變應(yīng)性鼻炎的鼻黏膜存在組織重塑現(xiàn)象，其中上皮細(xì)胞損傷和基膜膠原沉積是組織重塑的重要特征[12]。變應(yīng)性鼻炎是由抗原引起的鼻黏膜變應(yīng)性炎癥，病程較長(zhǎng)，由于炎癥因子的持續(xù)作用，導(dǎo)致上皮不能修復(fù)而使得黏膜上皮發(fā)生形態(tài)變化，如纖毛缺失和部分上皮細(xì)胞脫落，同時(shí)亦引起黏膜下膠原纖維增生。組織重塑一旦發(fā)生往往難以逆轉(zhuǎn)，早期藥物干預(yù)對(duì)變應(yīng)性鼻炎治療非常重要。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織重塑現(xiàn)象明顯；與模型組比較，黃芪多糖組鼻黏膜上皮細(xì)胞排列完整，基底膜完整，少見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原沉積明顯減少。提示黃芪多糖可減輕變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜病理?yè)p傷，緩解鼻黏膜組織重塑現(xiàn)象。

TSLP 是一類由上皮細(xì)胞分泌的新型IL-7 樣細(xì)胞因子，在過(guò)敏性炎癥條件下呈高表達(dá)，是啟動(dòng)過(guò)敏性炎癥的重要因子[13]。TSLP 信號(hào)通路的下游是OX40和其配體OX40L，它們是一對(duì)協(xié)同刺激分子。OX40L 是一種表達(dá)在成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的T、B 細(xì)胞表面的II 型跨膜糖蛋白，與OX40 在一些系列記憶T 細(xì)胞活動(dòng)中相互作用，并維持效應(yīng)T 細(xì)胞的存活和增殖，對(duì)Th1、Th2 細(xì)胞的分化過(guò)程起關(guān)鍵作用，TSLP-OX40L被認(rèn)為是啟動(dòng)和維持變應(yīng)性鼻炎中Th2型免疫應(yīng)答的重要信號(hào)通路[14]。TSLP 在過(guò)敏性炎癥中通過(guò)激活髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）以產(chǎn)生OX40L，從而觸發(fā)Th2 炎癥反應(yīng)[15]。以Th2 免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)所引起的Th1/Th2免疫失衡是誘發(fā)變應(yīng)性鼻炎的主要發(fā)病機(jī)制[16]。Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過(guò)釋放IFN-γ等細(xì)胞因子來(lái)抑制Th2細(xì)胞活化，而Th2細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，通過(guò)產(chǎn)生IL-4 等細(xì)胞因子來(lái)抑制Th1細(xì)胞分化。當(dāng)Th1細(xì)胞釋放的IFN-γ等細(xì)胞因子不足時(shí)，Th2細(xì)胞出現(xiàn)亢進(jìn)現(xiàn)象，產(chǎn)生大量IL-4[17]，進(jìn)而引起Th1/Th2 平衡失調(diào)，加重變應(yīng)性鼻炎過(guò)敏性炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜TSLP、OX40L mRNA表達(dá)量顯著升高，血清IL-4 水平升高、IFN-γ 水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組大鼠鼻黏膜TSLP、OX40L mRNA 表達(dá)量明顯下降，IL-4 水平明顯降低，IFN-γ 水平明顯升高（均P＜0.05）。提示黃芪多糖可能通過(guò)下調(diào)TSLP、OX40L mRNA表達(dá)，抑制Th2細(xì)胞分化信號(hào)，減輕變應(yīng)性鼻炎中Th2炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黃芪多糖對(duì)肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜炎性癥狀具有明顯的緩解作用，其機(jī)制可能與調(diào)控TSLP、OX40L mRNA 表達(dá)及相關(guān)細(xì)胞因子水平有關(guān)?？蔀辄S芪多糖在臨床治療變應(yīng)性鼻炎的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。