謝麗源,蘭秀華,彭衛(wèi)紅,甘炳成,*

(1.四川農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,四川成都 610066;2.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院信息生物學(xué)研究中心,四川成都 610054)

羊肚菌(Morchellaspp.),隸屬子囊菌門(Ascomycota)、盤菌綱(Pezizomycetes)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)[1],是一種珍稀名貴食(藥)用菌,由于其菌蓋表面有不規(guī)則多面凹陷皺褶似羊肚而得名。羊肚菌因含有5′-核苷酸、有機(jī)酸、可溶性糖和氨基酸等多種非揮發(fā)性呈味物質(zhì),使其味道鮮美[2],同時(shí),羊肚菌也是重要的藥用菌,含有多糖、生物酶類、鈣、鋅、鐵等多種礦物質(zhì)等[3-4],具有抗氧化[5-8]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[9]、抗疲勞[9-10]、抑制腫瘤[9-10]、抗菌[11-12]、降血脂[13]等多種功效。

隨著羊肚菌馴化栽培技術(shù)的日趨成熟,羊肚菌種植區(qū)域范圍越來越廣,而不同的生態(tài)條件、種植方式,以及不同的基因型品種等都是影響羊肚菌等食用菌呈味物質(zhì)的關(guān)鍵因素[3,6],而目前對(duì)羊肚菌非揮發(fā)呈味物質(zhì)研究鮮有報(bào)道,對(duì)于不同生態(tài)條件對(duì)呈味物質(zhì)的影響在食用菌尤其羊肚菌中研究更為少見。

本研究以同一遺傳背景、相同配套栽培方式,在四川不同生態(tài)環(huán)境馴化栽培的羊肚菌樣品為研究對(duì)象,分析不同產(chǎn)地羊肚菌非揮發(fā)呈味物質(zhì)間的差異,并通過主成分分析(Principal cluster analysis,PCA)和聚類分析(Cluster analysis,CA)表征生態(tài)環(huán)境對(duì)羊肚菌品質(zhì)差異,旨在為不同產(chǎn)區(qū)樣品的辨別和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌 分別采集不同生態(tài)環(huán)境、相同遺傳背景(梯棱羊肚菌)、同一栽培基質(zhì)(麥粒30%(下層)、木屑與土壤(體積比1∶1混合)70%(上層))和栽培方式(水旱輪作),來源見表1;可溶性糖、糖醇、有機(jī)酸、5′-核苷酸、混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;乙腈、甲醇 均為色譜純,奧克生物科技有限公司。

表1 樣品來源

Fw-80高速粉碎機(jī) 北京啟宏瑞達(dá)科技有限公司;DZF-6020真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超純水裝置 Millipore公司;L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本Hitachi公司;ALC-Z10.3電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;UV1800分光光度計(jì)、LC-20 高效液相色譜儀 日本島津公司;ICS2500離子色譜儀、CarboPac PA-20陰離子交換分析柱、CarboPac MA1陰離子交換柱,美國(guó)Dionex公司 Green ODS-AQ C18色譜柱,上海易創(chuàng)儀器分析有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 羊肚菌采集后經(jīng)過挑選、烘干,粉碎后密封待用。

1.2.2 氨基酸測(cè)定 稱取100 mg樣品粉末加入水解管中,加入100 mL 6 mol/L的鹽酸,封管后,于100 ℃水解24 h,水解后樣品經(jīng)處理后通過氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸分析[14],測(cè)定3次。

1.2.3 可溶性糖、糖醇含量的測(cè)定 可溶性糖提取:取500 mg羊肚菌粉末,加入50 mL 80%乙醇,搖勻后于30 ℃搖床振搖45 min,抽濾。將濾渣用80%乙醇沖洗3次,取濾液于55 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,超純水定容至10 mL。將樣品12000 r/min離心10 min后進(jìn)行一定濃度的稀釋,上清液過0.22 μm微孔濾膜,過離子色譜儀進(jìn)行檢測(cè)[15-16],測(cè)定3次。

可溶性糖的檢測(cè)條件:單糖:CarboPac PA20陰離子交換分析柱(150 mm×3 mm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相為0.25 mol/L NaOH,流速為0.45 mL/min,進(jìn)樣量25 μL;可溶性糖醇:CarboPac MA1陰離子交換柱(4 mm×250 mm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相為0.48 mol/L NaOH,流速為0.4 mL/min,進(jìn)樣量25 μL,測(cè)定3次。

1.2.4 有機(jī)酸檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取500 mg羊肚菌干粉,加入50 mL 0.1 mol/L鹽酸,60 ℃、120 r/min振搖60 min提取有機(jī)酸。待冷卻后將提取液12000 r/min離心15 min,上清液過0.22 μm微孔濾膜由高效液相色譜儀檢測(cè)。色譜條件:Green ODS-AQ C18色譜柱(250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為10 mmol/L KH2PO4緩沖鹽,pH2.8,流速1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL[15],測(cè)定3次。

1.2.5 5′-核苷酸檢測(cè) 取羊肚菌干品1 g,加入25 mL蒸餾水,煮沸1 min,冷卻至室溫后于12000 r/min 離心15 min,取出上清液,廢渣以相同方法重提一次,合并上清液,定容至50 mL。取上清液過0.22 μm微孔濾膜,高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件:C18柱(250 mm×4.6 mm),流動(dòng)相:KH2PO4緩沖液 0.5 mL/min,259 nm紫外掃描檢測(cè),柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL[17-18],測(cè)定3次。

1.2.6 等鮮濃度值計(jì)算 等鮮濃度值(equivalent umami concentration,EUC)常用來表征食品的鮮味程度,指在100 g干重的食物中,以谷氨酸鈉(MSG)的量來表示呈鮮物質(zhì)的總量[19-21],計(jì)算公式為:

Y=∑aibi+1218(∑aibi)(∑ajbj)

式中:Y:EUC值,單位是g MSG/100 g;ai:呈鮮氨基酸(天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;aj:呈鮮核苷酸[5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鳥苷酸(5′-GMP)、5′-黃苷酸(5′-XMP)、5′-腺苷酸(5′-AMP)]的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;bi:呈鮮氨基酸相對(duì)MSG的鮮味程度值(Glu=1,Asp=0.077);bj:呈味核苷酸相對(duì)5′-核苷酸的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18);1218:協(xié)同作用常數(shù),g/100 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22.0 對(duì)羊肚菌呈味物質(zhì)進(jìn)行顯著性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌鮮味游離氨基酸含量

天門冬氨酸和谷氨酸是食用菌鮮味的基本組成成分。食用菌所產(chǎn)生的鮮味是由谷氨酸鹽和呈味核苷酸共同作用的結(jié)果,它們使食用菌產(chǎn)生了各自特有的味道。不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌子實(shí)體兩種氨基酸測(cè)定結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出不同生態(tài)環(huán)境條件下馴化栽培羊肚菌游離氨基酸含量差異較大,天門冬氨酸含量為1.168%～2.828%,谷氨酸含量為2.307%～5.505%,且含量變化沒有隨著生長(zhǎng)環(huán)境不同呈現(xiàn)一定規(guī)律性。

表2 不同生態(tài)環(huán)境條件下羊肚菌子實(shí)體中Glu和Asp的含量(%)

2.2 不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌樣品可溶性糖、糖醇含量

食用菌中小分子可溶性糖和糖醇是其甜味的主要來源,其含量直接影響著食用菌的滋味和口感。由表3可知,12個(gè)羊肚菌樣品中檢測(cè)到8種可溶性糖和1種糖醇,其中海藻糖和甘露醇含量較高,且甘露醇是唯一檢測(cè)到的糖醇,含量在22.592～79.560 μg/g之間。由此可見,甘露醇和海藻糖是羊肚菌中可溶性糖和糖醇的主要成分,賦予羊肚菌爽口的甜味。

表3 不同羊肚菌樣品可溶性糖和糖醇含量(μg/g)

2.3 不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌樣品有機(jī)酸含量

12個(gè)羊肚菌樣品共檢測(cè)到草酸、酒石酸、蘋果酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸8種有機(jī)酸(表4),其中蘋果酸和乙酸是含量最為豐富的有機(jī)酸,含量范圍分別為1158.459～1785.933和1652.879～7976.853 μg/g,其次含量較高的是檸檬酸,含量范圍為174.581～831.232 μg/g,其余有機(jī)酸含量較低。

表4 不同羊肚菌樣品有機(jī)酸含量(μg/g)

2.4 不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌5′-核苷酸差異分析

菌類食品中含有豐富的三磷酸腺苷,在各種特定生物酶的作用下可以發(fā)生降解反應(yīng),最終分解成相應(yīng)的核苷酸。其中5′-核苷酸是典型的呈鮮味物質(zhì),這些呈味核苷酸不僅具有顯著的增鮮作用,而且對(duì)于動(dòng)物性食品的各種滋味也有一定的增減作用[15,19]。對(duì)不同羊肚菌樣品進(jìn)行5′-核苷酸檢測(cè),結(jié)果如表5所示。羊肚菌樣品均檢出5種核苷酸5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP和5′-XMP,且5′-CMP、5′-AMP和5′-IMP含量較高,5′-GMP和5′-XMP含量較低。從單個(gè)核苷酸看,不同羊肚菌樣品沒有明顯的規(guī)律性,PY7、PY8的5′-CMP含量顯著高于其他菌株(P<0.05);CX1的5′-GMP含量最高(P<0.05),CX2、CX3和PY8其次,顯著高于其他菌株(P<0.05);QL10、QL12、QL11的5′-IMP含量依次降低,且顯著高于其余菌株(P<0.05);CX3的5′-XMP含量顯著高于其他菌株(P<0.05);5′-AMP含量較高的為QL11和QL12,且顯著高于其余菌株(P<0.05)。從總核苷酸含量看,不同生態(tài)環(huán)境的羊肚菌樣品沒有存在一定的規(guī)律性。

表5 羊肚菌子實(shí)體中5′-核苷酸的含量(μg/g)

2.5 等鮮濃度計(jì)算結(jié)果分析

研究表明,食用菌令人稱道的鮮味主要來源于5′-核苷酸及呈鮮氨基酸,表征食用菌鮮味的等鮮濃度值(EUC)是由此兩類物質(zhì)計(jì)算而得,用以客觀評(píng)價(jià)食物的呈鮮作用[21]。12個(gè)羊肚菌樣品的EUC值如圖1所示。由圖1可知,12個(gè)羊肚菌樣品的EUC值為145.249～885.245 g MSG/100 g,其中QL12的EUC值最大為885.245 g MSG/100 g,其次為QL10和QL11,而PY7EUC值最小為145.249 g MSG/100 g。Tsai等[22]對(duì)EUC值劃分為四個(gè)水平:第一水平為EUC>1000 g MSG/100 g干重,第二水平為100 g MSG/100 g

圖1 不同羊肚菌樣品等鮮濃度

2.6 羊肚菌非揮發(fā)性物質(zhì)PCA

通過SPSS 22.0軟件對(duì)12個(gè)不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌樣品的非揮發(fā)性呈味物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析,分析得到各主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累積方差貢獻(xiàn)率。從表6可知,特征值大于1的共7個(gè)主成分,總方差94.169%,其方差貢獻(xiàn)率依次為32.978%、20.096%、13.911%、9.122%、7.986%、5.880%、4.196%,說明7個(gè)主成分反映了原始變量的絕大部分信息。因此構(gòu)成羊肚菌非揮發(fā)性呈味物質(zhì)由初始的24個(gè)降到7個(gè)不相關(guān)的主成分,成功達(dá)到了降維目的。

表6 非揮發(fā)性呈味物質(zhì)主成分分析

通過PCA分析,得到羊肚菌樣品的主成分3D得分圖。由圖2可知,12個(gè)羊肚菌樣品可區(qū)分為3類,其中樣品QL10、QL11、QL12歸為1個(gè)集群,樣品CX1、CX2、CX3歸為1個(gè)集群,樣品PY7、PY8、CD4、CD5、CD6、PY9歸為1個(gè)集群。同一個(gè)集群樣品的非揮發(fā)性呈味物質(zhì)成分相似。

圖2 12個(gè)羊肚菌樣品的主成分3D得分圖

2.7 羊肚菌非揮發(fā)性物質(zhì)CA

采用系統(tǒng)聚類分析法,度量標(biāo)準(zhǔn)為平方Euclidean距離,通過組間連接方式,以有機(jī)酸、可溶性糖、糖醇、5′-核苷酸、呈味氨基酸等24個(gè)羊肚菌非揮發(fā)性呈味物質(zhì)作為變量,對(duì)12個(gè)樣品的非揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行聚類分析。由圖3可知,當(dāng)刻度為5時(shí),12個(gè)羊肚菌樣品可分為2個(gè)集群,樣品CX1、CX2、CX3聚為一個(gè)集群,剩下的9個(gè)樣品歸為1個(gè)集群;刻度為2.5時(shí),9個(gè)樣品又可分為2個(gè)集群,樣品QL10、QL11、QL12為1個(gè)集群,樣品PY7、PY8、CD4、CD5、CD6、PY9歸為1個(gè)集群。CA與PCA的結(jié)果一致,說明二者的分析均可對(duì)12個(gè)羊肚菌樣品進(jìn)行分類。通過分類結(jié)果可見,川西高原樣品CX1、CX2、CX3和丘陵地區(qū)樣品QL10、QL11、QL12分別聚為1類,成都平原和川東山區(qū)樣品PY7、PY8、CD4、CD5、CD6、PY9較為相似,聚為1類,說明成都平原和川東山區(qū)具有相似的栽培環(huán)境,由此可見相似生境馴化栽培的樣品聚為1類。

圖3 羊肚菌樣品聚類分析樹狀圖

3 討論

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,人們對(duì)食用菌品質(zhì)提出了更高的要求。由于食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)不存在一定的正相關(guān),有些品種產(chǎn)量高,而其成分品質(zhì)往往低下。因此,不能僅僅從產(chǎn)量作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)食用菌優(yōu)劣,成分分析更有利于食用菌品質(zhì)評(píng)價(jià)。菌菇類的風(fēng)味是由非揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分組成,揮發(fā)性成分是蘑菇致香物質(zhì)的主體,而非揮發(fā)性成分決定了食用菌的味道,基本上都是由水溶性物質(zhì)組成,包括5′-核苷酸、游離氨基酸、可溶性糖、糖醇、有機(jī)酸等。食用菌風(fēng)味的差異是由風(fēng)味成分的差異造成,而羊肚菌的獨(dú)特滋味主要也是源于這些非揮發(fā)性呈味物質(zhì)成分的差異,這些物質(zhì)具有的鮮味、甜味和酸味的共同作用賦予了羊肚菌獨(dú)有的口感和味道。

隨著羊肚菌種植技術(shù)成熟,種植區(qū)域范圍越來越廣,而各產(chǎn)地氣候、土壤等生態(tài)環(huán)境差異大,使得呈味物質(zhì)特征表現(xiàn)形式多樣化,體現(xiàn)在主要組成物質(zhì)的含量和比例不盡相同。這可能是在遺傳背景一致情況下,氣候、土壤、水質(zhì)等環(huán)境條件會(huì)影響呈味物質(zhì)的初級(jí)和次級(jí)代謝,使得積累的代謝產(chǎn)物在含量上存在一定差異。因此,生態(tài)環(huán)境是決定樣品代謝特征的重要因素。

食物的鮮味是氨基酸類鮮味物質(zhì)和呈味核苷酸物質(zhì)共同作用的結(jié)果。5′-核苷酸對(duì)甜味、肉味有增效作用,對(duì)咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用。同時(shí),5′-核苷酸可以增加蘑菇的鮮味,并且與MSG共同存在時(shí),鮮味協(xié)同增強(qiáng)[23-27]。本研究表明,羊肚菌含有豐富的谷氨酸和天冬氨酸,且5′核苷酸種類齊全,包括了5個(gè)單核苷酸,5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP和5′-XMP。通過對(duì)不同羊肚菌樣品等鮮濃度值分析,不同羊肚菌樣品的等鮮濃度差別較大,但均屬于第二水平(100 g MSG/100 g

由于影響羊肚菌風(fēng)味口感的非揮發(fā)性呈味物質(zhì)指標(biāo)種類多樣,且含量間不存在一定規(guī)律性,無法直接通過這些成分和含量對(duì)相似樣品進(jìn)行判定、區(qū)分和聚集。因此,通過PCA和CA可以對(duì)不同羊肚菌樣品的非揮發(fā)性呈味物質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),將類似的對(duì)象組成多個(gè)聚類,為非揮發(fā)性呈味物質(zhì)相似樣品的分類、聚集提供了理論依據(jù),同時(shí)避免單一指標(biāo)的片面性和不穩(wěn)定性[28-30]。本研究通過PCA和CA統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),兩種方法得到的結(jié)果一致,相似生境馴化栽培樣品可以聚為1類,聚集一起的樣品滋味相似,可見不同生境條件一定程度上會(huì)影響呈味物質(zhì)的代謝積累,從而使樣品存在差異。因此,PCA和CA可用于表征不同生境栽培馴化樣品非揮發(fā)呈味物質(zhì)的差異,且2種方法可以相互檢驗(yàn)。

4 結(jié)論

不同生態(tài)環(huán)境下羊肚菌樣品均檢測(cè)到8種可溶性糖、1種糖醇及8種有機(jī)酸,種類豐富,含量不同,不存在一定規(guī)律性;羊肚菌中5′-核苷酸種類齊全,鮮味氨基酸含量豐富,等鮮濃度均處于第二水平(100 g MSG/100 g