段宙位,陳 婷,何 艾,方宗壯,王世萍,謝 輝,*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計研究所,海南?？?571100;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070;3.江西生物科技職業(yè)學(xué)院,江西南昌 330200)

沉香(AquilariaagallochaRoxb.)為瑞香科常綠喬木,其含黑色樹脂的木質(zhì)部可作藥材,用于治療胃寒、腎虛、胸悶等癥狀[1-2]。沉香主要種植于廣東、云南、海南等地。據(jù)統(tǒng)計,2017年沉香在海南種植面積約10萬畝,呈逐年增長的趨勢。沉香在種植過程中,產(chǎn)生大量的樹葉,常被當(dāng)做廢棄物丟棄,造成資源的浪費。

據(jù)報道,沉香葉中含有多糖、黃酮、苷類[3-5]等多種活性物質(zhì),應(yīng)用價值高。黃酮類化合物作為沉香葉中的主要活性成分,具有抗癌、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用[6-10],應(yīng)用前景廣闊。研究利用沉香葉中黃酮化合物,這對實現(xiàn)廢棄物再利用,提高沉香附加值具有非常重要的意義?，F(xiàn)階段開展了沉香葉黃酮的提取制備工藝研究,主要有纖維素酶輔助有機溶劑提取法[11]和有機溶劑浸提法[12]。但涉及沉香葉黃酮的純化研究較少。大孔樹脂法因其具有污染低、穩(wěn)定性高、選擇性強、易操作等優(yōu)點[13],常用于黃酮類化合物的分離純化,如陸英等[14]用HPD500型樹脂純化紅薯葉黃酮,黃酮純度提高至48.87%;徐懷德等[15]用D4020型樹脂純化花椒葉總黃酮,黃酮純度提高至16.92%。關(guān)于大孔樹脂純化沉香葉黃酮的研究尚未見相關(guān)報到。因此,本實驗在提取沉香葉黃酮的基礎(chǔ)上,通過靜態(tài)和動態(tài)實驗,確定大孔樹脂純化條件,比較純化前后黃酮的抗氧化性,以期獲得純度較高、抗氧化性較強的黃酮類化合物,為沉香葉的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沉香葉 采自瓊海市國營東平農(nóng)場;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;大孔樹脂NKA-9、AB-8、D201、NKA-Ⅱ、X-5 南開大學(xué)化工廠;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁試劑公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

VaCo5-80型凍干機 德國Zirbus公司;BSZ-100自動收集器、BT-100恒流泵 上海嘉鵬科技有限公司;CPA225D電子天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沉香葉黃酮的提取 將沉香葉清洗干凈,50 ℃烘干,粉碎,過40目篩。按照纖維素酶用量200 U/g,底物濃度3 g/100 mL加入70%乙醇,在55 ℃,pH5條件下浸提3 h,濃縮和干燥后,得沉香葉黃酮提取物[11](以下簡稱“粗提物”)。

1.2.2 黃酮質(zhì)量濃度的測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.2.2.1 黃酮質(zhì)量濃度的測定 采用硝酸鋁顯色法[12]。移取1.0 mL樣品液于10.0 mL具塞試管中,用蒸餾水定容至5.0 mL。分別向其中加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL,靜置6 min,再加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL,再放置6 min,再向其中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL后靜置15 min。同時用70%乙醇作空白對照,于510 nm測定吸光值。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考段宙位等[12]方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。用70%乙醇溶液配制成0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL)于10.0 mL具塞試管中,用蒸餾水定容至5.0 mL。采用1.2.2.1方法測定吸光值,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=11.975x-0.0325,R2=0.9996,式中x表示蘆丁質(zhì)量濃度,y表示吸光值,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3 樹脂預(yù)處理 參考Xiao等[16]方法。用95%乙醇溶液浸泡24 h,用蒸餾水洗至無醇味。將大孔樹脂濕法上柱(Φ16 mm×500 mm),分別用4 BV 5% NaOH溶液和2% HCl溶液以3 BV/h的速率淋洗大孔樹脂,最后用蒸餾水洗至中性,濾干,備用。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗

1.2.4.1 樹脂的篩選 分別稱取預(yù)處理好的樹脂5.0 g,加入6 mg/mL粗提液100 mL,30 ℃下振蕩(180 r/min)吸附3 h,過濾,測定濾液中黃酮質(zhì)量濃度,即為吸附平衡液黃酮質(zhì)量濃度;往上述飽和吸附的樹脂中加入70%乙醇75 mL,振蕩(180 r/min)解吸15 min,過濾,測定濾液中黃酮質(zhì)量濃度,即為解吸液黃酮質(zhì)量濃度。按下面公示計算吸附率、解吸率、吸附量和回收率[17]。吸附率(%)=(C0-Ce)/C0×100;解吸率(%)=(Cd×Vd)/[(C0-Ce)×V0]×100;吸附量(mg/g)=(C0-Ce)×V0/M;回收率(%)=(Cd×Vd)/(C0×V0)×100,C0為粗提液黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);Ce為吸附平衡液黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);V0為粗提液體積(mL);M為大孔樹脂干質(zhì)量(g);Cd為解吸液黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);Vd為解吸液體積(mL)。

1.2.4.2 粗提液濃度對吸附效果的影響 往20%(v/v)乙醇配制的3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL粗提液100 mL中加入NKA-9樹脂5.0 g,振搖吸附3.0 h,過濾,測定濾液中黃酮質(zhì)量濃度,計算吸附率,吸附量。

1.2.4.3 洗脫劑對沉香葉黃酮解吸率的影響 分別取飽和吸附的NKA-9樹脂5.0 g,依次加入40%、50%、60%、70%、80%(v/v)乙醇75 mL,振蕩解吸15 min,過濾,測定濾液中黃酮質(zhì)量濃度,計算解吸率。

1.2.5 大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸試驗

1.2.5.1 上樣流速的確定 采用濕法裝柱,將預(yù)處理好的NKA-9樹脂填充于Φ16 mm×500 mm層析柱內(nèi),分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL/min流速上柱,測定流出液中黃酮質(zhì)量濃度,計算吸附率。

1.2.5.2 洗脫流速的確定 將粗提液按上樣流速1.5 mL/min上柱,待吸附完全后,用70%乙醇,以速度1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min洗脫,測定流出液中黃酮質(zhì)量濃度,計算解吸率。

1.2.5.3 動態(tài)吸附與洗脫曲線的繪制 將預(yù)處理好的NKA-9樹脂裝于層析柱中。將5 mg/mL的沉香葉黃酮粗提物,以流速1.5 mL/min上柱,按每9 mL一管收集流出液,每10管1個柱體積(BV),測定其黃酮質(zhì)量濃度。以BV為橫坐標(biāo),流出液中黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),繪制動態(tài)吸附曲線。待動態(tài)吸附完全后,用70%(v/v)乙醇作為洗脫劑,以流速2.0 mg/mL洗脫,測定每0.5個BV中流出液黃酮質(zhì)量濃度,同上述方法繪制動態(tài)洗脫曲線。

1.2.5.4 沉香葉黃酮純化工藝驗證 按照上述純化條件:選擇NKA-9樹脂,在上樣量60.0 BV,粗提液上樣濃度5.0 mg/mL,上樣流速1.5 mL/min吸附;在洗脫劑70%(v/v),洗脫流速2.0 mg/mL,洗脫劑用量5 BV條件下洗脫,收集洗脫液,55 ℃條件下濃縮,真空冷凍干燥。準(zhǔn)確稱取M(g)干燥后的固體,溶于V(mL)70%乙醇中,按照1.2.2.2計算黃酮質(zhì)量濃度Y(g/mL),按公式:黃酮純度(%)=Y×V×100/M,計算純度。按照1.2.4方法計算回收率。

1.2.6 沉香葉黃酮純化前后抗氧化性比較 采用清除羥自由基法、DPPH自由基法和ABTS自由基法,評價沉香葉黃酮純化前后的抗氧化性。

1.2.6.1 清除羥自由基能力 參考Li等方法[18]。將沉香葉黃酮粗提物、純化物和VC配成不同質(zhì)量濃度的樣品液,待用。往1 mL不同濃度樣品液中加入1 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液和1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液,混合均勻,靜置10 min后,加入1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液,混勻,靜置30 min后,510 nm波長處測定吸光度Ai。重復(fù)上述步驟,以蒸餾水代替水楊酸在510 nm波長處測定吸光度Aj,用蒸餾水代替樣品溶液在510 nm波長下測得的吸光度A0,則待測液對羥自由基清除率的計算為:清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100

1.2.6.2 清除DPPH自由基能力 參考Sun等[19]方法,略有改動。取2 mL不同濃度的樣品溶液,加入2 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液,混合后在室溫下避光反應(yīng)30 min,以95%乙醇調(diào)零,在517 nm處測吸光度Ai;同時測定2 mL 95%乙醇與2 mL樣品液混合后的吸光度Aj以及2 mL DPPH溶液與2 mL 95%乙醇混合后的吸光度A0。自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100

1.2.6.3 清除ABTS自由基法 參考Stpéhanie等[20]方法,略有改動。取5.0 mL 7 mmol/L的ABTS溶液,加入88.0 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀,在室溫下于暗處反應(yīng)12～16 h,形成ABTS自由基儲備液。在734 nm處,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇將ABTS自由基儲備液稀至吸光度為0.70±0.02,備用。準(zhǔn)確量取0.1 mL不同濃度樣品溶液,加入3.9 mL ABTS溶液,混勻,室溫下反應(yīng)6 min,于734 nm處測定吸光度(AE)。同時吸取3.9 mL ABTS溶液,加入0.1 mL 70%的乙醇溶液于734 nm處測定吸光度(AB)。ABTS自由基清除率按下式計算:ABTS自由基清除率(%)=(AB-AE)/AB×100,式中AB表示空白樣吸光度;AE表示樣品吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excle 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附與解吸試驗結(jié)果

2.1.1 樹脂篩選 大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附與解吸效果與其空間結(jié)構(gòu)、極性、含水率等相關(guān)[17]。由表1可知,5種大孔樹脂對沉香葉黃酮的吸附率依次為NKA-9>D201>X-5>AB-8>NKA-Ⅱ,解吸率依次為NKA-9>NKA-Ⅱ>X-5>AB-8>D201,其中NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5解吸率差別不大。這可能是因為NKA-9樹脂極性、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì),利于沉香葉黃酮的吸附;二者之間主要靠范德華力、氫鍵作用,結(jié)合能力相對離子鍵弱,易被破壞,利于洗脫。綜合考慮吸附率與解吸率,選擇NKA-9大孔樹脂用于沉香葉黃酮純化。

表1 不同樹脂對沉香葉黃酮靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

2.1.2 粗提液濃度對吸附效果的影響 粗提液上樣濃度與樹脂吸附效果密切相關(guān)。由圖1可知,NKA-9大孔樹脂吸附不同濃度沉香葉黃酮粗提液,吸附效果變化的趨勢為:隨著粗提物濃度增大,沉香葉黃酮的吸附量先迅速增加后緩慢增加,吸附率逐漸降低。粗提液濃度5 mg/mL,為吸附率和吸附量變化的轉(zhuǎn)折點。這是因為粗提液濃度低于5 mg/mL時,NKA-9樹脂未達(dá)到飽和吸附,隨著粗提液濃度增加,單位表面積的樹脂與黃酮的接觸量越大,吸附量增加;又因樹脂表面游離基團減少,吸附率略有下降。當(dāng)粗提液濃度高于5 mg/mL時,隨著樹脂表面基團逐漸飽和,傳質(zhì)速度變慢,部分黃酮未被吸附就流出,吸附率下降;又因樹脂逐漸達(dá)到飽和吸附,吸附量變化不大。綜合考慮吸附率與吸附量,選擇5.0 mg/mL的粗提液作為樹脂吸附黃酮的上樣液。

圖1 粗提液濃度對樹脂吸附效果的影響

2.1.3 洗脫劑對沉香葉黃酮解吸率的影響 由圖2可知,70%(v/v)乙醇洗脫樹脂時黃酮解吸率最大,增加或降低乙醇濃度,解吸率減小。這是因為乙醇體積分?jǐn)?shù)與其極性相關(guān),70%乙醇的極性易破壞NKA-9樹脂與黃酮類化合物吸附的作用位點,把黃酮置換出來,利于解吸。這與苗修港等[21]研究的洗脫劑解吸香椿葉黃酮類化合物變化趨勢相似。

圖2 乙醇濃度對沉香葉黃酮解吸效果的影響

2.2 動態(tài)試驗條件的確定

2.2.1 上樣流速的確定 由圖3可知,NKA-9樹脂對沉香葉黃酮的吸附率隨上樣流速的增加而減小,這是因為上樣流速越大,粗提液在柱中停留時間越短,沉香葉黃酮未及時被樹脂吸附便流出柱體。流速較慢利于樹脂吸附黃酮,然而流速過慢,會降低生產(chǎn)效率,延長周期,不利于生產(chǎn)應(yīng)用。與上樣流速1.0 mL/min相比,1.5 mL/min流速條件下,NKA-9樹脂對沉香葉黃酮的吸附率僅下降了1.97%±0.06%,但單位時間粗提液上樣量增加了0.5倍。這與楊喆等[22]研究的上樣流速對D101大孔樹脂吸附山杏核殼總黃酮變化趨勢相同。綜合考慮,選擇1.5 mL/min作為粗提液上樣流速。

圖3 上樣流速對沉香葉黃酮吸附效果的影響

2.2.2 洗脫流速的確定 由圖4可知,黃酮解吸率隨洗脫流速增加而減小,這是因為洗脫流速較快時,洗脫劑未及時置換出樹脂中目標(biāo)物質(zhì)(黃酮),洗脫不完全。流速較慢,利于黃酮從樹脂中解吸出來,然而流速過慢,會延長生產(chǎn)周期。與洗脫流速1.0 mL/min相比,2.0 mL/min流速條件下,乙醇洗脫樹脂的解吸率降低3.16%±0.15%,但同等體積乙醇洗脫樹脂所用時間縮短一半。這與李俠等[23]研究的洗脫流速對綠豆皮黃酮解吸效果影響變化趨勢相同。綜合考慮,選擇2.0 mL/min作為乙醇洗脫劑洗脫流速。

圖4 洗脫流速對洗脫效果的影響

2.2.3 沉香葉黃酮動態(tài)吸附與洗脫曲線 動態(tài)吸附曲線直觀反映樹脂吸附沉香葉黃酮的情況。由圖5可知,隨著粗提液上樣量增加,流出液中黃酮質(zhì)量濃度增大。上樣量小于30.0 BV時,流出液中黃酮質(zhì)量濃度低于(172.86±11.12) μg/mL,約為上樣中黃酮質(zhì)量濃度(670.56±38.71) μg/mL的25%,說明上樣液中大部分黃酮被NKA-9樹脂吸附;上樣量大于30.0 BV時,流出液中黃酮濃度快速增加,說明未被吸附的黃酮增加較快;上樣量60.0 BV時,流出液中黃酮質(zhì)量濃度(632.78±31.78) μg/mL接近上樣液中黃酮質(zhì)量濃度,且流出液中黃酮質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。當(dāng)流出液中黃酮質(zhì)量濃度接近上樣液黃酮質(zhì)量濃度時,樹脂達(dá)到吸附飽和[21],因此,60 BV時NKA-9樹脂達(dá)到飽和吸附。

圖5 動態(tài)吸附曲線

動態(tài)洗脫曲線直觀地反映樹脂解吸沉香葉黃酮的情況。由圖6可知,當(dāng)乙醇用量為1 BV時,流出液中黃酮濃度達(dá)到最大值(2050.31±100.62) μg/mL;再增加乙醇用量,流出液中黃酮的濃度迅速降低;當(dāng)乙醇用量為5 BV時,流出液中黃酮濃度僅為(55.82±2.26) μg/mL,接近于沉香葉黃酮粗提液初始濃度的1/12,且流出液中黃酮質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定,說明吸附的黃酮基本被解吸完全。

圖6 動態(tài)洗脫曲線

2.2.4 沉香葉黃酮純化工藝驗證 按照1.2.5.4工藝條件,沉香葉黃酮經(jīng)NKA-9樹脂動態(tài)吸附解吸后,純度提高至76.58%±3.46%,回收率為85.33%±3.72%(相對于沉香葉黃酮粗提物)。

2.3 沉香葉黃酮純化前后抗氧化性比較

2.3.1 清除羥自由基能力比較 由圖7可知,沉香葉黃酮粗提物與純化物都具有較強的清除羥自由基能力,且隨樣品濃度增加而增大,這與邵盈盈等[13]研究藍(lán)莓總黃酮清除羥自由基能力變化趨勢相似。沉香葉黃酮粗提物、純化物和VC清除羥自由基的IC50值分別為(0.300±0.015)、(0.120±0.008)、(0.150±0.011) mg/mL,說明沉香葉黃酮純化后清除羥自由基能力增強,稍強于VC。沉香葉黃酮對羥自由基的清除作用稍強于VC,推測黃酮中可能含有多元羥基基團[13],具體結(jié)構(gòu)尚待進一步驗證。

圖7 沉香葉黃酮純化前后清除羥自由基能力比較

2.3.2 清除DPPH自由基能力比較 由圖8可知,沉香葉黃酮粗提物與純化物都具有較強的清除DPPH自由基能力,且隨樣品濃度的增加而增大,這與閆蕊等[24]研究黃花油點草黃酮清除DPPH自由基能力變化趨勢相似,但其清除能力明顯強于黃花油點草黃酮,這是因為不同植物中黃酮的種類與結(jié)構(gòu)不同,表現(xiàn)出的抗氧化性能力不同。沉香葉黃酮粗提物、純化物和VC清除DPPH自由基的IC50值分別為(0.170±0.008)、(0.016±0.009)、(0.0057±0.0004) mg/mL,說明沉香葉黃酮純化物后清除DPPH自由基能力增強,更接近于VC。

圖8 沉香葉黃酮純化前后清除DPPH自由基能力比較

2.3.3 清除ABTS自由基能力比較 由圖9可知,沉香葉黃酮純化前后對ABTS自由基的清除能力隨樣品濃度的增加而增大,這一結(jié)果與艾薇等[25]對藿香葉黃酮清除ABTS自由基能力變化趨勢相似。沉香葉黃酮粗提物、純化物和VC清除ABTS自由基的IC50值分別(0.160±0.009)、(0.042±0.002)、(0.0067±0.0004) mg/mL,說明沉香葉黃酮純化后清除ABTS自由基能力增強,更接近于VC。

圖9 沉香葉黃酮純化前后清除ABTS自由基能力比較

3 結(jié)論

通過樹脂吸附-解吸試驗,確定NKA-9大孔樹脂分離純化沉香葉黃酮效果最佳。NKA-9大孔樹脂的純化條件為:以1.5 mL/min速度將5.0 mg/mL粗提液通過層析柱,用70%(v/v)乙醇以2.0 mg/mL速度洗脫。此條件下,樹脂吸附量為(16.52±1.16) mg/g,黃酮回收率為85.33%±3.72%(相對于沉香葉黃酮粗提物),純度提高至76.58%±3.46%。通過抗氧化性實驗得出:沉香葉黃酮純化后清除羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基IC50值分別為(0.120±0.008)、(0.016±0.009)、(0.042±0.002) mg/mL,遠(yuǎn)低于純化前的(0.300±0.015)、(0.170±0.008)、(0.160±0.009) mg/mL,說明沉香葉黃酮純化前后均具有較強的抗氧化性,經(jīng)過NKA-9大孔樹脂純化后沉香葉黃酮的抗氧化性明顯增強。沉香葉黃酮經(jīng)大孔樹脂吸附分離后,糖類、蛋白質(zhì)、無機鹽等雜質(zhì)大幅度減少,純度增加,抗氧化性增強,這對沉香葉的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。