姚金昊,劉芝涵,李春露,吳倩文,翟子琦,李 翔,崔志芳

(山東科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,山東青島 266590)

黃酮類化合物是銀杏葉中主要成分之一(含量可達(dá)6%～8%),生理活性和藥理活性十分廣泛[1]。該類化合物通過(guò)抗氧化和去除氧自由基而具有抗衰老的功效[2-3],還可增強(qiáng)機(jī)體免疫力,具有抗炎、抗病毒等功能[4]。

銀杏葉中類黃酮常采用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇等極性有機(jī)溶劑加以提取[5]。近年來(lái)有學(xué)者采用超聲或微波來(lái)加速黃酮類成分溶出,進(jìn)而縮短提取時(shí)間[6-7],但提取時(shí)仍然多采用易燃易爆、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑。采用超臨界流體CO2從銀杏葉中提取得到類黃酮[8],但需要高額的設(shè)備投資以及維護(hù)費(fèi)用,成為制約該技術(shù)得到實(shí)際應(yīng)用的一大瓶頸。所以,尋找易于制備、經(jīng)濟(jì)且更為綠色的新型提取溶劑,并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)于該資源的有效開(kāi)發(fā)利用具有十分重要的意義。

天然低共熔溶劑(Natural Deep Eutectic Solvents,NADESs)是由氫鍵受體(Hydrogen Bond Acceptor,HBA,常見(jiàn)的有季銨鹽)與氫鍵供體(Hydrogen Bond Donor,HBD)按照一定摩爾配比所組成的一類新型溶劑,其凝固點(diǎn)顯著低于各個(gè)純組分的熔點(diǎn)[9]。HBA與HBD均為天然衍生物,具有無(wú)蒸汽壓、無(wú)毒可降解、易于制備成本低等優(yōu)點(diǎn),在萃取分離、有機(jī)合成等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[10-12]。無(wú)論是小分子的肉桂酸、紫杉醇,亦或是大分子木質(zhì)素等,都能在合適的NADESs體系中有很好的溶解度[13-14]。Wei等[15]采用NADESs氯化膽堿/乙二醇萃取木豆葉中的酚類物質(zhì),Dai等[16]使用不同的NADESs對(duì)長(zhǎng)春花中的花青素進(jìn)行提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其得率大大高于傳統(tǒng)溶劑,說(shuō)明NADESs在天然產(chǎn)物萃取分離方面具有較大開(kāi)發(fā)潛力。

因不同NADESs對(duì)類黃酮的溶解能力差別很大,如通過(guò)實(shí)驗(yàn)逐一篩選,所需實(shí)驗(yàn)工作量很大[17],若能利用相關(guān)軟件對(duì)不同NADESs溶解類黃酮能力進(jìn)行模擬計(jì)算篩選,再對(duì)較優(yōu)的NADESs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,則可極大節(jié)省實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人力及時(shí)間、資金投入。真實(shí)溶劑類導(dǎo)體屏蔽模型(Conductor-like Screening Model for Real Solvents,COSMO-RS)基于單分子量子力學(xué)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)方法相結(jié)合[18],用體系中分子結(jié)構(gòu)等作為輸入數(shù)據(jù),來(lái)預(yù)測(cè)特定分子的熱力學(xué)性質(zhì),計(jì)算出無(wú)限稀釋活度系數(shù)γ,初步篩選哪些溶劑能對(duì)特定物質(zhì)的溶解效果較好[19],該模型已幫助不同研究方向的團(tuán)隊(duì)找到適合不同產(chǎn)物提取的最佳溶劑[20-21]。

本研究采用模擬計(jì)算與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,通過(guò)COSMO-RS計(jì)算,以γ為指標(biāo),從多組NADESs組合中篩選出提取類黃酮較優(yōu)的NADESs。利用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)影響類黃酮提取的工藝條件如固液比、溫度、提取時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)的NADESs提取類黃酮工藝,并為天然產(chǎn)物的NADESs提取相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉 2018年秋季收集于山東科技大學(xué)校園(青島),用流動(dòng)自來(lái)水洗滌后自然晾干,粉碎機(jī)粉碎,過(guò)100目篩,105 ℃烘箱烘干后放于氣密容器中備用;蘆丁對(duì)照品 純度91.7%,購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;氯化膽堿 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;實(shí)驗(yàn)所用其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

WFJ 7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司;TGL-16M臺(tái)式高速冷卻離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 杭州市明遠(yuǎn)儀器有限公司;FA2004N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;計(jì)算模擬所用軟件為Materials Studio7.0 美國(guó)Accelrys。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 COSMO-RS軟件模擬計(jì)算篩選NADESs 計(jì)算所用NADESs:基于成本低廉、生物相容性好等方面考慮,選取氯化膽堿為HBA,尿素、甘油、乳酸、檸檬酸、丙二酸、草酸作為HBD,組成6類NADESs體系[7],每類溶劑體系下分別討論3種HBA與HBD摩爾配比:2∶1、1∶1和1∶2(共18組NADESs)。

基于COSMO-RS模型的相關(guān)計(jì)算部分主要流程如圖1所示。以蘆丁作為模型溶質(zhì)分子,并將每組NADESs作為提取所用溶劑,對(duì)蘆丁這一溶質(zhì)分子的γ值進(jìn)行計(jì)算,γ值較低則意味著該溶劑體系對(duì)于蘆丁的溶解能力較強(qiáng)[19]。選取γ值較低的NADESs進(jìn)行后續(xù)類黃酮提取實(shí)驗(yàn)。

圖1 基于COSMO-RS計(jì)算模擬篩選類黃酮提取所用NADESs流程圖

1.2.2 NADESs的配制 將氯化膽堿為HBA,尿素、甘油、乳酸、檸檬酸、丙二酸、草酸為HBD所組成的6類NADESs,在保證HBA和HBD總質(zhì)量為100 g的基礎(chǔ)上,以HBA和HBD摩爾比例為2∶1、1∶1和1∶2分別稱取相應(yīng)量的HBA和HBD,置于500 mL的圓底燒瓶中,用橡膠塞密封后,置于70 ℃磁力攪拌水浴鍋中攪拌,直至瓶?jī)?nèi)液體均相、無(wú)色透明液體時(shí)停止加熱,取出圓底燒瓶逐漸冷卻至室溫,即得NADESs,將其作為提取溶劑提取銀杏葉中的類黃酮。

1.2.3 NADESs提取類黃酮工藝流程 稱取0.2 g(計(jì)為W g)銀杏葉粉末,取一定體積NADESs(按料液比)加入20 mL鉗口瓶中,將銀杏葉粉末加入,放入磁力攪拌子后壓蓋密封,置于一定溫度磁力攪拌水浴鍋中攪拌提取一定時(shí)間。將其轉(zhuǎn)移到離心管中,8000 r/min下離心25 min,上清液即為粗提液,記錄粗提液體積V mL。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 在模擬篩選的基礎(chǔ)上對(duì)所得較優(yōu)的NADESs——氯化膽堿/甘油(摩爾比1∶2)進(jìn)行銀杏葉類黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn),對(duì)影響類黃酮得率的主要因素如提取時(shí)間、提取溫度、固液比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。采用80 ℃,固液比1∶30 (g/mL)的初始條件,本研究先考察時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5、6、7 h)對(duì)類黃酮提取的影響,再在較優(yōu)提取時(shí)間及固液比1∶30 (g/mL)的條件下研究提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)的影響,最后在較優(yōu)提取時(shí)間、溫度下研究固液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對(duì)類黃酮提取的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[22],以類黃酮得率為主要考察指標(biāo),對(duì)于固液比、提取時(shí)間、提取溫度三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平如下表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平表

1.2.6 指標(biāo)計(jì)算

1.2.6.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 黃酮類化合物均以2-苯基色原酮為母核結(jié)構(gòu),具有相同的吸光特性,常用蘆丁作為類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品。具體測(cè)定方法在前人報(bào)道的基礎(chǔ)上略作改進(jìn)[23]:用NADESs配制0.25 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,用NADESs補(bǔ)足到3.2 mL。依次加入顯色劑5% NaNO2、10% Al(NO)3各1.4 mL,搖勻、靜置,再加入4.0 mL 4% NaOH,搖勻放置15 min。3800 r/min離心10 min,空白試劑為3.2 mL NADESs,其余成分同測(cè)定管,用分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定各組吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=9.5788x+0.0033,R2為0.9993。式中y為蘆丁濃度(mg/mL),x為溶液的吸光度。

1.2.6.2 提取液中類黃酮含量測(cè)定及得率計(jì)算 吸取適量稀釋后銀杏葉類黃酮提取液,用NADESs補(bǔ)足至3.2 mL,其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟一樣,采用下式計(jì)算類黃酮得率:

式(1)

式中:c -稀釋后提取液中類黃酮濃度,mg/mL;n-稀釋倍數(shù);V - 所得提取液總體積,mL;W - 銀杏葉質(zhì)量,g。類黃酮含量測(cè)定每個(gè)樣品測(cè)定三次,取平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的提取實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3 次,每個(gè)提取液濃度測(cè)定時(shí)重復(fù)3次,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制采用Excel 2013,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析、等高圖以及三維圖繪制均采用Design Expert9.0(StatEase Inc.,美國(guó))?；貧w方程采用方差分析進(jìn)行多重比較,擬合模型的判斷通過(guò)方差分析中的F值檢驗(yàn),P<0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并結(jié)合失擬項(xiàng)確定。模型的擬合度和合理性則可通過(guò)回歸系數(shù)R2以及校正決定系數(shù)等進(jìn)行評(píng)判。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算機(jī)模擬篩選NADESs

采用圖1所示的COSMO-RS計(jì)算模擬流程圖進(jìn)行NADESs篩選,得到不同溶劑對(duì)于蘆丁的無(wú)限稀釋活度系數(shù)γ,發(fā)現(xiàn)以本研究所考察的三個(gè)HBA∶HBD配比下,摩爾比為1∶2時(shí),所得NADESs最易配制、且γ相較其他摩爾比要小。

對(duì)于該摩爾比下的六組NADESs體系進(jìn)行銀杏葉類黃酮的初步提取實(shí)驗(yàn),提取條件為80 ℃,2 h,固液比1∶30 (g/mL),所得不同體系下類黃酮得率如表2所示(同時(shí)列出該體系對(duì)蘆丁的γ)。由表2可見(jiàn),甘油做HBD時(shí)對(duì)應(yīng)蘆丁的γ最小,同時(shí)提取類黃酮得率也最高,表明計(jì)算所得γ與類黃酮得率有一定相關(guān)性。

表2 基于氯化膽堿的不同NADESs(HBA與HBD摩爾比1∶2)模擬計(jì)算及初步提取結(jié)果

因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采取摩爾比為1∶2的氯化膽堿/甘油所組成的NADESs,對(duì)于銀杏葉中類黃酮進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。

2.2 NADESs提取類黃酮單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.2所述的流程和方法對(duì)類黃酮提取進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)和固液比(C)對(duì)銀杏葉類黃酮得率的影響

由圖2A可以看出:提取的前2 h,類黃酮得率隨時(shí)間上升速率最快;在2～6 h之間則隨著時(shí)間的延長(zhǎng),類黃酮得率呈緩慢上升趨勢(shì),提取時(shí)間為6 h時(shí),得率可達(dá)4.18%,之后呈降低趨勢(shì),提取時(shí)間為5、6 h時(shí),類黃酮得率基本持平，可達(dá)4.18%,之后呈降低趨勢(shì)。結(jié)合上述提取率的變化趨勢(shì),同時(shí)考慮到提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致提取成本增加,后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)擬定提取時(shí)間如表1所示的2、4、6 h三個(gè)水平。李保同[1]以銀杏葉為原料,采取纖維素酶50 ℃作用1 h,之后用70%乙醇溶劑采用微波輔助提取,累計(jì)微波時(shí)間2 min,類黃酮得率達(dá)到最高為3.96%。說(shuō)明本研究所用NADESs較傳統(tǒng)有機(jī)溶劑得率較高,但所需提取時(shí)間較長(zhǎng),這主要是NADESs相比較傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的粘度較高,因而達(dá)到傳質(zhì)平衡所需時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[9]。

溫度升高可促進(jìn)傳質(zhì),在一定程度上提高生物活性物質(zhì)從固體原料中的脫出并溶解擴(kuò)散到提取溶劑中的速度。采取固液比1∶30 (g/mL),在較優(yōu)的提取時(shí)間5 h的提取條件下,對(duì)不同提取溫度的影響進(jìn)行了研究。由圖2B溫度對(duì)得率影響可以看出,隨溫度增加,得率逐漸增加,但是90 ℃下的得率略低于80 ℃,從節(jié)省加熱耗能以及類黃酮這一生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性保障兩方面考慮,不建議后續(xù)實(shí)驗(yàn)中提取溫度高于90 ℃。因50 ℃時(shí)所得NADESs較為粘稠，傳質(zhì)較慢,也在一定程度上限制了類黃酮的提取,故響應(yīng)面試驗(yàn)擬定選取55、70、85 ℃三個(gè)水平的提取溫度加以優(yōu)化。

由圖2C可以看出,當(dāng)采取相同量的銀杏葉進(jìn)行提取時(shí),隨提取所用溶劑量的增加,得率升高,但固液比1∶35和1∶40 g/mL條件下,平均得率均為4.28%,從節(jié)省溶劑損耗的角度而言,后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中最高液固比設(shè)定為1∶35 g/mL。其它兩個(gè)水平分別為1∶25、1∶30 g/mL。

2.3 NADESs提取類黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行NADESs提取類黃酮響應(yīng)面試驗(yàn),所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 NADESs提取類黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到因變量類黃酮得率和自變量X(固液比A,提取時(shí)間B和提取溫度C)之間的關(guān)系式如下:

得率(%)=3.21 +2.28A+0.094B+1.11C-0.0019AB-0.13AC-0.31BC-0.54A2-0.21B2-1.92C2

本實(shí)驗(yàn)所得回歸模型方差分析如表4所示,方差分析表明,F值234.83且P<0.0001表明該模型具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,失擬項(xiàng)P值為0.1266>0.05,說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度差異并不顯著,可認(rèn)為無(wú)失擬因素存在,可用該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[24]。校正決定系數(shù)R2(Adj R-Squared)為0.9934和變異系數(shù)CV為 2.22%,進(jìn)一步說(shuō)明模型具有較好的擬合性和合理性,可用來(lái)對(duì)NADESs提取銀杏葉中類黃酮的工藝進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)校正決定系數(shù)(Pred R-Squared)為0.9650,與校正決定系數(shù)很接近,衡量有效信號(hào)與噪聲的信噪比為42.752(大于4.0視為合理)。

表4 回歸模型方差分析

自變量一次項(xiàng)C,二次項(xiàng)BC、B2和C2對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01),提取溫度、溫度與提取時(shí)間的交互作用、提取時(shí)間的平方以及提取溫度的平方,這幾個(gè)因素均對(duì)類黃酮得率的影響極顯著(P<0.01);而固液比與固液比的平方這兩個(gè)因素對(duì)類黃酮得率的影響顯著(P<0.05)。

對(duì)于響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行繪圖,得到各因素在不同水平下對(duì)于類黃酮得率的等高線(左)和三維圖(右)如圖3所示。固液比和提取時(shí)間的等高線(圖3A)最接近圓形,說(shuō)明兩者交互作用最不顯著,而提取時(shí)間與提取溫度所得橢圓形最明顯(圖3E),說(shuō)明兩者之間交互作用較大,該結(jié)果與表4方差分析的顯著性結(jié)果對(duì)應(yīng)。

圖3 固液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)于類黃酮得率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用擬合模型對(duì)銀杏葉中類黃酮的NADESs(氯化膽堿/甘油摩爾比1∶2)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)提取工藝為:固液比1∶30.7 (g/mL),73.2 ℃下提取4.1 h,模型預(yù)測(cè)類黃酮得率為5.70%。在預(yù)測(cè)最優(yōu)提取工藝下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(3次重復(fù)),類黃酮得率為5.68%,與模型預(yù)測(cè)結(jié)果僅相差0.02%,高于文獻(xiàn)中以銀杏葉為原料提取類黃酮的得率。歐陽(yáng)娜娜等[25]采用一定濃度乙醇作為提取溶劑,分別采取微波法和超聲波法輔助法進(jìn)行優(yōu)化,得到銀杏葉中類黃酮得率分別為4.09%和3.68%。于文萃[7]采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)銀杏葉中類黃酮的微波提取進(jìn)行優(yōu)化,在70%乙醇濃度下,通過(guò)微波輔助,類黃酮得率最高可達(dá)4.71%。以上所得類黃酮得率的數(shù)據(jù)比對(duì)可以看出,盡管不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)周期的銀杏葉中,類黃酮含量可能存在差別,本研究所得銀杏葉中類黃酮得率遠(yuǎn)高于采用傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取所得的結(jié)果。

3 結(jié)論

采用COSMO-RS計(jì)算方法,通過(guò)量子力學(xué)模擬計(jì)算,篩選出銀杏葉中類黃酮提取較優(yōu)的NADESs。在此基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)影響類黃酮提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:采用氯化膽堿/甘油(摩爾比1∶2)的NADESs、固液比1∶30.7 (g/mL)、73.2 ℃下提取4.1 h,類黃酮得率可達(dá)5.68%。本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式,在節(jié)省人力、物力及時(shí)間投入的同時(shí),得到一種綠色、高效、低成本的銀杏葉類黃酮NADESs最優(yōu)提取工藝,為銀杏葉資源的有效利用提供參考。