楊曉聰,劉正才,,*,呂佳樂(lè),林永輝,王丹紅,姚閩娜

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.福州海關(guān)技術(shù)中心,福建福州 350001;3.福州廣電計(jì)量檢測(cè)有限公司,福建福州 350001)

紫杉醇(Paclitaxel)是從紫杉樹皮中分離提取的二萜類天然化合物,可作用于微管蛋白,使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,從而抑制腫瘤細(xì)胞繁殖,因此具有獨(dú)特的抗腫瘤作用[1]。紅豆杉是世界上公認(rèn)瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物,也是紫杉醇提取分離的唯一來(lái)源。目前已從紅豆杉屬植物分離鑒定出20余種黃酮類及雙黃酮類功效成分化合物,并被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)[2],另外由于紅豆杉中可提取“紫杉醇”并用于治療癌癥,因此有很多人用紅豆杉果、樹皮、木片為原料制作紅豆杉保健酒[3]。紅豆杉保健酒含有的紫杉醇具有骨髓抑制、神經(jīng)毒性、心臟毒性、肝臟毒性,大量服用會(huì)有抑制骨髓造血功能、白細(xì)胞下降等副作用[4-6],紅豆杉泡酒導(dǎo)致中毒的事故時(shí)有發(fā)生。原國(guó)家衛(wèi)生部下發(fā)的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》里已經(jīng)將紅豆杉列入保健品禁用物品名單,禁止將紅豆杉作為保健食品和食品原料使用。而目前對(duì)市場(chǎng)上非法銷售的紅豆杉酒的鑒定只是從標(biāo)識(shí)和外觀上進(jìn)行簡(jiǎn)單的識(shí)別,尚未有科學(xué)的鑒定方法,故在監(jiān)管上存在一定程度的漏洞,讓不法商家有機(jī)可乘,為保健酒的安全埋下了隱患。因此,除了各地衛(wèi)生部門要加大監(jiān)督檢查力度,嚴(yán)肅查處生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)含紅豆杉食品的行為外,開發(fā)相關(guān)的檢測(cè)和鑒定方法也是十分必要的。

常用紫杉醇的檢測(cè)方法有分光光度法[7]、高效液相色譜法[8-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-14]等。分光光度法在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中由于色素等雜質(zhì)干擾導(dǎo)致定量準(zhǔn)確性差、重現(xiàn)性低;高效液相色譜法對(duì)分離度要求高,分析時(shí)間較長(zhǎng);液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于高通量、高選擇性的優(yōu)勢(shì),已成為分析檢測(cè)紫杉醇化合物的主要手段。目前紫杉醇的分析主要集中在紫杉醇藥用研究[15-18]、提取與合成生產(chǎn)研究[19-24]、以及生物制品上的檢測(cè)[25-29],尚未發(fā)現(xiàn)保健食品中紫杉醇含量測(cè)定的研究。

本文選取紫衫烷中最常見(jiàn)的紫杉醇為研究對(duì)象,并對(duì)凈化條件和質(zhì)譜、色譜檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健酒中紫杉醇的含量,該方法靈敏度高、選擇性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可對(duì)保健酒的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和檢測(cè)提供一定的參考依據(jù),為識(shí)別和鑒定紅豆杉保健酒提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆杉材料(根、莖、葉、果) 福建省寧德市古田縣卓洋鄉(xiāng)杉洋鎮(zhèn)紅豆杉林(海拔800 m);實(shí)驗(yàn)用中藥材浸泡保健酒、紅豆杉果酒 福建省食品藥品檢驗(yàn)研究院日常抽檢產(chǎn)品;紫杉醇對(duì)照品(CAS No.:33069-62-4) 純度大于98.0%,北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;乙腈、甲醇、丙酮 色譜純,Fisher Scientific科技公司;甲酸 色譜純,德國(guó)Merck公司;實(shí)驗(yàn)用超純水 美國(guó)Milli-Q超純水系統(tǒng)。

API5500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Biosystems公司;XK80-A旋渦混合器 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司;HN200多功能氮吹儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;Milli-Q純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;石墨化炭黑固相萃取小柱250 mg/3 mL 德國(guó)CNW科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取紫杉醇對(duì)照品約5 mg,用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃避光儲(chǔ)存。移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液,再根據(jù)需要配制成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 供試品溶液的制備 移取1 mL保健酒樣品,置于10 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻后移取1 mL至預(yù)先用3.0 mL二氯甲烷-丙酮(70∶30,V/V)和3.0 mL甲醇活化的石墨化炭黑固相萃取小柱中,再用3.0 mL水和3.0 mL甲醇-水溶液(50∶50,V/V)分別淋洗,棄去流出液,移取3.0 mL二氯甲烷-丙酮(70∶30,V/V)進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,于45 ℃下用氮?dú)鉂饪s儀吹干。準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇-水(5∶5,V/V)溶解殘?jiān)?過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電離模式:電噴霧電離正離子模式;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;紫杉醇母離子m/z 854.5;定量離子m/z 286.0,碰撞能量25 eV;定性離子m/z 569.3,碰撞能量15 eV;去簇電壓100 v;離子源噴霧電壓(Ionspray Voltage):5000 v;氣簾氣壓力(Curtain Gas):0.275 MPa;離子源溫度(Temperature):500 ℃;霧化氣壓力(Gas 1):0.345 MPa;加熱輔助氣壓力(Gas 2):0.345 MPa。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱:Luna? C8100A(150 mm×2 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A為0.2%甲酸水溶液,B為乙腈;梯度洗脫程序:0～5 min,15% B線性升至90% B;5～7 min,90% B不變;7～8 min B線性降至15%,保持2 min。流速:0.3 mL/min。進(jìn)樣量:5 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2010軟件、Origin 8.0軟件和ChemDraw 18.0軟件進(jìn)行繪圖和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以針泵進(jìn)樣的方式把紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)液注入質(zhì)譜儀中優(yōu)化質(zhì)譜條件。首先確定母離子和選擇離子檢測(cè)模式,分別考察了紫杉醇在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)的響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)紫杉醇在ESI正、負(fù)離子模式掃描都能出峰,ESI負(fù)離子模式時(shí)母離子為m/z 852.5,ESI正離子模式時(shí)有加氫離子峰m/z 854.5和加鈉離子峰m/z 876.4,經(jīng)MRM模式測(cè)試,m/z 854.5的響應(yīng)值明顯高于m/z 852.5和m/z 876.4,且m/z 876.4出峰不穩(wěn)定,因此本實(shí)驗(yàn)選擇ESI正離子模式,母離子為m/z 854.5。確定目標(biāo)母離子后,再對(duì)母離子施加一定的碰撞能量,使其產(chǎn)生特定的子離子,然后優(yōu)化各化合物二級(jí)質(zhì)譜的源內(nèi)碎裂電壓、碰撞氣能量(CE)等參數(shù),得到二級(jí)質(zhì)譜圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)離子碎片掃描質(zhì)譜圖以及可能的裂解方式

2.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 紫杉醇是一種含五甲基十五碳烯骨架的二萜類化合物,極性較弱,在以弱極性或非極性固定相的反向色譜柱中均有較好的保留,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)比較了紫杉醇在不同型號(hào)C18和C8色譜柱上的保留情況,實(shí)驗(yàn)考察了Luna? C8100A(150 mm×2 mm,3 μm)、Luna? C18(150 mm× 2 mm,3 μm)和具有核-殼技術(shù)的Kinetex? C18(150 mm×2 mm,2.6 μm)3種色譜柱的分離效果(見(jiàn)圖2),結(jié)果表明,紫杉醇在Luna? C18柱上峰型較寬,Kinetex? C18柱上峰型窄,但前端有小的分叉峰,因此選擇Luna? C8100A(150 mm×2 mm,3 μm)色譜柱作為分析柱,沒(méi)有雜質(zhì)干擾且峰型較好。

圖2 紫杉醇在不同色譜柱上的分離效果圖

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 分別考察了以乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相的測(cè)定結(jié)果,結(jié)果表明,以乙腈/水為流動(dòng)相時(shí),質(zhì)譜信號(hào)較好。又考察了當(dāng)使用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-5 mmol/L乙酸銨含0.2%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)紫杉醇的分離和響應(yīng)情況(見(jiàn)圖3)。試驗(yàn)結(jié)果表明,流動(dòng)相中加酸有改善峰型,增強(qiáng)響應(yīng)值的作用;加入少量的乙酸銨對(duì)紫杉醇的響應(yīng)值影響不大,甚至有抑制作用。為取得較高的靈敏度,選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相,同時(shí)采用梯度洗脫法取得了較好分離效果。

圖3 紫杉醇在不同流動(dòng)相的分離效果圖

2.3 樣品前處理

由于保健酒中通常含有30%～60%的乙醇,而乙醇對(duì)紫杉醇有很好的溶解性,除此之外,保健酒當(dāng)中的色素、糖類、中藥成分在提取過(guò)程中可能會(huì)被一同提取出來(lái)[30-31],污染色譜和質(zhì)譜系統(tǒng)的同時(shí)也會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成極大的干擾,因此必須選擇合適的凈化方法。試驗(yàn)采用移取相同體積的空白基質(zhì)配制200 ng/mL的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別用SPE(C18小柱和石墨化炭黑柱)凈化、QuEChERS凈化以及直接稀釋進(jìn)樣法這四種凈化方法凈化后測(cè)定,考察不同凈化方法對(duì)響應(yīng)值的影響(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明,C18柱凈化時(shí)易堵塞,流速慢,耗時(shí)最長(zhǎng);QuEChERS凈化回收率偏低,重復(fù)性差;直接稀釋進(jìn)樣法對(duì)色譜柱不利,且不能去除大部分色素;GCB柱是去除色素時(shí)常用的小柱,且能用低沸點(diǎn)的丙酮-二氯甲烷洗脫目標(biāo)物,有利于后續(xù)氮吹濃縮步驟,提高檢測(cè)效率,實(shí)驗(yàn)采用先稀釋10倍降低樣液中乙醇的比例,再用石墨化炭黑柱凈化,取得了較好的效果。

表1 紫杉醇在不同凈化條件下的凈化回收率(n=4)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

保健酒基質(zhì)中含有色素、中藥類和糖類等成分,基質(zhì)成分較為復(fù)雜,因此需要考慮消除基質(zhì)效應(yīng)所帶來(lái)的影響。根據(jù)Matuszewski等[32]的研究,本試驗(yàn)采用陰性藥酒來(lái)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列),用定容液配制同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比來(lái)考察化合物的基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明保健酒中紫杉醇曲線比值為90.5%,基質(zhì)抑制率為9.5%,而一般認(rèn)為,基質(zhì)曲線響應(yīng)值與其標(biāo)準(zhǔn)曲線響應(yīng)值的比值在85%～115%之間時(shí)不存在基質(zhì)效應(yīng),因此基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)定量影響不大,本方法可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量的影響。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系 按本文方法配制一條系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在選定的色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以目標(biāo)組分峰面積(y)對(duì)目標(biāo)組分的質(zhì)量濃度(x,μg/L)作線性回歸分析,得到線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明,紫杉醇在1～100 μg/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,計(jì)算得回歸方程y=474.63x+1.10×103,決定系數(shù)(R2)為0.9994,適合定量分析。

2.5.2 檢出限與定量限測(cè)定結(jié)果 在保健酒空白樣品中加入不同量的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品后,稀釋后進(jìn)行測(cè)定,對(duì)紫杉醇的檢出限和定量限進(jìn)行評(píng)估,以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限(LOD),計(jì)算檢出限為3.0 μg/L;以10倍信噪比(S/N=10)為定量限(LOQ),計(jì)算定量限為10.0 μg/L。

2.5.3 回收率和精密度 取空白保健酒作為添加回收試驗(yàn)的基質(zhì),進(jìn)行添加回收率和精密度的試驗(yàn)。加標(biāo)水平分別為10.0、50.0、100.0 μg/L,按1.2.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理,在1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)加標(biāo)水平做6組平行試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2,紫杉醇在10.0、50.0和100.0 μg/L 3個(gè)水平下的平均加標(biāo)回收率為88.9%～92.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為7.8%～9.5%。

表2 保健酒中紫杉醇藥物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率(n=6)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本文所建立的方法,對(duì)15批市售含有枸杞、人參、葛根、桂圓等中藥材浸泡保健酒樣品中紫杉醇進(jìn)行測(cè)定,均未檢出;從淘寶網(wǎng)上購(gòu)得2批次紅豆杉果酒,均有檢出紫杉醇,且含量均超過(guò)方法定量限的100倍以上,其結(jié)果見(jiàn)表3,說(shuō)明該方法特異性強(qiáng),能夠簡(jiǎn)單有效識(shí)別保健酒中非法使用紅豆杉的行為;同時(shí)為了解用紅豆杉不同部位泡制的保健酒中紫杉醇的溶出情況,分別取紅豆杉的根、皮、果、葉各10 g,分別裝入250 mL的棕色容量瓶中,用70%甲醇水定容至刻度,密封避光浸泡30 d后,搖勻,分別取適量上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,再用水稀釋20倍,然后移取1 mL過(guò)GCB柱凈化,UPLC-MS/MS分析,其結(jié)果見(jiàn)圖4,實(shí)驗(yàn)表明,紅豆杉的根、皮、果、葉泡酒均會(huì)浸出大量的紫杉醇,根部浸泡出的紫杉醇含量最高,風(fēng)險(xiǎn)最高,而葉子含量最低,該結(jié)論與文獻(xiàn)[33]報(bào)道一致。

圖4 紅豆杉中不同部位浸泡出紫杉醇的含量(浸泡液70%甲醇)

表3 市售17批保健酒樣品信息以及紫杉醇含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

通過(guò)色譜質(zhì)譜條件、前處理?xiàng)l件和SPE條件的優(yōu)化,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定保健酒中紫杉醇含量的方法。該法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高,通過(guò)SPE的凈化可以去除大部分色素等雜質(zhì),方法特異性強(qiáng)、干擾因素少,可滿足復(fù)雜基質(zhì)保健酒中紫杉醇含量測(cè)定的要求。該方法的建立對(duì)保健酒中紫杉醇的檢測(cè)提供依據(jù),同時(shí)也對(duì)保健酒的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和評(píng)估具有重要的意義。