趙悅琳,田忠華,劉東旭,劉 暢,于 雷,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118;2.長春高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)預(yù)防保健中心,吉林長春 130012)

米糠蛋白是稻谷精加工的副產(chǎn)物之一,匯集了稻谷中60%以上的營養(yǎng)成分。米糠蛋白可以應(yīng)用在食品中強(qiáng)化其營養(yǎng)價(jià)值[1];其還具有低致敏性,可以應(yīng)用于針對特殊人群的食品中[2-3];同時(shí)米糠蛋白也具有抗癌、抗疲勞等功能[4]。但由于米糠蛋白中二硫鍵和表面疏水性氨基酸含量過多,使其溶解性差,限制了米糠蛋白的應(yīng)用前景[5]。因此迫切需要對米糠蛋白改性。采用化學(xué)改性法可以使米糠蛋白的某些肽鏈斷裂,并產(chǎn)生新的官能團(tuán),從而改善米糠蛋白的功能性質(zhì)。其中美拉德反應(yīng)是化學(xué)改性中使用最為廣泛的方法[6-8]。

美拉德反應(yīng)不需要化學(xué)催化劑,加熱條件下可以自發(fā)進(jìn)行[9]。目前常用于美拉德反應(yīng)接枝蛋白的多糖主要有葡聚糖[10-11]、殼聚糖[12-13]等。而以阿拉伯木聚糖接枝米糠蛋白的研究尚未見報(bào)道。阿拉伯木聚糖是植物細(xì)胞壁的主要成分,由β-(1→4)糖苷鍵連接的吡喃木糖單位的線性骨架組成[14]。糖基化產(chǎn)物由于引入阿拉伯木聚糖骨架中的羥基,既表現(xiàn)出糖類物質(zhì)的親水特性又具有蛋白質(zhì)的大分子特性,可有效改善米糠蛋白質(zhì)的溶解性、持水性、乳化性等。

因此,本研究用阿拉伯木聚糖通過美拉德反應(yīng)接枝米糠蛋白,制備米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備工藝,并將制得的米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物與米糠蛋白進(jìn)行持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的比較研究,以期為米糠蛋白在食品中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮米糠、玉米麩皮 吉林省萬昌米業(yè)有限公司;鄰苯二甲醛O Phthalic Aldehyde(OPA) 源葉生物有限公司;四硼酸鈉(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉(分析純) 成都金山化學(xué)試劑有限公司。

BSA124S-CW電子分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;HW·SY21-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司;F5A低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司;UWave微波-紫外-超聲萃取儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠蛋白的制備 參考李帥斐堿提米糠蛋白方法有所改動(dòng)[15]。取粉碎后的米糠粉20 g按照1∶9的料液比加入蒸餾水,攪拌均勻,調(diào)節(jié)pH為10。在50 ℃下提取90 min。然后在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min,得到上清液A。將上清液A調(diào)節(jié)pH至4.5。在4000 r/min離心20 min,棄去上清液。凍干沉淀,得到堿提米糠蛋白,粗蛋白含量為13.7%。

1.2.2 阿拉伯木聚糖的提取 本實(shí)驗(yàn)提取的是玉米麩皮中的阿拉伯木聚糖,參照J(rèn)iang等[16]堿提阿拉伯木聚糖的方法并有所改動(dòng)。稱取定量的玉米麩皮粉,并加入0.3 mol/L氫氧化鈉溶液(含0.5% H2O2V/V),在萃取儀中以超聲功率500 W溫度70 ℃條件下萃取30 min,在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min,得到上清液,用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5,再次以相同條件離心上清液。用無水乙醇調(diào)節(jié)上清液濃度為65%。過夜沉淀,離心(4000 r/min,10 min)取沉淀部分,冷凍干燥,得到阿拉伯木聚糖粗提物。

1.2.3 米糠蛋白-阿拉伯木聚糖糖基化復(fù)合物的制備 稱取一定量的米糠蛋白(精確到0.001)[17],用pH為7的磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為1%的蛋白溶液,按照一定的糖/蛋白質(zhì)量比加入阿拉伯木聚糖,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)出有不同pH的溶液,磁力攪拌20 min使溶液混合均勻。密封后放入水浴鍋中,在一定的接枝時(shí)間、一定的接枝溫度下進(jìn)行糖基化改性反應(yīng),反應(yīng)一定時(shí)間后取出立即放入冰水混合物中冷卻。4000 r/min離心15 min除去不溶物,將上清液于4 ℃蒸餾水中透析24 h,將所透析的溶液冷凍干燥成粉末備用。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以接枝度為指標(biāo),研究接枝溶液pH、接枝反應(yīng)時(shí)間、阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比、接枝反應(yīng)溫度對接枝反應(yīng)的影響。

1.2.4.1 接枝溶液pH對接枝反應(yīng)的影響 分別選取pH8、9、10、11、12作為實(shí)驗(yàn)條件,其他條件固定為接枝反應(yīng)時(shí)間50 min、糖-蛋白質(zhì)量比2∶1、接枝反應(yīng)溫度50 ℃。研究溶液pH對接枝度的影響。

1.2.4.2 接枝反應(yīng)時(shí)間對接枝反應(yīng)的影響 分別選取接枝反應(yīng)時(shí)間30、40、50、60、70、80 min作為實(shí)驗(yàn)條件,其他條件固定為pH10、糖-蛋白質(zhì)量比2∶1、接枝反應(yīng)溫度50 ℃,研究反應(yīng)時(shí)間對接枝度的影響。

1.2.4.3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比對接枝反應(yīng)的影響 分別選取1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1作為阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比,其他條件固定為pH10、接枝反應(yīng)時(shí)間50 min、接枝反應(yīng)溫度50 ℃。研究糖-蛋白質(zhì)量比對接枝度的影響。

1.2.4.4 接枝反應(yīng)溫度對接枝反應(yīng)的影響 分別選取接枝反應(yīng)溫度30、40、50、60、70、80 ℃作為實(shí)驗(yàn)條件,其他條件固定為pH10、接枝反應(yīng)時(shí)間50 min、糖-蛋白質(zhì)量比2∶1。研究反應(yīng)溫度對接枝度的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法對接枝溶液pH(A)、接枝反應(yīng)時(shí)間(B)、阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比(C)、接枝反應(yīng)溫度(D)四個(gè)因素與接枝度(Y)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化的因素及水平設(shè)計(jì)

1.2.6 接枝度的測定 采用OPA法[18],準(zhǔn)確稱取40 mg的OPA溶于1 mL甲醇中,分別加入20%(W/V)SDS溶液2.5 mL,0.1 mol/L硼砂溶液25 mL,β-巰基乙醇100 μL,混合均勻后用蒸餾水定容至50 mL,得到OPA試劑。每次使用前即時(shí)配制。測定時(shí),取4 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL樣品液(5 mg/mL),混合均勻后于35 ℃水浴2 min,在340 nm處測定溶液吸光值A(chǔ)340,同時(shí)作空白對照。

式中:C0為原蛋白質(zhì)自由氨基總量;Ct為在t時(shí)蛋白質(zhì)自由氨基的含量。

1.2.7 持水性測定 根據(jù)李帥斐等[19]研究方法略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取m1(約為0.5 g)的蛋白樣品至已知質(zhì)量m2的離心管中,再加入10 mL的蒸餾水。混合均勻后在室溫下靜置30 min。然后在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min。棄去上清液,將沉淀和離心管一起稱重,記為m3。

1.2.8 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 根據(jù)Kim等[20-21]研究方法略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取 0.25 g蛋白樣品,加入0.1 mol/L pH為7.5的磷酸鹽緩沖液20 mL,然后加入10 mL大豆油,在均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)2 min,立即從容器底部吸取50 μL,加入7 mL 0.1%的SDS溶液,混勻后在500 nm波長處測定其吸光度值,以SDS溶液作為空白。室溫放置10 min后再次從底部取樣測定。

式中:DF為稀釋因子,DF=101;ρ為蛋白濃度,g/mL;Φ為光程,Φ=0.01 m;θ為油相所占的分?jǐn)?shù),θ=0.25;A0為0 min時(shí)樣品的吸光值;A10為10 min時(shí)樣品的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均是3次測定平均值,采用Origin 8.5版本軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)處理分析,采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,采用SPSS Statistics 19.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接枝溶液pH對接枝反應(yīng)的影響 由圖1可以看出,隨著接枝溶液pH的增加,接枝度趨勢為先上升后下降,pH為10時(shí)接枝度達(dá)到最大值(P<0.05)。在pH8～10范圍內(nèi),米糠蛋白的溶解度增加,導(dǎo)致米糠蛋白和阿拉伯木聚糖的反應(yīng)位點(diǎn)充分接觸,接枝度隨之增加。但高堿濃度會(huì)使米糠蛋白變性,同時(shí)發(fā)生米糠蛋白交聯(lián),導(dǎo)致接枝度下降。因此,選定pH9、10、11作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)接枝反應(yīng)溶液pH的因素水平。

圖1 接枝溶液pH對接枝反應(yīng)的影響

2.1.2 接枝反應(yīng)時(shí)間對接枝反應(yīng)的影響 由圖2可知,米糠蛋白接枝物的接枝度在初始階段迅速增加,在50 min時(shí)接枝度達(dá)到最高點(diǎn)(P<0.05),這是因?yàn)槊卓返鞍追肿咏Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化,開始解聚,分子內(nèi)部的氨基與阿拉伯木聚糖結(jié)合,接枝度增加[22];隨著反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行,接枝度在60～80 min內(nèi)維持穩(wěn)定。因?yàn)榘殡S反應(yīng)時(shí)間的加劇,蛋白水解逐漸飽和,接枝度幾乎不變(P>0.05)。因此,綜合各方面因素選擇40、50、60 min作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)接枝反應(yīng)時(shí)間的因素水平。

圖2 接枝反應(yīng)時(shí)間對接枝反應(yīng)的影響

2.1.3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比對接枝反應(yīng)的影響 從圖3可以看出,阿拉伯木聚糖與米糠蛋白比值過高或過低都不利于接枝反應(yīng)。當(dāng)糖-蛋白質(zhì)量比為2∶1時(shí),接枝度達(dá)到最大值(P<0.05)。由此表明:在一定的糖度范圍內(nèi),適當(dāng)?shù)卦黾犹菨舛?可以增加自由氨基與糖分子羥基的碰撞結(jié)合機(jī)率,使接枝反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行。但當(dāng)糖溶液濃度過大時(shí),溶液的黏性增加,流動(dòng)性降低,從而使分子間的相互作用放緩,不利于接枝反應(yīng)正向進(jìn)行。因此,選定糖/蛋白1∶1、2∶1、3∶1作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)阿拉伯木聚糖與米糠蛋白質(zhì)量比的因素水平。

圖3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比對接枝反應(yīng)的影響

2.1.4 接枝反應(yīng)溫度對接枝反應(yīng)的影響 由圖4可以看出,隨著接枝反應(yīng)溫度的升高,接枝度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在50 ℃取得峰值(P<0.05)。隨著反應(yīng)溫度的升高,米糠蛋白結(jié)構(gòu)開始疏松,米糠蛋白分子中的自由氨基含量升高,增加了自由氨基與阿拉伯木聚糖分子的羰基的反應(yīng)速率,接枝度顯著升高(P<0.05)。但溫度過高會(huì)引發(fā)蛋白的熱變性和凝聚,自由氨基含量減少,引起接枝度降低。因此,選定40、50、60 ℃作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)接枝反應(yīng)溫度的因素水平。

圖4 接枝反應(yīng)溫度對接枝反應(yīng)的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 方差分析及回歸方程 表2展現(xiàn)了試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。采用Design Expert 8.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合,得到接枝度的回歸方程為:

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

Y=33.81-0.44A-0.57B+0.12C+1.07D-2.06AB-0.72AC+1.75AD-0.69BC+0.48BD+0.31CD-2.08A2-2.66B2-0.59C2-1.41D2

表3 試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

2.2.2 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化 圖5為各因素交互作用的響應(yīng)面圖,響應(yīng)面越陡峭,表明各因素間交互作用越顯著。不同變化趨勢說明各因素之間對接枝反應(yīng)的影響具有差異性。綜合響應(yīng)面圖的陡峭程度和F值可以得出四個(gè)因素對米糠蛋白-阿拉伯木聚糖復(fù)合接枝物接枝度的影響程度為:接枝反應(yīng)溫度(D)>接枝反應(yīng)時(shí)間(B)>pH(A)>糖-蛋白質(zhì)量比(C)。根據(jù)回歸方程得到接枝復(fù)合物的最佳工藝參數(shù):接枝溶液pH10.11,接枝反應(yīng)時(shí)間48.61 min,阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比2.23∶1,接枝反應(yīng)溫度50.47 ℃。此條件下,制備的接枝復(fù)合物接枝度為34.07%。根據(jù)實(shí)際情況,選擇接枝反應(yīng)溶液pH10,接枝反應(yīng)時(shí)間48 min,阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質(zhì)量比2.2∶1,接枝反應(yīng)溫度50 ℃。在此條件下,經(jīng)過三次平行實(shí)驗(yàn),制備的米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝復(fù)合物接枝度為34.01%,接近最佳條件預(yù)測值。

圖5 兩因素的交互作用對接枝反應(yīng)的影響的響應(yīng)面圖

2.3 接枝物的功能性質(zhì)研究

2.3.1 持水性分析 由表4可知,三種樣品中,米糠蛋白-阿拉伯木聚糖混合物的持水性與米糠蛋白持水性差異不大,米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物的持水性最高(P<0.05)。這可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)破壞了米糠蛋白原有的高度規(guī)則和緊密排列的蛋白質(zhì)肽鏈,使肽鏈?zhǔn)杷刹灰?guī)則而使持水性增加,另一方面可能由于阿拉伯木聚糖的引入帶來了親水基團(tuán),溶液中親水基團(tuán)含量升高,持水性增加。

表4 米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物持水性分析

2.3.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析 如圖6,米糠蛋白與阿拉伯木聚糖接枝后,在pH4～10不同條件下接枝物的乳化性都顯著增加(P<0.05)。說明美拉德反應(yīng)可以有效改善米糠蛋白乳化活性。這是因?yàn)橥ㄟ^糖基化反應(yīng)引入阿拉伯木聚糖的親水基團(tuán),促使米糠蛋白更有效地吸附在油-水界面上,界面張力的下降增加了米糠蛋白的乳化活性。并且,阿拉伯木聚糖的引入使蛋白質(zhì)緊密的結(jié)構(gòu)打開，變得疏松,更有利于乳化。證明糖基化反應(yīng)是改善米糠蛋白乳化性的有效途徑。

圖6 不同pH條件下三種樣品的乳化性變化

如圖7,測定了pH4～10不同條件下三種樣品的乳化穩(wěn)定性。從圖7中可以看出混合狀態(tài)與米糠蛋白獨(dú)自存在時(shí)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,當(dāng)pH>7時(shí),米糠蛋白及糖蛋白混合物體系的乳化穩(wěn)定性都大幅下降(P<0.05),這是由于過堿溶液使蛋白質(zhì)大分子發(fā)生交聯(lián),打破了原有的水油平衡。與此對比的是,在pH>8時(shí),糖基化后形成的接枝物的乳化穩(wěn)定性維持不變(P>0.05)。體系中阿拉伯木聚糖的存在一方面增加了油-水乳化體系中水相的黏度,使乳化體系的穩(wěn)定性提高。另一方面,阿拉伯木聚糖的空間位阻作用使乳化劑形成的保護(hù)膜厚度增加,維持體系乳化穩(wěn)定性不變。說明糖蛋白接枝物在較寬pH范圍內(nèi)具有較好的乳化穩(wěn)定性。

圖7 不同pH條件下三種樣品的乳化穩(wěn)定性變化

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)討論了美拉德反應(yīng)改性條件對米糠蛋白糖基化接枝度的影響,通過響應(yīng)面試驗(yàn)建立了米糠蛋白-阿拉伯木聚糖糖基化改性工藝的模型,并對此模型進(jìn)行了優(yōu)化,得到米糠蛋白糖基化改性的最優(yōu)工藝條件為接枝反應(yīng)溶液pH控制在10,接枝反應(yīng)時(shí)間48 min,阿拉伯木聚糖與米糠蛋白質(zhì)量比2.2∶1,接枝反應(yīng)溫度50 ℃,在此條件下,接枝度為34.01%。各因素對接枝反應(yīng)的影響順序?yàn)?接枝反應(yīng)溫度>接枝反應(yīng)時(shí)間>pH>糖-蛋白質(zhì)量比。經(jīng)美拉德反應(yīng)改性后的米糠蛋白持水性增加,乳化性和乳化穩(wěn)定性明顯改善,為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。后續(xù)試驗(yàn)可針對最優(yōu)工藝條件下的米糠蛋白糖基化改性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能性進(jìn)行研究,探究米糠蛋白與阿拉伯木聚糖接枝反應(yīng)的機(jī)理。