秦生華,李 珊,2,*,凌旭彬,龔尚昌,周貝紅,冼麗清

(1.百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,廣西百色 533000;2.百色學(xué)院，桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西百色 533000;3.百色學(xué)院材料科學(xué)與工程學(xué)院,廣西百色 533000)

百香果原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū),因果瓤多汁、氣味芬芳且富含氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),被譽(yù)為“果汁之王”[1]。我國(guó)南方地區(qū)廣泛栽培,其中廣西已經(jīng)成為我國(guó)最大的百香果生產(chǎn)基地[2]。目前,果汁壓榨仍是百香果加工的主要方式,果皮則作為副產(chǎn)物直接舍棄或加工為牲畜飼料。文良娟課題組經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),百香果果皮中含有大量的生物活性物質(zhì),如多糖、果膠、黃酮等[3]。因而,百香果果皮未經(jīng)深加工即舍棄,不僅是資源的嚴(yán)重浪費(fèi),更由于其纖維含量大(>20%)易成為環(huán)境的負(fù)擔(dān)。提取百香果果皮中的活性成分,加快百香果高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)就成為了升級(jí)百香果產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的當(dāng)務(wù)之急。

黃酮是一類(lèi)以2-苯基色原酮為中心結(jié)構(gòu)的化合物的統(tǒng)稱(chēng),在修復(fù)受損器官、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝等方面具有廣泛的生理活性[4-5]。根據(jù)其理化性質(zhì),黃酮類(lèi)化合物常見(jiàn)的提取方法包括有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助提取法、酶解法及微波輔助提取法等。其中,超聲波輔助提取法具有操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、效率高等優(yōu)勢(shì),在植物黃酮的提取研究中應(yīng)用日益廣泛。目前,關(guān)于百香果果皮總黃酮的提取研究已有報(bào)道[6-7],如楊丹課題組采用乙醇-水溶液提取法提取紫果西番蓮(紫皮百香果)果皮中的總黃酮[8],提取率最高為1.17%,廖蘭課題組則采用逆流法進(jìn)行提取[9],果皮總黃酮的提取率高達(dá)2.18%。然而,百香果果皮總黃酮的超聲波輔助提取研究仍未有報(bào)道,并且其生物活性方面的研究也十分缺乏。本文針對(duì)這一現(xiàn)狀,擬采用超聲波輔助乙醇-水溶液提取法提取百香果果皮中的總黃酮并優(yōu)化工藝條件,隨后對(duì)總黃酮的生物活性如穩(wěn)定性、抗氧化活性進(jìn)行初步探討,以期為深化百香果的綜合開(kāi)發(fā)及產(chǎn)品應(yīng)用提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百香果 外皮完整無(wú)損傷無(wú)腐敗,百色市右江區(qū)城西大型農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易市場(chǎng);蘆丁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、水楊酸、過(guò)氧化氫(30%)、硫酸亞鐵、氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鉬酸銨、抗壞血酸 分析純,北京華威銳科化工有限公司。

UV-2700紫外分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司;KQ-202KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器 超聲波儀器有限公司;DHG-9030A智能數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海坤天試驗(yàn)室儀器有限公司;SHA-B恒溫水浴振蕩器 浙江力辰儀器科技有限公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市宇翔儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 百香果果皮粉末樣品的制備 百香果熟果,外皮完整無(wú)損傷無(wú)腐敗,去瓤去籽取果皮,切成邊長(zhǎng)為1 cm的方塊,置于烘箱中60 ℃烘干至恒重。粉碎,過(guò)60目分樣篩,收集粉末置于密封袋中,低溫(2～4 ℃)干燥保存,備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[10-12],準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g百香果果皮粉末,固定液料比40∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、提取功率200 W、提取時(shí)間20 min,考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、提取溫度50 ℃、提取功率200 W、提取時(shí)間20 min,考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g)對(duì)總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、液料比50∶1 mL/g、提取功率200 W、提取時(shí)間20 min,考察提取溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對(duì)總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃、液料比50∶1 mL/g、提取時(shí)間20 min,考察提取功率(120、160、200、240、280、300 W)對(duì)總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、液料比50∶1 mL/g、提取溫度60 ℃、提取功率200 W,考察提取時(shí)間(10、15、20、25、30、35 min)對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,明確總黃酮提取率隨各因素變化的波動(dòng)幅度,初步判斷各因素的主次順序。以總黃酮提取率為響應(yīng)值,選取所考查因素中的主要因素(乙醇濃度、液料比、提取溫度、超聲功率)為自變量,利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方案[13-14],如表1所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 百香果果皮總黃酮的提取及提取率的計(jì)算

1.2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制濃度為0.2000 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確移取該溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL并分別置于10 mL具塞比色管中,50%乙醇稀釋至5 mL,混合均勻。繼續(xù)加入0.20 mL 5.0%亞硝酸鈉溶液、0.20 mL 10.0%硝酸鋁溶液、4.00 mL 4.0%氫氧化鈉溶液,50%乙醇定容,室溫反應(yīng)15 min,在287 nm處測(cè)定體系吸光度[15],以吸光度Y對(duì)蘆丁濃度X(mg/mL)進(jìn)行線性回歸,得:

Y=15.36X-0.9496,R2=0.9990

1.2.4.2 總黃酮的提取及提取率的計(jì)算 稱(chēng)取一定質(zhì)量的百香果果皮粉末,與相應(yīng)比例的提取溶劑順序加入提取燒瓶中,在已設(shè)定好的提取溫度、超聲功率、超聲時(shí)間等條件下進(jìn)行提取,反復(fù)三次。合并提取液,濃縮至30 mL,過(guò)濾。濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,50%乙醇定容,即為總黃酮提取液。移取3.00 mL總黃酮提取液至10 mL具塞比色管中,按1.2.4.1所示流程測(cè)定體系吸光度,帶入回歸方程求取提取液中黃酮的濃度,按下式計(jì)算總黃酮提取率:

總黃酮提取率(%)=cv/m×100

式中:c為總黃酮濃度,mg/mL;v為總黃酮提取液體積,mL;m為果皮粉末質(zhì)量,mg。

1.2.5 粗品總黃酮的純化 合并多批次總黃酮提取液,濃縮得棕褐色固體,即為粗品總黃酮。稱(chēng)取一定質(zhì)量的粗品總黃酮,混合50 mL二甲基甲酰胺(DMF)并置于超聲波萃取儀中,在超聲功率100 W,超聲溫度60 ℃下萃取20 min,反復(fù)2次,合并萃取液,過(guò)濾。濾液減壓蒸餾得DMF萃取物。DMF萃取物用蒸餾水溶解,30 mL三氯甲烷萃取,反復(fù)2次,合并萃取液,過(guò)濾。濾液蒸干得純品總黃酮[16-17]。稱(chēng)取20 mg純品總黃酮,50%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,50%乙醇定容,配制不同濃度(10、15、20、25、30 μg/mL)的總黃酮待測(cè)液。

1.2.6 總黃酮穩(wěn)定性測(cè)試

1.2.6.1 溫度對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響 取4支潔凈試管,分別加入10 mL 85.85 μg/mL總黃酮待測(cè)液并置于40、60、80、100 ℃恒溫水浴鍋中,3 h內(nèi)每隔0.5 h在510 nm處測(cè)定體系吸光度,考察溫度對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響[18-19]。

1.2.6.2 光照對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響 取4支潔凈試管,分別加入10 mL 85.81 μg/mL總黃酮待測(cè)液并置于黑暗環(huán)境、節(jié)能燈光(18 W,照射距離1.5 m)、晴朗日光(7月,照射時(shí)段12:00～15:00,外溫40 ℃)、紫外燈光(15 W,照射距離1.5 m)環(huán)境中,3 h內(nèi)每隔0.5 h在510 nm處測(cè)定體系吸光度,研究光照對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響。

1.2.7 總黃酮抗氧化活性測(cè)試

1.2.7.1 對(duì)羥基自由基(·OH)清除效果的測(cè)定 取5支試管,分別依次加入2.00 mL不同濃度(10、15、20、25、30 μg/mL)的總黃酮待測(cè)液、2.00 mL 8.000 mol/L硫酸亞鐵溶液、2.00 mL 9.000 mol/L水楊酸-乙醇溶液,混合均勻后加入2.00 mL 1.0%過(guò)氧化氫溶液,振蕩均勻,室溫反應(yīng)1 h,在510 nm處測(cè)定體系吸光度Ax[20-21]。固定上述試驗(yàn)流程及相應(yīng)條件,以蒸餾水取代總黃酮待測(cè)液并測(cè)定A0(空白吸光度);以蒸餾水取代過(guò)氧化氫溶液并測(cè)定Ap(對(duì)照吸光度),按如下公式計(jì)算總黃酮對(duì)·OH的清除率:

η(%)=[1-(Ax-Ap)/A0]×100

η(%)=[1-(Ax-Ap)/A0]× 100

1.2.7.3 總抗氧化力的測(cè)定 取5支潔凈試管,分別加入2.00 mL不同濃度(10、15、20、25、30 μg/mL)總黃酮待測(cè)液、3.00 mL 2.520 mol/L鉬酸銨-硫酸溶液,振蕩均勻,90 ℃恒溫反應(yīng)90 min,在695 nm處測(cè)定體系吸光度Ax[24-25]。固定上述試驗(yàn)流程及相應(yīng)條件,以蒸餾水取代總黃酮待測(cè)液并測(cè)定A0,按如下公式計(jì)算總黃酮的總抗氧化力(總抗氧化力與吸光度成正比)。

η=Ax-A0

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin 9.0作圖;采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方案并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,獲取回歸模型及最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 如圖1所示,在一定范圍內(nèi),總黃酮提取率隨乙醇濃度的升高而升高,當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí),總黃酮提取率達(dá)到最高值1.24%。若乙醇濃度繼續(xù)增加,總黃酮提取率開(kāi)始緩慢下降。黃酮為典型的有機(jī)化合物,易溶于乙醇等有機(jī)試劑,因而提取率隨乙醇濃度的升高而提高。但乙醇濃度過(guò)高,果皮中的色素等脂溶性物質(zhì)也將進(jìn)入提取溶劑中并擠占黃酮分子的溶出空間,導(dǎo)致其提取率下降。因此,乙醇濃度設(shè)定為70%比較合適。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響 如圖2所示,總黃酮提取率先隨液料比的增大而升高,當(dāng)液料比為50∶1時(shí),總黃酮提取率達(dá)到最大值1.41%。繼續(xù)增大液料比則導(dǎo)致提取率下降。溶劑量的增加擴(kuò)大了體系的擴(kuò)散壓,促使黃酮分子盡可能多地?cái)U(kuò)散到溶劑中,得率升高。溶劑量過(guò)大,雜質(zhì)分子亦被溶出,與黃酮分子競(jìng)爭(zhēng)溶出空間導(dǎo)致提取率下降。因此,液料比設(shè)定為50∶1 mL/g比較合適。

圖2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 如圖3所示,在較低的溫度范圍內(nèi),總黃酮提取率隨溫度的升高而升高,當(dāng)提取溫度設(shè)定為60 ℃時(shí),總黃酮提取率達(dá)到最高值1.56%。若溫度繼續(xù)升高,總黃酮提取率迅速下降。溫度升高,黃酮分子的運(yùn)動(dòng)活性增強(qiáng),易擴(kuò)散,提取率升高。但黃酮分子的酚式結(jié)構(gòu)對(duì)溫度變化較為敏感,其結(jié)構(gòu)易被高溫破壞,得率下降。因此,提取溫度設(shè)定在60 ℃比較合適。

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響 如圖4所示,在一定范圍內(nèi),總黃酮提取率隨超聲功率的增加而升高,當(dāng)超聲功率設(shè)定為240 W時(shí),提取率達(dá)到最大值1.65%。超聲功率繼續(xù)增加,總黃酮提取率下降(超聲波清洗器額定功率300 W)。超聲波的機(jī)械作用可以高效率地破壞細(xì)胞壁,促使黃酮分子快速溶出,提取率升高。較高的超聲功率將加劇體系的空化作用,導(dǎo)致局部溫度過(guò)高并破壞黃酮的分子結(jié)構(gòu),提取率下降。因此,超聲功率設(shè)定在240 W較為合適。

圖4 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 如圖5所示,總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,當(dāng)提取時(shí)間為25 min時(shí),總黃酮提取率為1.66%。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,總黃酮提取率基本處于平衡狀態(tài)。總黃酮含量一定,較長(zhǎng)的提取時(shí)間可使黃酮盡可能提取完全,但易引入雜質(zhì),并造成時(shí)間、能源成本的增加。因此,提取時(shí)間設(shè)定在25 min比較合適。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方案 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,總黃酮提取率隨提取時(shí)間變化波動(dòng)幅度較小,為所考察因素中的次要因素,因此以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)及超聲功率(D)為因素,總黃酮得率為響應(yīng)值(Y),進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,安排并嚴(yán)格實(shí)施29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.2.2 回歸方程方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)方案所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,獲得百香果果皮總黃酮提取率(%)對(duì)乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、超聲功率(D)的回歸模型:

總黃酮提取率(%)=-22.15933+0.31020A+0.32633B+0.013767C+0.039275D-2.12500×10-3AB+5.75000×10-4AC+8.12500×10-5AD+2.25000×10-4BC+6.87500×10-5BD+2.25000×10-4CD-1.92167×10-3A2-1.89667×10-3B2-1.05917×10-3C2-1.24010×10-4D2

表3 回歸方程的方差分析

根據(jù)F值可知,考察因素對(duì)總黃酮提取率影響效果的主次順序?yàn)橐毫媳?乙醇濃度>超聲功率>提取溫度,且各因素及其二次項(xiàng)的影響效果均為極顯著水平(P<0.01)。各因素之間存在交互作用,其中交互作用AB極顯著(P<0.01),交互作用CD顯著(P=0.0202<0.05),交互作用AC、AD、BC、BD不顯著(P>0.05)。

2.2.3 交互作用的響應(yīng)面解析 利用Design-Expert 8.0.6作出各交互作用的響應(yīng)面分析圖及等高線分析圖。響應(yīng)面的陡峭程度與該交互作用的顯著性成正比,曲面陡峭程度越大說(shuō)明該交互作用越顯著,曲面平緩說(shuō)明影響不顯著[27]。等高線的橢圓率也可以直觀地反應(yīng)交互作用的強(qiáng)弱,等高線橢圓率越大說(shuō)明該交互作用越顯著,橢圓率小說(shuō)明不顯著。由圖6可知,交互作用AB的響應(yīng)面具有顯著的陡峭曲面,且其等高線成明顯的橢圓形,說(shuō)明該交互作用可以顯著地影響總黃酮的提取效果。交互作用CD響應(yīng)面的陡坡明顯但較AB面平緩,等高線橢圓率高,影響顯著。交互作用AC、AD、BC、BD的響應(yīng)面比較平滑,等高線趨近于圓形,不顯著。

圖6 交互作用AB影響總黃酮提取效果的響應(yīng)面分析圖

圖7 交互作用AC影響總黃酮提取效果的響應(yīng)面分析圖

圖8 交互作用AD影響總黃酮提取效果的響應(yīng)面分析圖

圖9 交互作用BC影響總黃酮提取效果的響應(yīng)面分析圖

圖10 交互作用BD影響總黃酮提取效果的響應(yīng)面分析圖

圖11 交互作用CD影響總黃酮提取效果的響應(yīng)面分析圖

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定及檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)方案進(jìn)行優(yōu)化,獲得百香果果皮總黃酮的最佳提取工藝:乙醇濃度61.38%,液料比59.39∶1 mL/g,溫度55.51 ℃,超聲功率245.29 W,在此條件下百香果果皮總黃酮的提取率可達(dá)2.21%。為方便試驗(yàn),將最佳工藝調(diào)整為乙醇濃度61%,液料比59∶1 mL/g,溫度56 ℃,超聲功率240 W,提取時(shí)間25 min,在此條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)以驗(yàn)證該工藝的可行性。結(jié)果表明,在所得最佳工藝條件下,百香果果皮總黃酮提取率可達(dá)2.19%±0.03%,與模型預(yù)測(cè)值2.21%相當(dāng)(<1%),說(shuō)明該條件可行。

2.3 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.3.1 溫度對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響 由圖12所示,當(dāng)溫度處于60 ℃以下時(shí),總黃酮提取液吸光度略微下降后即處于平衡狀態(tài),說(shuō)明黃酮在較低的溫度范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性。當(dāng)溫度升高至80 ℃以上時(shí),黃酮提取液吸光度明顯下降,并且溫度越高降幅越大。由此可知,黃酮應(yīng)低溫保存,并且在保存及應(yīng)用過(guò)程中避免60 ℃以上的高溫。

圖12 溫度對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響測(cè)定

2.3.2 光照對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響 由圖13所示,黑暗環(huán)境中總黃酮提取液的吸光度略有下降后即處于平衡狀態(tài),說(shuō)明黑暗環(huán)境中黃酮具有較高的穩(wěn)定性。在光照條件下,節(jié)能燈光對(duì)黃酮影響較小;日光照射下,總黃酮提取液吸光度明顯下降;紫外燈照射下,黃酮提取液吸光度大幅度下降,以上結(jié)果說(shuō)明黃酮對(duì)紫外線敏感,應(yīng)置于棕色試劑瓶中避光保存。

圖13 光照對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響測(cè)定

2.4 抗氧化活性測(cè)試

2.4.1 對(duì)·OH清除效果的測(cè)定 ·OH是有機(jī)體中最具危害性的自由基,清除多余的·OH對(duì)于維護(hù)機(jī)體正常的生命活動(dòng)具有重要意義。由圖14所示,百香果果皮總黃酮對(duì)·OH具有很好的清除能力,其清除能力隨黃酮濃度的升高而增強(qiáng),并且在高濃度條件下清除率增速進(jìn)一步加快。當(dāng)總黃酮濃度為30 μg/mL時(shí),對(duì)·OH的清除率可達(dá)81%,低于VC對(duì)·OH的清除能力。

圖14 百香果果皮總黃酮對(duì)·OH清除效果的測(cè)定

圖15 百香果果皮總黃酮對(duì)清除效果的測(cè)定

2.4.3 總抗氧化力的測(cè)定 黃酮類(lèi)化合物的酮式結(jié)構(gòu)可以轉(zhuǎn)化為酚式結(jié)構(gòu)。由圖16所示,百香果果皮總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力,其總抗氧化力隨黃酮濃度的升高而增強(qiáng),并且在高濃度條件下總抗氧化力增速加快。當(dāng)黃酮濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí),其總抗氧化力為0.687,低于VC的總抗氧化力。

圖16 百香果果皮總黃酮總抗氧化力的測(cè)定

3 結(jié)論