張 軍,段 杉,全麗金,張杏思,曹 庸

(華南農業(yè)大學食品學院,廣東省功能食品活性物重點實驗室,廣東省天然活性物工程技術研究中心,廣東廣州 510642)

靈芝(Ganodermalucidum)是屬于多孔菌科、靈芝屬的大型真菌,李時珍在《本草綱目》中對靈芝進行了較為系統(tǒng)的闡述,它認為靈芝具有“補肝氣”、“治胸中結”、“安神”等多種功效[1]。靈芝中化學成分主要有多糖類、三萜類化合物、蛋白質、多肽、氨基酸、甾醇類、生物堿類以及微量元素等[2]。其中靈芝多糖是靈芝重要的活性成分之一,具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]、降血糖[6]以及免疫調節(jié)[7]等作用。

目前靈芝多糖的萃取方法多集中在通過優(yōu)化工藝條件來提高多糖得率上,主要有熱水浸提法、酶解法、超聲輔助萃取法、微波輔助萃取法以及超臨界萃取等。熱水浸提法遵循中藥的煎煮原則,利用了多糖微溶于冷水易溶于熱水的特性,為最常見的多糖萃取方法,但萃取率較低[8]。酶解法中酶的活性受溫度、pH、時間等因素影響較大,且酶制劑用量大成本高,難以規(guī)?；a[9]。超聲輔助萃取以及微波輔助萃取均是利用物理方法加速植物細胞壁的破壞從而溶出更多的多糖，但可能會對多糖結構造成破壞[10-11]。超臨界萃取法其設備制造以及維護成本較高,且極高的壓力限制了設備體積的放大[12]。同時這些方法均存在萃取后料液分離困難、萃取溶劑回收不便等問題。本研究采用的新型連續(xù)相變萃取技術[13],利用水、乙醇、丁烷等作為萃取溶劑,利用萃取溶劑反復相變特性,能高效、穩(wěn)定地連續(xù)逆流萃取目標物,該方法相比于傳統(tǒng)溶劑浸提法具有萃取率高、萃取時間短、溶劑回收方便、損失率低且粗提物無需過濾等優(yōu)點,已應用于多種天然活性物的萃取、中試以及工業(yè)化生產中。Zhao等[14]以丁烷為萃取溶劑,利用連續(xù)相變萃取技術結合響應面法優(yōu)化醬油渣中萃取油脂工藝,油脂產率達到28.43%。譚榮威等[15]以乙醇為萃取溶劑,從桉樹葉中成功萃取出桉葉多酚,多酚產率達到11.58%。但將連續(xù)相變技術應用于多糖萃取過程中則未有文獻報道。故本實驗旨在使用連續(xù)相變萃取裝置萃取靈芝多糖(GLP),以純水作為萃取溶劑,探究萃取溫度、萃取流速以及萃取時間對靈芝多糖萃取率的影響,同時基于Fick第二定律對靈芝多糖的萃取過程動力學以及熱力學性質進行研究,并研究了靈芝多糖的分子量、紅外光譜性質以及微觀形態(tài),以期完善靈芝多糖萃取動力學的基礎研究,并對靈芝多糖的工業(yè)化生產、精深加工以及高附加值的開發(fā)提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝 無限極(中國)有限公司;葡聚糖標準品 美國Sigma-Aldrich貿易有限公司;濃硫酸、苯酚、葡聚糖分析純 廣州市化學試劑廠。

LXXB-3型連續(xù)相變萃取設備 廣東省天然活性物工程技術研究中心自主研發(fā);119型中藥粉碎機 浙江溫嶺市藥材機械廠;RE-52 A型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠;Vertex 70型傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司;AL 104型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-1750型紫外可見分光光度計、LC-10 A型分析高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司;Evo 18型掃描電子顯微鏡 卡爾蔡司(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝多糖的制備 將靈芝子實體切片,在65 ℃烘箱干燥至恒重。粉碎過20目篩得到靈芝干粉,取靈芝干粉400.00 g,裝入3 L 連續(xù)相變萃取釜中密封,設置恒定流速28 L/h不變,在不同溫度(333.15、343.15、353.15、363.15、373.15 K)下進行GLP萃取實驗,分別萃取10、30、50、70、90、110、130、150、170以及190 min后,將萃取液減壓濃縮并定容至1000 mL,得到靈芝多糖溶液,密封冷藏。同樣的切片、粉碎以及過篩方法,得到同樣質量的靈芝干粉裝入3 L 連續(xù)相變萃取釜中密封,設置恒定溫度373.15 K不變,在不同流速(20、24、28、32、36 L/h)下進行GLP萃取實驗。分別萃取10、30、50、70、90、110、130、150、170以及190 min后,將萃取液減壓濃縮并定容至1000 mL,得到靈芝多糖溶液,密封冷藏。

1.2.2 標準曲線的繪制及樣品多糖質量濃度測定 采用苯酚-硫酸法[16],分別精密吸取100 μg/mL葡萄糖標準品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mL,置于10 mL具塞比色管中,加蒸餾水補充至1.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL,混勻并加入5 mL濃硫酸后靜置5 min,將試管置于30 ℃水浴中反應20 min,冷卻至室溫,使用紫外分光光度計于490 nm波長處測定吸光值,繪制葡萄糖標準曲線。得到葡萄糖標準曲線方程y=0.01044 x-0.00109(y為吸光值,x為葡萄糖質量濃度,g/mL),線性范圍為20～100 μg/mL,決定系數R2=0.9998。精密量取1.0 mL靈芝多糖溶液,按葡萄糖標準品溶液測定方法測定靈芝多糖溶液吸光值,并根據標準曲線計算靈芝溶液多糖質量濃度。

1.2.3 連續(xù)相變萃取GLP過程動力學模型 連續(xù)相變萃取GLP的傳質過程可大致分為三個階段:一是溶劑經高壓泵注入萃取釜中先浸潤靈芝物料表面,再逐漸向靈芝物料內部滲透,GLP在溶劑中溶解;二是溶解了GLP的溶劑與靈芝物料外表面溶劑存在濃度差,GLP從靈芝物料內部向其外表面遷移;三是GLP穿透靈芝物料表面并向外表面溶液主體中擴散[17]。以上三個階段并沒有明確的界線,相互聯系連續(xù)進行,又相互促進和制約,對于整個溶出過程來說,第二步進行的較慢,因此GLP從靈芝內部擴散到外表面主體溶液就是溶出過程的控制步驟,是影響萃取率的主要因素。

1.2.4 連續(xù)相變萃取GLP模型建立 將粉碎過20篩網后靈芝干粉假設為理想的球狀顆粒,同時連續(xù)相變萃取GLP是非穩(wěn)態(tài)擴散過程,顆粒中多糖擴散沿顆粒內部徑向進行,且在任何時間內顆粒內多糖均勻分布;同一溫度以及流速下多糖擴散系數恒定,無軸向擴散系數以及無顆粒表面?zhèn)髻|阻力[18]。

因此,采用基于Fick第二擴散定律的一階擴散模型來研究連續(xù)相變萃取GLP的動力學。

式(1)

式中:r為到球形顆粒中心的距離(m);C為在r和t(min)時GLP的有效擴散濃度(mg/mL);t為萃取持續(xù)時間(min);D為有效擴散系數(mm2/min)。

根據傅里葉變換法[19]求得:

式(2)

式中:C0和C∞分別為初始t時刻和溶出達到平衡時多糖有效擴散濃度(mg/mL);在初始時C0=0,濃度的高次項趨近于零可以忽略不計,因此n=1時,兩邊取對數得:

式(3)

式(3)即為連續(xù)相變萃取GLP的動力學模型方程,該模型不僅表征了靈芝顆粒大小、萃取溫度、萃取流速以及萃取時間與多糖質量濃度之間的關系,還可通過求解相關動力學參數,驗證實驗數據與動力學模型計算值的吻合程度。

1.2.5 GLP分子量測定 采用島津高效液相色譜儀配備示差折光檢測器,凝膠色譜柱TSKgel G6000 PWxl與TSKgel G 3000PWxl串聯,流動相為0.02 mol/L Na2SO4,流速為0.6 mL/min,檢測時間為50 min,柱溫為35 ℃,上樣體積為20 μL。稱取相對分子量為5×103、1.2×104、5×104、1.5×105、2.7×105、4.1×105、6.7×105以及1.5×106Da的葡聚糖標準品用流動相溶解后過0.45 μm濾膜進樣,記錄色譜圖。得到葡聚糖分子量對數lg M與洗脫體積的曲線,并對曲線進行線性擬合,用于確定待測樣品多糖分子量分布范圍[20]。線性方程為y=-0.4726 x+12.70(x為洗脫體積,y為相對分子量對數lg M),線性決定系數R2=0.9921。在同等條件下測定GLP樣品,并利用樣品洗脫體積計算其分子量[21]。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析 稱取1 mg干燥的GLP與100 mg KBr 粉末于瑪瑙研缽中研磨混合均勻,壓成薄片,在波數4000～400 cm-1范圍內利用紅外光譜儀進行光譜掃描[22]。

1.2.7 掃描電鏡分析 利用掃描電子顯微鏡法分析GLP形態(tài)結構。將凍干GLP裱在銅樁上面,置于離子濺射儀中,在10 mA電流的條件下噴鍍鉑金1.5 min,使材料表面上鍍上一層鉑膜,然后利用掃描電鏡觀察不同倍數(50×、2000×、5000×)下GLP形態(tài)特征[23]。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3 次,結果以平均值表示,且標準偏差不超過5%;采用GraphPad Prism 5.0對試驗數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 動力學模型的建立

圖1 不同溫度下與時間的關系圖

圖2 不同流速下與時間的關系圖

表1 不同溫度下與時間的回歸結果

表2 不同流速下與時間的回歸結果

由表1以及表2可知,在不同溫度以及不同流速下回歸方程均顯示出良好的決定系數(R2>0.94),說明實驗數據與推導所得動力學模型式較符合。相同流速情況下,溫度對萃取速率影響較大,表觀速率常數k隨溫度升高而增大,表明升溫能夠加速GLP的溶出;相同溫度情況下,隨著流速的增加,速率常數k呈現先增加后減小的趨勢,在流速低于28 L/h時,增加流速提高了靈芝干粉與溶劑間的接觸面積,有利于多糖的溶出,而當流速繼續(xù)增加到28 L/h以上時,k值減小,可能由于溶劑流速過大,難以在萃取容器出口端達到平衡條件,導致萃取速率放緩[24]。

表3 不同溫度下與時間的回歸結果

圖3 不同溫度下與時間的關系圖

表4 不同流速下與時間的回歸結果

圖4 不同流速下與時間的關系圖

由圖3、圖4可得,隨著萃取時間的增加,多糖相對萃余率呈指數趨勢下降,因此延長萃取時間有利于多糖溶出。在相同流速情況下,隨著溫度升高,相對萃余率逐漸減小,表明溫度越高越有利于多糖的溶出,在溫度為373.15 K時曲線有最大斜率值,表明在該溫度下萃取速率達到最快。在相同溫度情況下,當流速低于28 L/h時,相對萃余率隨著流速的增加而減小,表明增加物料與溶劑的接觸面積有利于多糖的溶出,繼續(xù)升高流速,相對萃取率則出現回升,表明物料與溶劑間存在最佳接觸面積以及接觸速率,過高或過低流速均不利于多糖的溶出。由表3、表4可以看出,在不同溫度以及不同流速下,擬合方程決定系數R2均在0.93以上,表明萃取過程較符合指數模型且試驗數據與方程吻合程度也較高。

2.1.3 半衰期求解 由半衰期t1/2=ln2/k對萃取溫度作圖,并進行擬合,方程為y=-7.440x+2864.4,R2=0.9337。由此可以計算出在最適萃取溫度下,萃取出一半靈芝多糖所需的時間。半衰期可反應出萃取效率的高低,半衰期越小則萃取效率越高。由圖5可以看出半衰期隨著萃取溫度的增加不斷減小,表明升高溫度有利于GLP萃取,能明顯縮短萃取時間。

圖5 t1/2與溫度關系圖

2.1.4 相關熱力學性質 由Van’t Hoff方程lnk=-ΔHθ/RT+ΔSθ/R以及ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ可分別計算出吉布斯自由能ΔGθ、焓變ΔHθ以及熵變ΔSθ。

由表5中可以看出,萃取過程中的焓變ΔHθ和熵變ΔSθ均為正值,表示連續(xù)相變萃取靈芝干粉是一個吸熱過程,這個現象符合預期,因為多糖是從固相(靈芝干粉)中轉移到液相溶劑(水)中。吉布斯自由能ΔGθ均為負值表明GLP的萃取過程是自發(fā)過程,自由能的變化趨勢與溫度的變化趨勢相反,自由能的大小隨著溫度的增加而減小,溫度越高自由能越小,萃取過程就越容易進行。

表5 GLP萃取過程中的各熱力學參數

2.2 多糖結構分析

2.2.1 多糖分子量分布 圖6為GLP的HPGPC檢測圖譜,按出峰時間將GLP分為不同的組分。分子量分別為2.26×107、5.56×105、2.67×103以及1.35×103Da。低分子量比高分子量顯示了更大的峰面積,表明連續(xù)相變萃取GLP的主要組分為分子量<105Da的生物小分子[25]。

圖6 GLP的HPGPC圖譜

2.2.2 多糖紅外光譜分析 如圖7所示,紅外光譜顯示4000～400 cm-1呈多糖類物質的特征吸收峰,3363.70 cm-1附近的強吸收峰、2939.40、1625.92以及1151.45 cm-1是多糖物質的特征吸收峰表示為O-H伸縮振動、C-H伸縮振動、酰胺鍵的C=O吸收峰以及C-C骨架伸縮振動[26];1400～1200 cm-1存在兩個吸收峰,為C-H的變角振動和C-O的彎曲振動[27];1080.09和1045.37 cm-1為吡喃糖苷的特征吸收峰[28];885.28 cm-1是β-吡喃環(huán)C-H的彎曲振動特征峰[29];765.70 cm-1是α-端基差向異構體的C-H變角振動[30];636.48、524.61 cm-1處弱的吸收峰可能是酰胺中的-NH2扭曲振動形成的[31];由此可知,GLP為β-吡喃型多糖。

圖7 GLP的紅外光譜圖

2.2.3 掃描電鏡分析 圖8(A)顯示在低倍鏡下可以看出多糖層疊到了一起、形狀不規(guī)則且表面有較多褶皺;圖8(B)可以看出其主要由碎片狀聚集體所堆積組成,規(guī)整性不強,分布不均勻,并伴有少量絲帶狀連接結構;圖8(C)則能看到GLP呈現大量小碎片狀態(tài)并混有極少量的較大片層,碎片間聯系緊密,間距較小,同時可以觀察到表面平整光滑,這可能是由于許多不同結構或分子量的多糖在較強的分子間作用力下聚集成不定型結構,形成宏觀狀態(tài)下的結構和形貌特征[32]。

圖8 GLP的SEM圖

3 結論

以靈芝為原料,根據Fick第二定律建立起GLP的連續(xù)相變萃取一階擴散模型,此模型在一定程度上可以反映靈芝顆粒半徑、萃取溫度、流速以及萃取時間與多糖萃取液質量濃度之間的關系。并求得了不同溫度或不同流速下的速率常數、相對萃余率、半衰期等動力學參數,確立了萃取過程中的速率常數從333.15 K下的0.0017 min-1變化到373.15 K下的0.0065 min-1,相對萃余率符合中草藥溶出指數方程模型,溫度越高,半衰期越小,萃取效率越高。在溫度373.15 K、流速28 L/h以及萃取時間190 min時有最大多糖得率2.04%。同時分析了熱力學過程,結果顯示GLP萃取是一個自發(fā)吸熱的過程,萃取過程中吉布斯自由能隨溫度的增加而逐漸減小。試驗求得的動力學參數以及熱力學參數可為連續(xù)相變萃取靈芝多糖工業(yè)化生產提供數據參考和指導。本結果也可為天然活性物有效成分的生產工藝設計及操作條件的選擇和優(yōu)化提供有價值的依據。

高效凝膠滲透色譜法分析GLP分子量分布范圍為1.35×103～2.26×107Da,分子量分布范圍廣,不同分子量組分在GLP中占比差異大。紅外光譜表明GLP是一種β-吡喃型多糖,樣品中有少量蛋白質或氨基酸分子基團。掃描電鏡結果表明GLP呈褶皺狀,由碎片狀聚集體所組成,大小不均勻。因此,通過連續(xù)相變萃取得到的GLP可能具有較復雜的結構,而多糖具有的多種生物活性則與其較復雜的結構有密切聯系,有必要進行進一步的生物活性評價如體外細胞抗氧化、抗衰老活性、體外細胞和動物體內的免疫調節(jié)、抗腫瘤活性等,從而為推廣靈芝食用菌資源的高效利用和其活性成分的開發(fā)提供科學依據。