杜靈敏,付鴻博,2,杜俊杰,王鵬飛,穆霄鵬,張建成,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,山西太谷 030801;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,鄉(xiāng)村振興科技研究所,黑龍江哈爾濱 150000)

人體中不斷產(chǎn)生的自由基是人體進行新陳代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[1]。正常生理情況下,自由基處于動態(tài)平衡,維持機體健康[2],但當(dāng)自由基過量積累時,則會造成各種不可逆的氧化損傷[3],表現(xiàn)出疾病、衰老等狀態(tài)?；ㄉ帐悄壳把芯枯^多的有強抗氧化活性的一類功能因子,具有抗衰老、抗癌、抑菌、心血管保護等功能[4-9]。

歐李主要分布于我國的黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、山西等13個省區(qū)[10]。其果實顏色豐富,具有黃色,紅色、粉紅色,紫色和紫黑等多種顏色類型,花色苷色素含量較高。在對紅樹莓、越橘、李[11-13]等的研究中發(fā)現(xiàn),花色苷對衰老小鼠有較好的保護作用,但關(guān)于歐李果實花色苷對衰老小鼠保護作用的研究較少,因此本研究選用紅底紅肉型的‘農(nóng)大4號’歐李果實為試驗材料,D-半乳糖構(gòu)建氧化損傷小鼠模型,以此探究歐李果實花色苷對衰老小鼠的保護作用,旨在為歐李果實花色苷在食藥方面的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR雄性小鼠60只,體重18～22 g 購自山西醫(yī)科大學(xué),動物合格證:SCXK(晉)2015-001;‘農(nóng)大4號’歐李果實 采于2018年9月山西省太谷縣巨鑫試驗基地;總抗氧化能力(total superoxide dismutase,T-AOC)試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒 購于南京建成生物工程研究所;蛋白濃度測定試劑盒、D-半乳糖、維生素E(VE) 購于Solarbio公司;無水乙醇(分析純)≥99% 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

JJ224BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;SB25-12D超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司;HC-2518R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;Infinite F50酶標(biāo)儀 Tecan Austria Gmbh。

1.2 實驗方法

1.2.1 花色苷制備 參考本團隊前期采用制備‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷的方法[14]。稱取一定量‘農(nóng)大4號’歐李果實,液氮研磨,按照料液比1∶5 (g/mL),加入體積分?jǐn)?shù)為90%(pH=2.0)乙醇溶液,超聲提取10 min,超聲功率800 W,于10000×g下離心30 min,提取2次,合并上清液,得到粗提液,花色苷含量為24.21 mg/100 g。粗提液蒸發(fā)濃縮后通過AB-8大孔樹脂吸附至飽和后先用蒸餾水洗至流出液為中性,再用體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇洗脫,當(dāng)流出液為無色時洗脫完成,收集洗脫液。洗脫液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后經(jīng)冷凍干燥,得到歐李‘農(nóng)大4號’精制花色苷。

1.2.2 試驗設(shè)計 動物實驗根據(jù)抗氧化功能評價方法進行設(shè)計[15]。

1.2.2.1 分組方法 進行一周適應(yīng)性飼喂后,將60只小鼠按體重隨機分為6組,每組10只,分別為空白組,模型組,維生素E(VE)組,花色苷高、中、低劑量組。

1.2.2.2 氧化損傷方法 除空白組外,其余各組按照500 mg·(kg·d)-1的劑量頸部皮下注射D-半乳糖,注射體積為0.01 mL·g-1,空白組注射等量的生理鹽水,注射體積為0.01 mL·g-1,連續(xù)注射30 d。

1.2.2.3 給藥方法 造模同時,花色苷高、中、低劑量組按500、250、125 mg·(kg·d)-1的劑量灌胃花色苷,VE組按20 mg·(kg·d)-1劑量灌胃VE,空白組和模型組灌胃生理鹽水,灌胃體積為0.01 mL·g-1,連續(xù)灌胃30 d。試驗期間,所有小鼠不限制進食和飲水。

1.2.3 樣品的采集 末次灌胃后,所有小鼠禁食不禁水12 h,之后摘眼球取血,斷頸處死,迅速解剖取出小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟等組織,隨后用預(yù)冷生理鹽水制備10%的組織勻漿,4 ℃,3500 r·min-1,離心10 min取上清液。血清及組織勻漿上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.4 指標(biāo)測定 記錄小鼠處死前體重為m0,小鼠斷頸處死后,取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟,洗去浮血,稱重,記為m1,根據(jù)公式算出小鼠各臟器指數(shù);按試劑盒操作測定小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟以及血清的MDA、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷對衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

由表1可知,與空白組相比,模型組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)顯著低于空白組(P<0.05)。與模型組相比,高劑量組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)顯著高于模型組(P<0.05),VE對照組、中劑量的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)高于模型組,但無顯著差異(P>0.05)。各組的心臟指數(shù)和肺臟指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。說明,花色苷高劑量組對小鼠臟器有較強的保護性。

表1 歐李‘農(nóng)大4號’花色苷對小鼠臟器指數(shù)的影響(n=10)

2.2 ‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷對衰老小鼠血清及臟器中MDA含量的影響

由表2可知,與空白組相比,模型組血清及各臟器MDA含量均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,各組小鼠的MDA含量均有不同程度的下降,其中除低劑量組的心臟、肝臟、脾臟以及中劑量組的心臟、脾臟外,其余各組臟器的MDA含量及各組血清的MDA含量與模型組相比均有顯著差異(P<0.05)。高劑量組與VE對照組血清及各臟器的MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。表明,花色苷高劑量組能顯著降低衰老小鼠血清及各臟器組織中MDA含量。

表2 歐李‘農(nóng)大4號’花色苷對小鼠血清及臟器組織中MDA含量的影響(n=10)

2.3 ‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷對衰老小鼠血清及臟器中T-AOC含量的影響

由表3可知,模型組血清及各臟器T-AOC含量顯著低于空白組(P<0.05)。與模型組相比,VE對照組和高劑量組血清及各臟器T-AOC含量以及中劑量組的肝臟和脾臟均顯著高于模型組(P<0.05)。高劑量組肝臟的T-AOC含量顯著高于VE對照組(P<0.05),血清、心臟、脾臟的T-AOC含量無顯著差異(P>0.05),腎臟的T-AOC含量顯著低于VE對照組(P<0.05)。表明,花色苷高劑量組能顯著提高衰老小鼠血清及各臟器組織中的T-AOC含量。

表3 歐李‘農(nóng)大4號’花色苷對小鼠血清及臟器中T-AOC含量的影響(n=10)

2.4 ‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷對衰老小鼠血清及臟器中SOD活性的影響

由表4可知,與空白組相比,模型組血清及各臟器SOD活性均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,VE對照組、高劑量組的血清和各臟器以及中劑量組的脾臟、腎臟,低劑量組的脾臟的SOD活性均顯著高于模型組(P<0.05)。

表4 歐李‘農(nóng)大4號’花色苷對小鼠血清及臟器SOD活性的影響(n=10)

高劑量組肝臟的SOD活性顯著高于VE對照組(P<0.05)。說明,花色苷高劑量組能顯著提高衰老小鼠血清及各臟器組織中的SOD活性。

2.5 ‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷對衰老小鼠血清及臟器中CAT活性的影響

由表5可知,與空白組相比,模型組血清及各臟器CAT活性均顯著低于空白組(P<0.05)。與模型組相比,VE對照組和高劑量組血清和各臟器以及中劑量組血清、心臟、腎臟CAT活性顯著高于模型組(P<0.05)。高劑量組心臟、肝臟CAT活性顯著高于VE劑量組(P<0.05)。說明,花色苷高劑量組能顯著提高衰老小鼠血清及各臟器組織中的CAT活性。

表5 歐李‘農(nóng)大4號’花色苷對小鼠血清及臟器CAT活性的影響(n=10)

2.6 ‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷對衰老小鼠血清及臟器中GSH-Px活性的影響

由表6可知,與空白組相比,模型組血清及各臟器GSH-Px活性均顯著低于空白組(P<0.05)。與模型組相比,高劑量組和中劑量組血清和各臟器以及VE對照組的血清、心臟、腎臟GSH-Px活性顯著高于模型組(P<0.05)。與VE對照組相比,高劑量組血清、肝臟、脾臟GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。說明,花色苷高劑量組能顯著提高衰老小鼠血清及各臟器組織中的GSH-Px活性。

表6 歐李‘農(nóng)大4號’花色苷對小鼠血清及臟器GSH-Px活性的影響(n=10)

3 討論

頸部皮下注射D-半乳糖是建造氧化損傷模型的經(jīng)典方法[17],半乳糖在醛糖還原酶催化下,還原成半乳糖醇,堆積在細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞腫脹,引起自由基堆積、抗氧化物質(zhì)活性降低、機體免疫力降低等現(xiàn)象,最終導(dǎo)致衰老[18-19]。脾臟作為重要的免疫器官,肝臟、腎臟作為動物重要的代謝器官,若重量降低,可直接影響機體免疫和動物代謝能力[20]。本研究得出,與模型組相比,高劑量組脾臟、肝臟、腎臟指數(shù)都顯著高于模型組(P<0.05),說明‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷有延緩臟器萎縮,提高免疫力的作用。

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,被認(rèn)為是衰老的指標(biāo),MDA含量隨衰老而增加[20]。包曉瑋等[21]在沙棘多糖對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用的研究中,通過皮下注射D-半乳糖建造衰老模型,得出模型組與空白組相比,小鼠的肝臟、腦組織勻漿及血清中的MDA均增加,表明建模成功。羅磊等[16]研究表明,通過注射D-半乳糖,模型組小鼠血清和臟器的MDA顯著高于空白組,表明抗衰老模型建造成功。本研究通過頸部注射D-半乳糖,最后得出模型組的血清及各臟器的MDA均顯著高于空白組(P<0.05),表明抗衰老模型建立成功。也有研究表明[22-23],SOD的降低也可表示D-半乳糖衰老模型的建立成功。本研究中,空白組血清及各臟器SOD顯著高于模型組(P<0.05),也可以說明衰老模型建造成功。

MDA是不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物之一,其含量的高低可反映過氧化程度的強弱,降低MDA是抗氧化研究中的一個重要機制[24]。T-AOC代表體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)的綜合[25]。SOD對超氧陰離子自由基具有清除作用,進而減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[16,26]。GSH-Px可以催化GSH 還原過氧化物,終止自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[27]。CAT可以使過氧化氫還原成水和分子氧,清除過氧化氫[28-29]。

本研究得出,與模型組相比,各組小鼠的MDA均有不同程度的下降,其中除低劑量組的心臟、肝臟、脾臟以及中劑量組的心臟、脾臟外,其余各組臟器的MDA及各組血清的MDA均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);VE對照組和高劑量組血清及各臟器T-AOC均顯著高于模型組(P<0.05);VE對照組、高劑量組血清及各臟器SOD均顯著高于模型組(P<0.05);高劑量組和中劑量組血清及各臟器GSH-Px顯著高于模型組(P<0.05);VE對照組和高劑量組血清及各臟器和中劑量組血清、心臟、腎臟CAT顯著高于模型組(P<0.05)。在以往研究中心,‘黑美人’土豆色素[30]、黑豆花色苷[31]、荔枝果皮花色苷[32]和紅樹莓花色苷[11]等作用于衰老小鼠,發(fā)現(xiàn)花色苷增加了小鼠血清及各臟器組織中SOD、CAT、GSH-Px活性,降低了MDA含量,這與本實驗結(jié)果相似?；ㄉ兆鳛槎喾恿u基的黃酮類化合物,可能一方面可以螯合作為自由基反應(yīng)的催化劑的過渡金屬元素如Fe、Cu等,抑制脂質(zhì)過氧化,阻止脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[33],另一方面通過提高機體總抗氧化能力、提高過氧化酶活力等清除機體中有害物質(zhì),從而間接或直接的增強機體清除自由基和抗氧化能力[34-37],減緩小鼠衰老。

4 結(jié)論

本試驗采用D-半乳糖構(gòu)建小鼠氧化損傷模型的方法,進行‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷對衰老小鼠保護作用研究中,得出‘農(nóng)大4號’歐李果實花色苷可以降低小鼠體內(nèi)的MDA的積累,提高組織的T-AOC,CAT、GSH-Px,SOD活性,減緩小鼠衰老,為后續(xù)歐李果實花色苷在功能農(nóng)業(yè),食藥方面的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)和理論支持。