王報貴,許海波,杜 文,王 君,孫春龍,董 彬,吳 濤,方菁菁

(1.濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院,山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心,濱州市食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濱州 256603;2.濱州學(xué)院體育學(xué)院,山東濱州 256603)

泡菜是一種以新鮮蔬菜為原料經(jīng)微生物發(fā)酵而得到的食品,因口感清脆、富含礦物質(zhì)、纖維素,成為人民日常生活中不可缺少的食物[1-2]。以乳酸菌為代表的一大類益生菌在泡菜的制作中發(fā)揮著重要的角色,它們通過生成的發(fā)酵產(chǎn)物來降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH,有害菌由于在較低酸度下無法生存而被抑制或被殺死,使腸道有益菌數(shù)目良性增長,從而調(diào)節(jié)了腸道菌群的穩(wěn)定性和多樣性[1,3-4]。泡菜中的乳酸菌在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡中起著重要作用,而且具有一定治療效果,可以減輕和逆轉(zhuǎn)肝臟細(xì)胞損傷,極具臨床價值。在未來,以乳酸菌為代表的益生菌極有可能是控制腸道微生物群穩(wěn)定的安全和有效的治療工具[5-7]。

非酒精性脂肪肝病是除大量飲酒之外的其他肝損傷因素導(dǎo)致的臨床上的病理綜合征,其特點(diǎn)是肝細(xì)胞損傷[8],脂肪沉積[9],腸道菌群紊亂失調(diào)[10]。研究報道非酒精性脂肪肝病(NAFLD)會造成體內(nèi)肝脂水平升高和腸道菌群紊亂[9,11]。雖然沒有充分解釋NAFLD的發(fā)生機(jī)制,但腸道內(nèi)菌群的不平衡[12]與該疾病的發(fā)生密切相關(guān)[10]。近年來研究人員們普遍接受的說法是包括遺傳性因素、飲食因素以及代謝因素、肥胖因素等作用綜合而成的“多重打擊學(xué)說”[5,11]。所以通過改變生活方式可以在一定程度上控制NAFLD的發(fā)生和進(jìn)展,尤其是可以利用調(diào)節(jié)飲食因素。Han等[12]的研究表明發(fā)酵的泡菜可以使一些有益菌相對豐度增加,有害菌相對豐度減少,這就表明了發(fā)酵泡菜對腸道菌群的確具有有益的調(diào)節(jié)作用。陳文瀚等[13]的研究得出結(jié)論:腸道菌群這一指標(biāo)在健康人與NAFLD患者之間存在顯著差異,這種差異可以通過乳酸菌補(bǔ)充劑來減少,使癥狀有所緩解。以上報道發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌與非酒精性脂肪肝之間有密切聯(lián)系。因此,把腸道菌群作為靶點(diǎn)來研制藥物便成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療和緩解NAFLD的主要致力方向[14]。研究表明益生菌可通過調(diào)節(jié)動物腸道內(nèi)菌群的平衡,起到減輕肝脂變動物肝臟損傷和降低血脂[15],最終有助于NAFLD的控制和治療,但并未有具體的菌株報道[16-18],本文意在篩選出對NAFLD疾病防治有益的確切菌株。

鑒于此,本論文擬通過采用蛋氨酸-膽堿缺乏飼料(Methionine-choline deficient diet,MCD)喂食C57BL/6J小鼠,成功構(gòu)建NAFLD疾病小鼠模型,進(jìn)一步檢測從泡菜中分離得到的益生菌對患病小鼠腸道平衡性、脂質(zhì)沉積、肝功能和炎癥因子水平的影響,從而初步確定在泡菜中提取的益生菌對于NAFLD小鼠的腸道菌群和肝臟的作用。本研究將對證實(shí)腸道菌群可作為尋找和防治NAFLD藥物的新靶點(diǎn)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性意義,同時為未來開發(fā)和研制NAFLD的靶向治療藥物提供攻關(guān)方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無特定病原體(Specified pathogens free,SPF)級C57BL/6J雄性小鼠,7-8周齡 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司[許可證號:SCXK(魯)20140007];MCD、MCS飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司(飼料代碼為TP3005G);維持飼料 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司[許可證號:SCXK(魯)20180003];MRS固體培養(yǎng)基 生工生物工程股份有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;Slanetz-Bartley培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;GAM厭氧培養(yǎng)基 上海西寶生物科技有限公司;市售泡菜 吉林市咕咕熊食品有限責(zé)任公司;白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒 南京建成生物工程研究所;TG和TC試劑盒 日本協(xié)和醫(yī)藥診斷株式會社。

DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 中儀國科科技有限公司;BKQ-B50II型全自動高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;ZD-85型數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 成都市宜邦科析儀器有限公司;TDZ4-WS型臺式低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;GFL-70型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;DNM-9602型酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NAFLD模型的建立 采用MCD喂食C57BL/6J雄性小鼠,構(gòu)建NAFLD疾病小鼠模型。SPF級C57BL/6J雄性小鼠30只,7～8周齡,每只(20±2) g,飼養(yǎng)于本部屏障環(huán)境內(nèi),溫度22～25 ℃,濕度50%,12 h晝夜交替適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為2組:對照組(10只)和模型組(20只),模型組喂食MCD飼料,對照組喂食MCS飼料。實(shí)驗(yàn)周期為6周,期間動物自由飲水、攝食。采用肝臟蘇木精-伊紅染色(HE)、TG和TC含量測定和免疫因子測定等多種生物學(xué)方法確定脂變模型的建立[19]。

1.2.2 泡菜中益生菌的分離與鑒定 采用平板涂布法進(jìn)行分離。

1.2.2.1 分離方法 用天平精確稱取50 g泡菜樣品,加入和樣品等比例的無菌PBS緩沖液,在室溫下充分粉碎混勻,使其自然沉淀。吸取1 mL上清液放入含有9 mL PBS緩沖液的試管中,梯度稀釋至10-2～10-6濃度后,均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上。于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h后觀察菌株生長情況。

1.2.2.2 菌種的鑒定 通過分離純化,得到一株優(yōu)勢菌株,利用16S rDNA分子生物學(xué)特征鑒定。根據(jù)V3區(qū)兩端保守區(qū)設(shè)計引物,則能夠擴(kuò)增細(xì)菌V3區(qū)相對應(yīng)的可變區(qū)片段,測序分析比較來初步確定菌種的位置。設(shè)計引物為 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′,R:5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以待測菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系:pfu mix 5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0. 5 μL,ddH2O 3 μL,DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 10 min;然后于95 ℃ 10 min,55 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,擴(kuò)增30個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到目的條帶后,PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆到T載體上由英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列的測定。

1.2.2.3 系統(tǒng)樹建立方法 測序獲得的16S rRNA基因的序列,分別登錄EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/)與NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),分別進(jìn)行序列比對。系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行多序列匹配排列,使用MEGA 5.0軟件的Kimura2-parameter方法計算進(jìn)化距離,使用Neighbor-joining方法,1000次隨機(jī)抽樣,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以自引導(dǎo)值(Bootstrap)表示系統(tǒng)發(fā)育樹的可信度,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌液濃度的確定 增菌方法:將分離得到的菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基增菌,37 ℃厭氧培養(yǎng),等到對數(shù)生長期時轉(zhuǎn)種到錐形瓶里擴(kuò)大培養(yǎng),瓶底可見白色菌體沉淀。取錐形瓶中的渾濁液適量于50 mL離心管中,用臺式離心機(jī)以10000 r/min離心5 min。取出后用PBS緩沖液洗滌。后續(xù)再次離心處理,使得到的上清液與沉淀重懸,最終得到菌液。將菌液以10倍梯度稀釋至10-2～10-6濃度,涂布于MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),待菌落長出后計數(shù)并確定菌液濃度。

1.2.4 小鼠的灌胃試驗(yàn) NAFLD模型建立成功后,用于實(shí)驗(yàn)的益生菌濃度為107cfu/mL。用該濃度菌液對小鼠進(jìn)行灌胃調(diào)節(jié),連續(xù)6周。肝脂變模型組小鼠分為自然恢復(fù)組和實(shí)驗(yàn)組。對照組和自然恢復(fù)組灌胃無菌PBS緩沖液,實(shí)驗(yàn)組給予益生菌菌液灌胃,灌胃劑量0.3 mL/10 g體重/每天,每日一次,固定時間。實(shí)驗(yàn)過程中均無小鼠死亡。

1.2.5 活菌計數(shù)法選擇性培養(yǎng)小鼠腸道菌 各組小鼠的糞便每隔2周收集一次,整個實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)共收集4次糞便,分別為灌胃前、灌胃2周、灌胃4周和灌胃6周。若不當(dāng)天使用,采集的糞便應(yīng)先加入適量30%甘油保存在冰箱中。具體操作步驟如下:稱取各組糞便0.1 g于潔凈的EP管中,與0.9 mL PBS混勻后將該混合液制備成10-2～10-8不同濃度梯度的稀釋液,各取200 μL涂布于不同的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行相應(yīng)菌的培養(yǎng):a. 添加莫匹羅星的MRS瓊脂培養(yǎng)基用于雙歧桿菌的篩選(在37 ℃下厭氧孵育36 h);b. 不含L-半胱氨酸的MRS瓊脂用于乳酸桿菌的篩選(厭氧,37 ℃,24 h);c. Slanetz-Bartley培養(yǎng)基用于腸球菌的篩選(需氧,37 ℃,24 h);d. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基用于腸桿菌的篩選(需氧,37 ℃,24 h);e. 改良的岐阜厭氧(GAM)瓊脂培養(yǎng)基用于脆弱擬桿菌的篩選(需氧,37 ℃,24 h),待平板上長出菌落后,用平板菌落計數(shù)法計算每克糞便中對應(yīng)的菌落數(shù)[20]。

1.2.6 肝臟外觀和組織學(xué)觀察 在整個灌胃周期結(jié)束后,采用眼球取血法將小鼠處死,并立即對其進(jìn)行解剖。待完整分離小鼠肝臟和腹部脂肪后,將其放置于清潔平面上進(jìn)行對比觀察,拍照記錄。腹部脂肪重量=腎周脂肪重量(g)+附睪脂肪重量(g),脂肪指數(shù)(%)=腹部脂肪重量/實(shí)驗(yàn)?zāi)├鲜篌w重,觀察后將肝臟組織保存,用于后續(xù)進(jìn)行HE染色[21]。

1.2.7 血清肝功能、血脂和炎癥因子的檢測 摘眼球取血法采集的血液放在血樣室,室溫靜置30 min后,3500 r/min離心10 min,分離血清。得到的血清分別用于肝功(ALP、AST和ALT)、血脂(TG和TC)和炎癥因子(IL-6和TNF-α)的檢測,具體檢測方法參考ELISA試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究獲得的數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,兩組之間采用t檢驗(yàn)。P<0.05為顯著性差異,P<0.01為極顯著差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 NAFLD模型的建立

通過觀察外觀發(fā)現(xiàn),MCS喂養(yǎng)的對照組肝表面顏色為暗紅色、色澤鮮亮,邊緣比較清晰,沒有脂肪感(圖1A);MCD喂養(yǎng)的模型組肝臟的顏色偏黃,體積明顯變大,切面具有脂肪感(圖1B)。HE染色發(fā)現(xiàn),對照組肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰、肝小葉無異常,肝細(xì)胞呈現(xiàn)索狀排布,以放射狀環(huán)繞在中央靜脈周圍;細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞質(zhì)在胞內(nèi)分布均勻,不見脂肪滴(圖1C);MCD模型組中肝臟細(xì)胞變化明顯,細(xì)胞質(zhì)疏松;肝細(xì)胞排序混亂;細(xì)胞腫大,不見索狀排列,變圓;能看到較多的脂肪滴(圖1D)。這說明NAFLD模型建立成功,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 肝臟的外觀和HE染色

2.2 菌株鑒定

分別在EzTaxon server和NCBI中對菌株的16S rDNA基因進(jìn)行比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與待測菌株相似度最高的菌株均為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),相似度為99.02%。分別選取相似度高的模式菌株的16S rRNA基因,以AcetobacteracetiNBRC 14818T為外圍參考菌株,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖2所示,待測菌株01與LactobacillusplantarumL71T聚到一簇,因此將待測菌株鑒定為植物乳桿菌。

圖2 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 灌胃植物乳桿菌對NAFLD對小鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)的影響

圖3A表明,肝脂變小鼠灌胃植物乳桿菌后,從灌胃4周開始可顯著提高雙歧桿菌的數(shù)量,隨著灌胃時間的增加,雙歧桿菌的數(shù)量進(jìn)一步增多并顯著高于自然恢復(fù)組(P<0.05),并且灌胃第4周后實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌的數(shù)量超過對照組,說明灌胃植物乳桿菌可以促進(jìn)腸道益生菌雙歧桿菌的增殖,使其恢復(fù)到健康小鼠水平。灌胃實(shí)驗(yàn)對乳酸桿菌的數(shù)量的影響與對雙歧桿菌的影響類似(圖3B)。而通過對圖3的分析發(fā)現(xiàn)灌胃植物乳桿菌還可以降低腸球菌(圖3C)、腸桿菌(圖3D)和脆弱擬桿菌(圖3E)的數(shù)量。結(jié)果表明攝入從泡菜中提取的益生菌(植物乳桿菌)可以使腸道微生態(tài)紊亂狀態(tài)得到改善。

圖3 肝脂變小鼠灌胃植物乳桿菌對腸道菌群豐富度的影響

2.4 肝臟病理學(xué)檢測

觀察肝臟外觀發(fā)現(xiàn),正常組肝表面顏色通常是暗紅色,通體發(fā)亮,邊緣清晰,沒有脂肪感(圖4A);自然恢復(fù)組肝臟的顏色發(fā)黃,肝臟較大,切面有脂肪感,邊緣圓潤,但較之灌胃前已有所改善(圖4C)。實(shí)驗(yàn)組肝臟恢復(fù)狀態(tài)較好,呈現(xiàn)暗紅色,邊緣清晰,幾乎與正常肝臟無異(圖4B)。

圖4 肝脂變小鼠灌胃后肝臟外觀、HE染色和TG含量

由圖4可知,肝臟HE染色的對照組肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰、肝小葉無異常,肝細(xì)胞呈現(xiàn)索狀排布,以放射狀環(huán)繞在中央靜脈周圍;對照組細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞質(zhì)在胞內(nèi)分布均勻,不見脂肪滴,TG含量僅為0.83 mg/g prot,TC含量為0.47 mg/g prot;實(shí)驗(yàn)組、自然恢復(fù)組均有肝脂變情況,肝細(xì)胞變圓,排列無序,細(xì)胞質(zhì)疏松且內(nèi)含脂肪滴,自然恢復(fù)組脂肪滴較大;自然恢復(fù)組TG和TC含量分別為(2.99和1.38 mg/g prot)顯著高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)和對照組(P<0.01),實(shí)驗(yàn)組也有脂肪滴存在,但相對脂肪含量較少(TG:1.36 mg/g prot,TC:0.63 mg/g prot)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)分布均勻度比自然恢復(fù)組好,但仍次于對照組。這表明泡菜中的益生菌對肝臟病理狀態(tài)確有改善,但仍不能使肝臟內(nèi)脂質(zhì)的含量恢復(fù)到正常肝臟的水平,這很有可能是由于灌胃周期短造成的,可進(jìn)一步延長實(shí)驗(yàn)時間。

2.5 脂肪組織病理學(xué)檢測

機(jī)體內(nèi)脂肪的大小和多少是衡量機(jī)體脂肪含量的重要標(biāo)志。通過對小鼠腹部脂肪HE染色可見:實(shí)驗(yàn)組的小鼠腹部脂肪(圖5B)體積明顯小于自然恢復(fù)組(圖5C),說明實(shí)驗(yàn)組脂肪變形程度降低;但其脂肪體積略大于對照組(圖5A),說明灌胃益生菌可降低腹部脂肪體積,并使得實(shí)驗(yàn)組老鼠的腹部脂肪含量接近正常健康小鼠體內(nèi)脂肪水平(表1)。

圖5 肝脂變小鼠灌胃后腹部脂肪HE染色

表2 灌胃后小鼠血清肝功能指標(biāo)檢測

表3 灌胃后小鼠血清TG、TC、IL-6,TNF-α含量的影響

表1 灌胃后小鼠腹部脂肪含量

2.6 血清肝功能指標(biāo)檢測

灌胃6周后,實(shí)驗(yàn)組血清中ALT和AST水平與對照組不具有顯著性差異(P>0.05);但與自然恢復(fù)組相比,血清中ALT和AST水平分別降低了0.42倍和0.23倍,具有顯著性差異(P<0.05),說明灌胃植物乳桿菌能使肝脂變小鼠血清中ALT和AST基本恢復(fù)到健康小鼠血清中水平。實(shí)驗(yàn)組血清中ALP水平，與對照組相比明顯增加,具有顯著性差異(P<0.05),與自然恢復(fù)組相比其含量有著顯著性降低(P<0.05)。

2.7 對小鼠血清TG、TC、IL-6,TNF-α含量的影響

通過對血清中血脂和炎癥水平檢測發(fā)現(xiàn),肝脂變小鼠灌胃益生菌后血清中TG和TC的含量與對照組相比分別降低了0.39倍和0.38倍(P<0.05),與自然恢復(fù)組相比增加了0.59倍和0.09倍;實(shí)驗(yàn)組老鼠血清中IL-6和TNF-α的含量與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05),但與自然恢復(fù)組相比分別降低了0.39倍和0.33倍,具有顯著性差異(P<0.05)。說明MCD飲食造成血清中TG和TC水平降低,灌胃益生菌能促進(jìn)血脂水平恢復(fù)到正常健康小鼠水平,并且能使血清中炎癥因子含量降低。

3 結(jié)論和討論

在NAFLD常規(guī)治療的基礎(chǔ)上,患者服用含有乳酸菌、雙歧桿菌或枯草芽孢桿菌的益生菌可顯著降低血液中ALT、AST水平,使肝損傷和肝纖維化程度減輕[22-23]。但是未有從膳食上改善NAFLD疾病的進(jìn)展,如果通過日常膳食就可以避免NAFLD的發(fā)生將會大大降低該疾病的發(fā)生和發(fā)展。本文研究發(fā)現(xiàn)從泡菜中分離得到的植物乳桿菌可以顯著提高小鼠糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌的豐富度,降低腸球菌、腸桿菌和脆弱擬桿菌的數(shù)量;從而表明日常生活中食用泡菜對腸道菌群的紊亂有著積極作用,進(jìn)一步能增強(qiáng)腸道屏障功能的作用。實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)攝食MCD飼料的肝脂變模型小鼠體重減輕明顯,并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝脂變模型老鼠肝臟中TG和TC含量顯著高于對照組,但是血清中TG和TC含量卻明顯低于對照組,通過灌胃植物乳桿菌6周后實(shí)驗(yàn)組血清中脂質(zhì)水平雖然與自然恢復(fù)組相比有一定程度的恢復(fù),但是與對照組相比仍然未恢復(fù)到正常水平。分析原因主要是由于MCD飼料中缺乏蛋氨酸和膽堿從而導(dǎo)致了磷脂的合成受阻,而磷脂又是極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)的重要組成成分之一,磷脂的合成量減少使得肝臟中VLDL的合成和分泌量降低,導(dǎo)致了TG大劑量的積累在肝臟中而減少了運(yùn)輸?shù)窖褐?從而導(dǎo)致了肝臟內(nèi)TG水平升高、血清中TG水平的降低[24-25]。

本研究通過進(jìn)一步對血清中肝功能(ALT、ALP和AST),肝脂和血脂水平的檢測發(fā)現(xiàn)分離得到的植物乳桿菌具有減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)積累和增強(qiáng)肝功能的作用,該項(xiàng)研究與報道的副干酪乳桿菌[26]的作用相一致:副干酪乳桿菌能促進(jìn)M2型Kupper細(xì)胞的極化,減少肝脂肪沉積和血清中的ALT水平,從而改善肝功能指標(biāo)。鄭賢干等[27]的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊可以治療NAFLD,使得患者血清中IL-6和TNF-α炎癥因子的水平顯著降低,本文的研究印證了植物乳桿菌也具有降低炎癥因子的表達(dá)作用,從而保護(hù)肝臟并延緩NAFLD疾病的進(jìn)展。結(jié)果表明泡菜作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品,其在NAFLD的治療中發(fā)揮著重要作用,有著光明的開發(fā)和應(yīng)用前景。