李 諾,鐘秋平,陳文學(xué),陳衛(wèi)軍,陳海明,云永歡

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南海口 570228)

葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素,可增強(qiáng)機(jī)體免疫力,具有抗氧化性,能夠保護(hù)人體免受自由基的損害[1-3]。人體自身無法合成葉黃素,只能從食物中獲取,特別是從綠色和黃色的水果蔬菜中獲得[4]。飲食中葉黃素的攝入可顯著降低糖尿病和胰腺癌的發(fā)病率[5]。葉黃素是嬰兒和兒童視覺和認(rèn)知發(fā)展的重要調(diào)節(jié)劑,并在預(yù)防和治療與早產(chǎn)有關(guān)的疾病方面發(fā)揮重要作用[6]。熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所栽培的十幾個(gè)品系黃秋葵初步測定,黃秋葵葉片中含有豐富的葉黃素和β-胡蘿卜素,葉黃素的理想純產(chǎn)量最高達(dá)到9261.7 g/hm2[7]。而具有高附加值的黃秋葵葉常作為雞飼料的添加劑以增強(qiáng)雞的著色強(qiáng)度,高附加值沒有得到很好的體現(xiàn)[8]。目前黃秋葵葉的研究主要集中在品質(zhì)分析方面,鮮有對黃秋葵葉葉黃素提取及抗氧化活性方面的報(bào)道。

隨著葉黃素需求的增加,葉黃素受到了廣泛的關(guān)注,因此迫切需要開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)有效的提取方法來獲得高產(chǎn)量的葉黃素。從天然植物資源中提取葉黃素的傳統(tǒng)方法包括有機(jī)溶劑萃取法、超臨界流體萃取法和酶法等[9]。有機(jī)溶劑萃取法雖操作簡單,但萃取耗時(shí)長、成品殘留污染,應(yīng)用于食品、飼料等比較受限[10]。而超臨界流體萃取提取產(chǎn)品純度高,但操作繁瑣,且成本較高,不適用于工業(yè)的擴(kuò)大生產(chǎn)[11-12]。而由兩種不同的聚合物或有機(jī)物與鹽組成的雙水相萃取系統(tǒng)利用簡單的設(shè)備及溫和條件下的簡單操作即可獲得較高的得率,具有環(huán)境生物相容性好、成本低、易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),可以替代傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取法[13]。雙水相萃取法在生物工程、藥物分析、色素提取等方面取得了一些階段性的成果,有著廣闊的應(yīng)用前景[14],因此,利用雙水相萃取法提取葉黃素在工業(yè)生產(chǎn)中具有可行性和實(shí)用性。本試驗(yàn)通過單因素結(jié)合響應(yīng)面的方法確定黃秋葵葉葉黃素提取的最佳條件，以期為黃秋葵的進(jìn)一步加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黃秋葵葉 由?？谥钷r(nóng)業(yè)科技有限公司提供;葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司;硫酸銨 分析純,上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;所用水 均為超純水。

AR124CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司;SK5200HP超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;KH-45A電熱恒溫干燥箱 康恒儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙水相體系相圖制作 參照Huang等[15]的方法稍作修改,采用濁點(diǎn)滴定法制作乙醇-硫酸銨雙水相相圖。在含有一定濃度的硫酸銨溶液的試管中逐滴加入無水乙醇,直至溶液變濁,并記錄無水乙醇的量。根據(jù)30 ℃乙醇濃度和鹽濃度的記錄數(shù)據(jù),繪制乙醇-硫酸銨雙水相相圖。

1.2.2 葉黃素粗提液的制備 準(zhǔn)確稱取0.3 g凍干粉碎后的黃秋葵葉粉末,以1∶20 (g/mL)料液比加入無水乙醇,53 kHz超聲波超聲15 min,5000 r/min離心10 min,取上清液即葉黃素粗提液,備用。

1.2.3 雙水相萃取工藝 稱取一定量乙醇、硫酸銨、葉黃素粗提液、超純水于小燒杯中,總質(zhì)量為10.00 g,將該雙水相體系振蕩30 s并靜置10 min,兩相分離時(shí)收集上相中的葉黃素,測定相比R和葉黃素的含量,并計(jì)算其分配系數(shù)K及得率Y[16],其中:

K=Ct/Cb

式(1)

葉黃素得率(mg/g)=萃取液中葉黃素質(zhì)量(mg)/黃秋葵葉粉末的質(zhì)量(g)

式(2)

式中,Ct表示頂相的葉黃素濃度,μg/mL;Cb表示底相的葉黃素濃度,μg/mL。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%的粗提液(即取0.5 g按1.2.2的方法制備的粗提液加入到10.00 g乙醇-硫酸銨雙水相體系中混合而成)和25%硫酸銨,分析質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%、14%、16%、18%、20%的乙醇對黃秋葵葉葉黃素萃取效果的影響;固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%,其他條件不變,分析質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%、23%、25%、27%、29%的硫酸銨對萃取效果的影響;固定乙醇和硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14%和27%,其他條件不變,分析質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、4%、5%、6%、7%的粗提液對萃取效果的影響。

1.2.5 Box-Behnken試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)由硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和粗提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)組成的三因素三水平17個(gè)組合的Box-Behnken實(shí)驗(yàn),以得率為響應(yīng)值確定黃秋葵葉葉黃素萃取的最佳提取條件,選取的試驗(yàn)因素和水平見表1所示。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.6 超聲輔助萃取葉黃素的動(dòng)力學(xué)研究 分別測定萃取溫度為303、308、313 K時(shí)超聲輔助萃取葉黃素粗提液的動(dòng)力學(xué)曲線,并確定相關(guān)反應(yīng)級數(shù)。根據(jù)等溫條件下的動(dòng)力學(xué)公式

dW/dt=k(Wmax-W)n

式(3)

對式(3)進(jìn)行積分,得到式(4)和式(5)

[Wmax1-n-(Wmax-W)1-n]/(1-n)=kt+a(n≠1)

式(4)

ln[Wmax/(Wmax-W)]=kt+a(n=1)

式(5)

式中:Wmax表示一定溫度下最大產(chǎn)物得率,mg/g;W表示在萃取時(shí)間t時(shí)的產(chǎn)物得率,mg/g;k表示萃取表觀速率常數(shù);t表示萃取時(shí)間,min;a表示積分常數(shù);n表示萃取反應(yīng)級數(shù)。

1.2.7 葉黃素含量測定 準(zhǔn)確稱量一定量的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品,在不同的25 mL棕色容量瓶中用無水乙醇準(zhǔn)確制備濃度分別為5、10、15、20和25 μg/mL的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。放置10 min后,用紫外可見分光光度計(jì)在445 nm下測定樣品的吸光度,同時(shí)以空白試劑為參照,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.0354x+0.0082,R2=0.9996。其中,x是溶液中葉黃素的濃度,μg/mL;y是吸光度值。

1.2.8 抗氧化性評價(jià) 將黃秋葵葉葉黃素濃度稀釋為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL,然后進(jìn)行DPPH自由基和ABTS自由基清除能力試驗(yàn)。

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力測定 參照魏華等[17]的方法略有修改,首先在517 nm下,用無水乙醇將0.2 mmol/L DPPH溶液的吸光度稀釋至1.2～1.3。取4 mL配制的DPPH溶液與1 mL待測樣品混合均勻,在517 nm的波長下測定樣品的吸光值,并以等體積的無水乙醇替代樣品作為對照組。DPPH自由基清除率計(jì)算公式:

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(6)

式中:A0表示未加樣的DPPH的吸光值;A1表示樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光值。

1.2.8.2 ABTS自由基清除能力的測定 參考范楊楊等[18]方法作適當(dāng)修改,將0.2 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液與0.2 mL 2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,避光條件下貯存12～16 h,用PBS溶液將ABTS自由基溶液的吸光度稀釋到0.70左右。取待測樣品0.2 mL,加入上述溶液3.8 mL后搖晃10 s,避光6 min后在734 nm的波長下測定吸光值,同時(shí)用PBS溶液替代樣品作對照。ABTS自由基清除率計(jì)算公式:

ABTS自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(7)

式中:A0表示對照組的吸光值;A1表示樣品的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果分別采用OriginPro 8和Design-Expert.V8.0.6.1處理,所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系的相圖

由相圖(圖1)可知乙醇與硫酸銨須在一定的比例和較大的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)才具有良好的成相能力[19]。由圖1可以觀察到曲線所劃分的兩個(gè)區(qū)域,曲線上方為兩相區(qū),其中上相為富乙醇水相,下相為富鹽水相[20]。當(dāng)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)維持在較高水平時(shí),隨著乙醇濃度的不斷增加,曲線會出現(xiàn)形成雙水相體系的極值點(diǎn),而過量的成相鹽在乙醇濃度較高時(shí)也會析出。因此,在接下來的實(shí)驗(yàn)中,乙醇和成相鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)首先從雙峰曲線以上區(qū)域選取。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對萃取效果的影響 如圖2所示,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12%～14%的濃度范圍內(nèi)隨著乙醇濃度的增加,葉黃素的得率也逐漸增加,在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%(w/w)時(shí)有最大得率和分配系數(shù)。之后隨著乙醇濃度的不斷增加,得率和分配系數(shù)均呈下降趨勢?？赡苁怯捎谝掖紝λ肿拥母偁幠芰υ鰪?qiáng),使兩相更容易分開[21],葉黃素更傾向于上相,上相體積隨乙醇濃度的增加而增大,這有助于葉黃素在上相富集。但過高的乙醇濃度會導(dǎo)致鹽沉淀[22]。因此,確定適宜的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%。

圖2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葉黃素分配系數(shù)和得率的影響

2.2.2 硫酸銨濃度對萃取效果的影響 圖3可以看出,葉黃素的得率和分配系數(shù)在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%～27%(w/w)范圍內(nèi)隨硫酸銨濃度的增加而增加,并在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%(w/w)時(shí)達(dá)到最大值;當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)由27%上升到29%(w/w)時(shí),二者開始下降。隨著鹽濃度的增加,硫酸銨與乙醇爭奪體系中的水,導(dǎo)致水合能力增強(qiáng),極性增大,上相體積減小,從而導(dǎo)致目標(biāo)化合物的減少[23-24]。因此,適宜的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%。

圖3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葉黃素分配系數(shù)和得率的影響

2.2.3 粗提液濃度對萃取效果的影響 由圖4可知,在粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí),葉黃素的得率和分配系數(shù)達(dá)到最大值,但隨著濃度進(jìn)一步增加,二者開始減小。其主要原因是粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí),葉黃素在乙醇相中達(dá)到飽和,如若繼續(xù)增加粗提液的濃度會造成原料的浪費(fèi)[25],因此確定萃取粗提液的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%。

圖4 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葉黃素分配系數(shù)和得率的影響

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果及方差分析 響應(yīng)面法是一種多變量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的有效統(tǒng)計(jì)技術(shù),以最少的運(yùn)行次數(shù)確定最優(yōu)工藝參數(shù)[26]。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法對萃取過程中的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見表2。將所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到以葉黃素得率(Y)對乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)和粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)的二次多項(xiàng)回歸方程:

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

Y=1.96+0.075A+0.04B+0.035 C-0.055AB-0.04AC-0.03BC-0.13A2-0.042B2-0.063C2

為了檢驗(yàn)方程的有效性,對乙醇-硫酸銨雙水相萃取葉黃素的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。由表3可知,P模型<0.001,表明模型極顯著;失擬項(xiàng)P=0.5551>0.05,表明失擬項(xiàng)不顯著,即所選的二次回歸模型合理。模型決定系數(shù)R2=0.9142,說明模型擬合程度較好,可以充分反映各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出最佳條件:粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.14%、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.40%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.46%，得率為1.98 mg/g。由自變量F值大小可知,各因素對葉黃素得率的影響由大到小依次為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)>硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)>粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù),說明在提取過程中影響葉黃素得率的首要因素是乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),這可能與原料特性有關(guān)。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化及模型驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert8.0.6.1軟件對上述回歸方程繪制響應(yīng)面曲線如圖5所示。通過響應(yīng)面圖即可對任意兩因素對黃秋葵葉葉黃素得率的影響進(jìn)行分析,從中確定最佳因素水平范圍。根據(jù)實(shí)際操作,對最佳條件修正為粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.5%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.5%,在此條件下,黃秋葵葉中葉黃素的平均得率可達(dá)1.99 mg/g。與模型預(yù)測值基本吻合,這能夠有效說明該實(shí)驗(yàn)選用的模型是合理的。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.4 提取動(dòng)力學(xué)

萃取反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)級數(shù)是提取動(dòng)力學(xué)的重要參考依據(jù),即當(dāng)動(dòng)力學(xué)曲線最接近直線時(shí)所對應(yīng)的n值[27]。分別在不同溫度下(303、308、313 K),改變萃取時(shí)間,獲得不同溫度下萃取葉黃素相應(yīng)的最大產(chǎn)物得率和在萃取時(shí)間t時(shí)的產(chǎn)物得率。將n設(shè)為0.5、1和2,當(dāng)n=l時(shí),根據(jù)式(5)作圖;當(dāng)n=0.5和2時(shí),根據(jù)式(4)作圖。

如圖6所示,當(dāng)n=2時(shí)曲線最接近直線,故超聲輔助萃取葉黃素符合二級動(dòng)力學(xué)方程。

圖6 反應(yīng)級數(shù)曲線

2.5 黃秋葵葉葉黃素抗氧化性分析

由圖7可以看出,葉黃素對DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用。隨著葉黃素濃度的升高,其對自由基的清除能力逐漸增強(qiáng),但均弱于陽性對照VC。一般以清除率為50%的樣品濃度IC50值來評價(jià)樣品的抗氧化性,IC50值越小,樣品的抗氧化性越強(qiáng)[28]。

圖7 黃秋葵葉葉黃素以VC為對照時(shí)對ABTS自由基(a)和DPPH自由基(b)的清除率

由圖7得到的擬合方程顯示在表4中,當(dāng)黃秋葵葉葉黃素對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率為50%時(shí),葉黃素的IC50值分別為0.2841和0.7633 mg/mL,故葉黃素對ABTS自由基的清除能力更強(qiáng)。該值比馬娜等[29]鹽析法萃取萬壽菊花中的葉黃素清除DPPH自由基時(shí)的IC50值0.34 mg/mL大,說明從黃秋葵葉中提取的葉黃素對DPPH自由基的清除能力稍弱一些。

表4 葉黃素對不同自由基的IC50值

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)對影響雙水相萃取黃秋葵葉中葉黃素的主要因素進(jìn)行分析,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇較優(yōu)水平設(shè)計(jì)Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn),通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取的工藝條件,經(jīng)回歸方程方差分析及最優(yōu)條件驗(yàn)證,并根據(jù)實(shí)際操作,對最佳條件修正為:粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.5%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.5%,在此條件下,黃秋葵葉中葉黃素的平均得率可達(dá)1.99 mg/g,且葉黃素萃取過程符合二級動(dòng)力學(xué)方程。影響葉黃素得率的首要因素是乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù),這可能與黃秋葵葉自身特性有關(guān)。采用本方法提取的黃秋葵葉葉黃素以VC為對照,對DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用,并根據(jù)IC50值的比較得知,葉黃素對ABTS的清除作用更強(qiáng)些。

實(shí)驗(yàn)表明利用乙醇-硫酸銨雙水相萃取黃秋葵葉中的葉黃素,工藝穩(wěn)定可行,操作簡單,成本低,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好,且適合放大生產(chǎn)。