童鈺琴,李 姝,牛曼思,王松濤,楊雪琴,孫 琴4,,*,冉茂芳

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,四川瀘州 646000;2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司,四川瀘州 646000;3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源微生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610064;4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合藥物研究中心,四川瀘州 646000)

苦蕎麥(Tartary buckwheat),學(xué)名韃靼蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.)Gaerth),是廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrom)的一種營養(yǎng)價(jià)值豐富的藥食兩用糧食作物[1]?？嗍w在中國有著悠久的食用歷史,《本草綱目》中記載其有益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣寬腸、健胃的作用?？嗍w麥中除了含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)及維生素等豐富的營養(yǎng)成分外,還含有黃酮類、酚酸、單寧、植物甾醇等生物活性物質(zhì)[2]。

中國有悠久的釀酒歷史和內(nèi)涵豐富的酒文化,酒作為人們?nèi)粘Ｉ钪械囊环N重要飲品,正逐漸成為各種社交及情感溝通的媒介[3]。近年來雖然歐洲國家的酒精性飲料消費(fèi)量略有下降,但包括中國在內(nèi)的其他國家銷量仍呈現(xiàn)上漲趨勢,因過度飲酒所帶來的個(gè)人健康及全球公共衛(wèi)生問題也受到廣泛的關(guān)注[4-5]。正常情況下,自由基及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)都是機(jī)體的正常代謝物,機(jī)體也處于氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡中,因而理性適量的飲酒不會(huì)對身體造成嚴(yán)重?fù)p害;但是長期大量的飲酒則會(huì)破壞機(jī)體的氧化還原平衡,引起機(jī)體的氧化損傷,造成機(jī)體生理功能的紊亂[6-7]。過度飲酒嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成酒精性肝損傷,進(jìn)而引發(fā)酒精性肝炎、肝臟脂肪變性、肝硬化、肝癌等病理性疾病,對機(jī)體健康造成威脅[8-9]。因此,解酒護(hù)肝產(chǎn)品的研究與開發(fā)也逐漸受到了社會(huì)各界的重視。

目前市面上的解酒產(chǎn)品多以古方中的中草藥結(jié)合現(xiàn)代化的手段來進(jìn)行開發(fā),這些產(chǎn)品以其低毒副作用等優(yōu)勢成為市場上的主流產(chǎn)品,但同時(shí)也存在活性成分不明確等問題[10]。近年來的研究表明,膳食中含有的活性物質(zhì)如黃酮、白藜蘆醇、皂苷、多糖和β-胡蘿卜素等,可通過抗氧化、抗炎、促凋亡等多種機(jī)制對酒精造成的肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[11-12]。作為植物中普遍存在的一類天然化合物,黃酮類物質(zhì)具有廣泛的生理活性,相關(guān)研究也顯示黃酮類物質(zhì)如葛根總黃酮、荷葉總黃酮等具有良好的解酒護(hù)肝功效[13-14]?？嗍w黃酮是苦蕎中主要的功能活性物質(zhì),具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性,也具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防老年癡呆等疾病的作用[15]。然而,目前國內(nèi)外關(guān)于TFTB解酒護(hù)肝的研究報(bào)道內(nèi)容較少。

本文就TFTB的體外抗氧化活性、解酒功能及對醉酒小鼠肝損傷的保護(hù)作用開展研究,以期為TFTB作為解酒功能性食品及解酒藥物的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級KM小鼠 4～5周齡,體重18～22 g,雄性,由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2018-17,小鼠于實(shí)驗(yàn)前7 d購進(jìn),并進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)。動(dòng)物房內(nèi)光線充足,通風(fēng)良好,室內(nèi)溫度(26±1) ℃,相對濕度為45%～50%,小鼠飼喂維持飼料,飲用一級動(dòng)物飲水,在飼喂期間小鼠自由進(jìn)食、飲水;苦蕎麩皮總黃酮(Total Flavonoids from Tartary Buckwheat Bran,TFTB) 總黃酮含量70.83%,實(shí)驗(yàn)室自制;兒茶素、表兒茶素、牡荊素、蘆丁、楊梅素、山奈酚-3-O蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥98%) 成都普思生物科技股份有限公司;甲醇、磷酸(色譜純) Knowles;凈品級ADS-7型大孔吸附樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、無水乙醇、冰乙酸、鹽酸、α-萘乙二胺鹽、羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na) 分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;維生素C(L-ascorbic acid,VC)、對氨基苯磺酸 上海阿拉丁試劑公司;鄰苯三酚、亞硝酸鈉 分析純,國藥化學(xué)試劑公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,DPPH) Sigma公司;38%vol濃香型白酒 瀘州老窖股份有限公司;聯(lián)苯雙酯 北京協(xié)和制藥廠;谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)試劑盒、總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒、蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程有限公司。

ME20A型萬分之一天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;LC-16型高效液相色譜儀 日本島津公司;DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;SP-756P型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;5804R型臺(tái)式高速離心機(jī) 艾本德中國有限公司;Flex Station 3型酶標(biāo)儀 美谷分子儀器有限公司;DZKW-D-4恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;MT-30K型自動(dòng)勻漿器 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;WH-861型渦旋混合器 太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TFTB的制備方法 取苦蕎麩皮適量,加入10倍量的70%食品級乙醇在60 ℃下熱回流提取3次,每次3 h,合并3次提取液,減壓濃縮至干,得苦蕎麩皮黃酮粗品。以苦蕎麩皮黃酮粗品加適量水樣品作為上樣液,通過ADS-7型大孔吸附樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,再用90%乙醇洗脫,收集洗脫液減壓濃縮至干,即得TFTB樣品。

1.2.2 TFTB黃酮組分及含量測定 參照高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)[16]測定,取TFTB樣品適量,甲醇充分溶解后,用0.22 μm微孔濾膜過濾,HPLC進(jìn)行檢測,檢測條件為:色譜柱為Intersustain C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱溫35 ℃,檢測波長280 nm;梯度洗脫的流動(dòng)相A為0.2%磷酸溶液,流動(dòng)相B為甲醇。洗脫程序:0～25 min,20%～35% B;25～40 min,35%～50% B;40～50 min,50%～90% B;50～60 min,90%～90% B。檢測完畢后與混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比。

1.2.3 體外抗氧化活性測定

其中:V1:未加清除劑時(shí)的反應(yīng)速率;V2:加入清除劑時(shí)的反應(yīng)速率。

1.2.3.2 DPPH·清除作用的測定 參照文獻(xiàn)[18-19]方法進(jìn)行測定。分別配制質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的TFTB和蘆丁溶液及VC(0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)溶液作為清除劑。分別吸取2 mL濃度為0.2 mg/mL的DPPH 50%乙醇溶液及不同濃度清除劑置于具塞試管中,搖勻,避光反應(yīng)30 min后,以無水乙醇作為參比于517 nm測定其吸光度Ai;方法同Ai操作,測定2 mL DPPH 50%乙醇溶液與無水乙醇混合反應(yīng)后吸光度Ac;方法同Ai操作,測定2 mL不同濃度清除劑及50%乙醇溶液混合后吸光度Aj。按照公式計(jì)算清除率。用清除率表示清除劑的清除能力,清除率越大表示TFTB的抗氧化性越強(qiáng)。按以下公式計(jì)算:

其中:Ai:加清除劑時(shí)DPPH·體系的吸光度;Aj:清除劑的吸光度值;Ac:未加清除劑時(shí)DPPH·體系吸光度值。

其中:Ac:未加清除劑時(shí)吸光度值;Ai:加入清除劑時(shí)吸光度值;Aj:未加NaNO2時(shí)吸光度值。

1.2.4 解酒護(hù)肝作用評價(jià)

1.2.4.1 小鼠醉酒模型的建立 通過參考文獻(xiàn)[21]制備小鼠醉酒模型,分別以0.15、0.20、0.23、0.25 mL/10 g劑量給各組小鼠一次性經(jīng)口灌胃38%vol濃香型白酒,每組10只,確定能使小鼠出現(xiàn)翻正反射消失數(shù)量最大而不出現(xiàn)死亡的劑量為最佳致醉劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在能夠保證全部小鼠醒來的情況下,使小鼠醉酒只數(shù)達(dá)到最大的最佳致醉劑量為0.20 mL/10 g。

1.2.4.2 動(dòng)物分組及給藥 取50只雄性KM小鼠,按體重隨機(jī)分為5組,每組10只。分別是醉酒模型組(0.5%的CMC-Na溶液)、陽性對照組(聯(lián)苯雙酯,150 mg/kg·bw)、TFTB低、中、高劑量組(100、200、300 mg/kg·bw)。在實(shí)驗(yàn)前先對小鼠禁食不禁水12 h,使用0.5%的CMC-Na溶解陽性藥物及TFTB,各組小鼠以0.1 mL/10 g劑量分別灌胃對應(yīng)劑量的溶媒、陽性藥物及TFTB。各組小鼠在一次性灌胃溶媒或相應(yīng)藥物后30 min按照0.20 mL/10 g劑量一次性灌胃38%vol白酒。

1.2.4.3 小鼠醉酒情況觀察 參考文獻(xiàn)[22]中方法及標(biāo)準(zhǔn)對小鼠醉酒情況進(jìn)行判定,實(shí)驗(yàn)各組小鼠灌胃白酒后,觀察小鼠的醉酒現(xiàn)象。觀察并記錄小鼠醉酒耐受時(shí)間(從灌胃白酒后到醉酒的時(shí)間)、醉睡時(shí)間(翻正反射消失持續(xù)時(shí)間),并計(jì)算小鼠的醉酒率。以翻正反射消失作為判斷小鼠醉酒的標(biāo)準(zhǔn),即當(dāng)小鼠保持背向下的姿勢30 s以上時(shí),則認(rèn)為其翻正反射消失,判定為醉酒。

1.2.4.4 血清指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)各組小鼠分別于灌胃白酒后5 h,用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉,摘眼球取血,置EP管中,在4 ℃靜置30 min后,3500 r/min離心10 min,取上層血清置另一EP管中,照谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)試劑盒說明書中方法測定小鼠血清中AST活性。

1.2.4.5 肝臟指標(biāo)測定 各組實(shí)驗(yàn)小鼠分別于灌胃白酒5 h后處死,取出肝臟,使用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗,用濾紙吸干水分后,使用天平稱重。稱重后的肝臟加入預(yù)冷的生理鹽水勻漿制備10%的肝組織勻漿液,組織勻漿液離心10 min(3000 r/min,4 ℃),取上清液分別按照相關(guān)試劑盒說明書操作,進(jìn)行SOD、MDA和蛋白含量的測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較組間差異,以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。方差齊時(shí),采用LSD法進(jìn)行兩兩比較,若方差不齊,則采用Tamhane’s法進(jìn)行兩兩比較。醉酒率比較使用卡方檢驗(yàn),以上數(shù)據(jù)由SPSS 19.0 for Windows 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFTB樣品組分的初步分析

從圖1A可以看出,在此色譜條件下,8種黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品得到較好分離,TFTB樣品溶液色譜圖中4個(gè)目標(biāo)峰的保留時(shí)間分別與標(biāo)準(zhǔn)品溶液蘆丁、山奈酚-3-O蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的色譜峰保留時(shí)間一致,其中以蘆丁相對含量最高,可達(dá)總黃酮含量的87.8%(圖1B)。

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(A)與TFTB(B)HPLC圖

2.2 體外抗氧化活性

圖2 不同添加量不同清除劑對超氧陰離子自由基的清除作用

2.2.2 對DPPH·清除效果 由圖3可知,TFTB對DPPH·具有一定的清除能力,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),TFTB對DPPH·的清除能力隨著濃度的增大而增加,呈現(xiàn)出量效關(guān)系。TFTB對DPPH·清除的IC50為0.02 mg/mL,即質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí),體系中50%的DPPH·可被清除,但TFTB清除能力弱于同質(zhì)量濃度的蘆丁。在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí),TFTB對DPPH·的清除率能夠達(dá)到90%,與蘆丁的清除作用相當(dāng),但清除能力低于VC。郭剛軍等[23]研究表明,苦蕎黃酮對DPPH·具有較好的清除能力,清除DPPH·能力隨著苦蕎黃酮質(zhì)量濃度的增大而升高,與本研究結(jié)果一致。

圖3 不同添加量不同清除劑對DPPH·的清除作用

圖4 不同添加量不同清除劑對的清除作用

注:與醉酒模型組相比,*表示具有顯著差異,P<0.05;**表示具有極顯著差異性,P<0.01。表2、表3同。

2.3 解酒護(hù)肝作用

2.3.1 防醉解酒作用 當(dāng)按照實(shí)驗(yàn)確定劑量灌胃白酒后,各組小鼠均表現(xiàn)出不同程度的醉酒現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為出現(xiàn)醉酒后的興奮狀態(tài),爬行不穩(wěn),頻繁用前肢搔頭、閉眼不動(dòng)等行為。由表1可知,在醉酒率方面,醉酒模型組有9只小鼠醉酒,醉酒率為90%,結(jié)合醉酒模型建立實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道,表明醉酒模型造模成功[22];TFTB各組醉酒率較之醉酒模型組略有降低但無顯著性差異(P>0.05)。在耐受時(shí)間方面,與醉酒模型組相比,除TFTB高劑量組外,其他組耐受時(shí)間均有不同程度的縮短,一方面可能是酒精的攝入抑制了TFTB在體內(nèi)的進(jìn)一步吸收和利用,另一方面可能是TFTB對耐受時(shí)間的延長作用存在劑量依賴性。在醉睡時(shí)間方面,與醉酒模型組對比,TFTB組及聯(lián)苯雙酯組的醉睡時(shí)間均極顯著縮短(P<0.01)。

表1 TFTB對小鼠耐受時(shí)間及醉酒時(shí)間的影響

2.3.2 TFTB對血清指標(biāo)的影響 由表2可知,與醉酒模型組對比,TFTB組與聯(lián)苯雙酯組的AST水平均顯著降低(P<0.05)。其中TFTB低劑量組降低轉(zhuǎn)氨酶的效果與目前公認(rèn)的降酶保肝藥物聯(lián)苯雙酯的作用相當(dāng),與醉酒模型組對比具有極顯著性差異(P<0.01)。

表2 TFTB對小鼠AST的影響

2.3.3 TFTB對肝臟指標(biāo)的影響 由表3知,與醉酒模型組相比,TFTB組和聯(lián)苯雙酯組肝臟中SOD活性均極顯著提升(P<0.01),但不同劑量組TFTB間無顯著的量效關(guān)系。在肝組織MDA指標(biāo)方面,與醉酒模型組對比,TFTB各組肝臟中MDA的含量均顯著降低(P<0.05)。

表 3 TFTB對小鼠SOD、MDA的影響

3 討論與結(jié)論

醉酒主要是指因大量飲酒而造成急性酒精中毒,使得機(jī)體中樞神經(jīng)呈現(xiàn)出一種興奮或抑制狀態(tài)[28]。目前開發(fā)出的解酒產(chǎn)品主要是通過抑制胃腸等消化系統(tǒng)對酒精的吸收或直接作用于肝代謝酶系而加速酒精在體內(nèi)的代謝而起到解酒效果[29]。朱振元等[30]研究葛根素的防醉解酒效果,結(jié)果顯示,葛根素能夠降低小鼠血清中的酒精濃度從而延長小鼠的醉酒耐受時(shí)間,縮短醉睡時(shí)間,具有良好的防醉解酒藥效。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明,同醉酒模型組對比,給藥300 mg/kg·bw TFTB能夠延長醉酒耐受時(shí)間(P<0.05),同時(shí)TFTB各組小鼠醉睡時(shí)間均顯著縮短(P<0.01)。結(jié)果表明,TFTB具有較好的防醉解酒作用。

AST主要存在于肝臟細(xì)胞的線粒體中,而酒精在肝臟代謝時(shí)產(chǎn)生的大量ROS將會(huì)損傷肝細(xì)胞線粒體膜及細(xì)胞膜,使得肝臟細(xì)胞中的AST大量釋放至血液中引起指標(biāo)的升高,因此血清中AST指標(biāo)的含量是判斷肝損傷的重要指標(biāo)[31]。與醉酒模型組相比,TFTB各組及聯(lián)苯雙酯組血清中AST含量均顯著降低(P<0.05),表明TFTB對小鼠酒精所致肝臟損傷具有一定的保護(hù)作用。Sun等[32]通過研究表明一種膳食類黃酮醇非瑟酮可以抑制酒精造成的氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞凋亡,脂質(zhì)蓄積進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對肝臟的保護(hù)作用,因此TFTB對肝臟的保護(hù)作用可能與其體內(nèi)抗氧化活性有關(guān)。

SOD在機(jī)體中的主要功能是清除體內(nèi)的自由基,其在一定程度上反映了氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。酒精的刺激會(huì)造成肝臟中的SOD活性水平下降,導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的氧化還原平衡的破壞[33]。MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,可使核酸、蛋白質(zhì)等大分子出現(xiàn)交聯(lián)或斷裂而影響細(xì)胞的正常生理活性,因此,MDA水平是脂質(zhì)過氧化損傷的標(biāo)志性產(chǎn)物,反映了活性氧對肝臟的損傷程度;酒精的攝入導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加,從而會(huì)引起肝臟中MDA含量的升高[33-34]。肝組織指標(biāo)測定結(jié)果顯示,與醉酒模型組對比,TFTB各組小鼠肝臟中SOD活力均極顯著提升(P<0.01),且肝臟中MDA的含量均顯著降低(P<0.05)。相關(guān)研究結(jié)果顯示,黃酮類化合物可通過抑制氧化應(yīng)激,改善脂質(zhì)代謝,減輕線粒體損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式改善肝臟損傷[35]。也有研究表明蘆丁可以減輕t-BHP誘導(dǎo)的小鼠肝臟的氧化應(yīng)激損傷,有助于由氧化應(yīng)激引起的相關(guān)疾病的預(yù)防和治療[36]。而蘆丁作為TFTB中主要的黃酮化合物,其作為一種膳食因子可能有助于改善機(jī)體細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。這提示TFTB對酒精造成肝損傷的保護(hù)作用可能是通過提高小鼠體內(nèi)SOD酶活力加速細(xì)胞對自由基的清除并抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進(jìn)而改善了氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。