楊 萍,申元福,鄢 碩,李小紅,姚 倩,*

(1.成都大學(xué)藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室,四川成都 610106;2.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川成都 610106;3.四川科倫藥業(yè)股份有限公司,四川成都 610500;4.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川成都 610106)

石榴為石榴科石榴屬植物,原產(chǎn)于中亞,在我國亞熱帶及溫帶地區(qū)均有分布。石榴籽含油量可高達20%[1]。以前人們對石榴籽的認識不足,很少加以利用。近年來研究發(fā)現(xiàn)石榴籽油(pomegranate seed oil,PSO)具有抗氧化、抗癌、降血糖、提高機體免疫、抗菌等多種藥理作用[2-5],有極大的利用價值。

自納米乳化系統(tǒng)(self-nanoemulsifying system,SNES)是近年發(fā)展起來的一種新型給藥系統(tǒng),由油、乳化劑和助乳化劑組成,經(jīng)水或消化液稀釋后能自發(fā)形成粒徑在100 nm以下的納米乳[6]。由于納米乳分散度高,與小腸黏膜的接觸面積大,可顯著提高難溶組分的溶解度和口服生物利用度,被廣泛應(yīng)用于藥品和食品領(lǐng)域[7-9]。PSO作為油相用于微乳或納米乳的制備,不僅能增加配伍組分的溶解度,且由于PSO的多種生物活性,還能對配伍組分產(chǎn)生協(xié)同增效作用,增強傳遞體系的整體治療效果[10]。

PSO主要含多酚、黃酮及石榴酸等有效成分,提取溶劑對有效成分含量影響較大,最終引起其藥理作用的差異。SNES是PSO極有前途的一種制劑應(yīng)用形式,PSO SNES所形成的納米乳粒徑大小與其吸收及藥效發(fā)揮直接相關(guān)。目前對PSO提取工藝的研究大多僅以出油率作為考察指標,而未考慮提取溶劑對PSO有效成分和生物活性以及后續(xù)藥用制劑形式(納米乳)制備等的可能影響。因此,本實驗以PSO出油率、有效成分含量、抗氧化活性、PSO SNES制成的納米乳濁度及抗菌活性為指標,系統(tǒng)研究提取溶劑對PSO有效成分、生物活性與納米乳成型性的潛在作用規(guī)律,為PSO的質(zhì)量提升及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴籽 安徽亳州盛源藥材有限公司;酵母菌 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院生物基礎(chǔ)實驗室保存菌種;2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS) 南京奧多福尼生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;蘆丁(含量大于99.0%) 中國藥品生物制品檢定所;正癸酸甲酯(含量大于99.0%) 上海麥克林生化科技有限公司;石榴酸甲酯(經(jīng)GC面積歸一化分析含量大于95%) 實驗室自制;乙酸乙酯、正己烷、石油醚(沸程60～90 ℃)、二氯甲烷、環(huán)己烷 均為分析純,成都科龍化工試劑廠。

KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;5100B型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;RE-5203 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;DPH 060恒溫培養(yǎng)箱 上海實驗儀器廠有限公司;SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博訊實業(yè)有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 成都康宇科技有限公司;7890B氣相色譜儀 安捷倫公司;烏氏毛細管粘度計 上海申誼玻璃制品有限公司;Zetasizer Nano ZSP激光粒度測定儀 英國馬爾文公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PSO的提取 取石榴籽,粉碎,過80目篩,稱取一定量的粉末,按1∶10的比例加入提取溶劑,在40 ℃下以400 W功率超聲提取35 min,抽濾,40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑,得PSO[11]。

提取溶劑分別選擇乙酸乙酯、二氯甲烷、環(huán)己烷、正己烷及石油醚5種有機溶劑。測定不同有機溶劑提取的PSO的理化常數(shù)、抗氧化活性,制備PSO SNES,并稀釋為納米乳,測定納米乳濁度及PSO SNES抗酵母菌活性,以確定最佳提取溶劑。

1.2.2 PSO SNES的制備 分別以5種有機溶劑提取的PSO為油相,聚氧乙烯蓖麻油為乳化劑,聚乙二醇400為助乳化劑制備PSO SNES。取聚氧乙烯蓖麻油、聚乙二醇400和PSO,按4∶4∶1比例旋渦混勻,以400 W功率超聲8 min除去氣泡,即得PSO SNES[10]。

1.2.3 理化指標

1.2.3.1 出油率 以PSO與石榴籽質(zhì)量比計算出油率[12]。

1.2.3.2 粘度 采用烏氏粘度儀測定35 ℃下PSO的相對粘度[13]。

1.2.3.3 酸值、碘值和皂化值 酸值采用熱乙醇滴定法[14],碘值采用中和滴定法[15],皂化值采用中和滴定法[16]。

1.2.3.4 總黃酮含量 PSO樣品中總黃酮含量的測定參照NaNO2-Al(NO3)3法進行[17]。

a.蘆丁標準曲線繪制:蘆丁在0.025～0.800 mg/mL濃度范圍內(nèi)的標準曲線回歸方程為:Y=0.7746X+0.0043;相關(guān)系數(shù)為0.9999,吸光度與蘆丁濃度呈良好線性關(guān)系。

b.樣品測定:準確吸取PSO 0.25 mL于離心管中,加入1 mL乙醇-水(5∶1)溶液,于旋渦混合儀上旋渦提取5 min,10000 r/min下離心10 min,收集上清液,重復(fù)提取3次,合并提取液,即得樣品供試液。在506 nm波長處測定樣品供試液吸光度值,利用蘆丁標準曲線計算出樣品中總黃酮的含量,以每毫升油蘆丁當量(mg/mL)表示。

1.2.3.5 總多酚含量 PSO樣品中總多酚含量的測定參照Folin-Ciocalteu法進行[18]。

a.沒食子酸標準曲線的繪制:沒食子酸在5～160 μg/mL濃度范圍內(nèi)的標準曲線回歸方程為:Y=0.0077X+0.0351;相關(guān)系數(shù)為0.9991,吸光度與沒食子酸濃度呈良好線性關(guān)系。

b.樣品測定:精確移取石榴籽油0.25 mL于離心管中,加入80%乙醇溶液0.5 mL,于旋渦振蕩儀上旋渦提取5 min,10000 r/min下離心10 min,收集上清液,重復(fù)提取3次,合并提取液,即得樣品供試液。取樣品供試液,在765 nm波長處測定吸光度值,根據(jù)沒食子酸回歸方程計算出樣品中總多酚的含量,以每毫升油沒食子酸當量(μg/mL)表示。

1.2.3.6 石榴酸含量 a.氣相色譜分析條件[19]:色譜柱為HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),載氣為高純氮氣,柱流量1.2 mL/min,進樣口分流比20∶1,進樣口溫度270 ℃,進樣量為1 μL,FID溫度為310 ℃。毛細管柱程序升溫:90 ℃開始,保持3 min,以15 ℃/min升溫至180 ℃,保持10 min,再以2.5 ℃/min升溫至250 ℃。

b.石榴酸甲酯標準曲線的繪制:石榴酸甲酯在235.63～3770 μg/mL濃度范圍內(nèi)的標準曲線回歸方程為:Y=0.0018X+0.0738;相關(guān)系數(shù)為0.9999,石榴酸甲酯與內(nèi)標癸酸甲酯峰面積比值與濃度呈良好線性關(guān)系。

c.樣品測定:取PSO 15 mg于具塞試管中,加入0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液4 mL,70 ℃水浴反應(yīng)5 min,冷卻至室溫后加入適量濃鹽酸調(diào)pH至4～5,加入15 mg/mL癸酸甲酯內(nèi)標溶液0.1 mL,用正己烷漩渦提取3次,每次2 mL,合并3次提取液,經(jīng)過濾后進行GC分析,根據(jù)標準曲線計算每毫克油中石榴酸含量。

1.2.4 抗氧化指標

1.2.4.1 DPPH·清除率 經(jīng)預(yù)試驗確定PSO樣品在測試濃度下背景無吸收(1.2.4.2同),分別量取不同體積PSO及VE油,置試管中,加入200 μL異丙醇使油溶解,用無水乙醇稀釋至1 mL,混勻;加入DPPH·溶液2 mL,混勻,室溫暗處放置30 min,于517 nm處測定吸光度A1[20]。以無水乙醇代替油,同法操作,測定吸光度A0。按下式計算清除率:

1.2.5 納米乳濁度的測定 將PSO SNES經(jīng)5倍水稀釋,在500 nm波長處測定濁度值。

1.2.6 PSO SNES抗酵母菌活性測定 經(jīng)預(yù)實驗確定PSO SNES樣品在測試濃度下對檢測無影響[22]。采用50%酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌,其中含瓊脂0.2%。將酵母菌稀釋成密度為104CFU/mL的菌液,分別取3 mL,置于具塞試管中,分別加入0.025～1.6 mL的PSO SNES,用培養(yǎng)基稀釋至5 mL,混勻;以水代替PSO SNES,同法操作,作為空白對照組。取樣品液與空白對照液,在600 nm波長處測定初始濁度值;將其放入培養(yǎng)箱,在37 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)8 h,取出,加入84消毒液0.5 mL,混勻,室溫放置30 min后,測定濁度值;計算培養(yǎng)前后濁度增加度,按下式計算抑菌率[22]:

式中:ΔA0:空白對照組菌液濁度增加值;ΔA1:PSO SNES組菌液濁度增加值。

1.2.7 相關(guān)性分析 采用SPSS 18.0軟件分別對數(shù)據(jù)標準化后,分析PSO抗氧化活性、PSO SNES形成的納米乳濁度及抗菌活性與各理化常數(shù)之間的相關(guān)性,探索PSO有效成分含量、理化性質(zhì)對其活性及納米乳形成的影響規(guī)律。

1.2.8 主成分分析篩選提取溶劑 選擇PSO多酚、黃酮及石榴酸含量為有效成分指標,出油率為產(chǎn)量指標,自由基半數(shù)清除濃度(concentration at 50% clearance rate,CL50)為抗氧化活性指標,PSO SNES形成的納米乳濁度為納米乳粒徑指標,PSO SNES對酵母菌的半數(shù)抑菌濃度(concentration at 50% inhibitory rate,IC50)為抗菌活性指標,采用SPSS18.0軟件經(jīng)過降維處理后,進行主成分分析。為使評分與各指標呈正相關(guān),即指標值越大,評分越高,抗氧化、抗菌活性及納米乳大小分別以1/CL50、1/IC50及濁度的倒數(shù)表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各組數(shù)據(jù)均為3次平行試驗的平均值(Mean)±標準偏差(SD),采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA統(tǒng)計學(xué)分析和Duncan單因素多重比較分析,當P<0.05時,表明數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSO理化性質(zhì)

用激光粒度測定儀測定了PSO(石油醚)作油相制備的PSO SNES經(jīng)5倍水稀釋后形成的納米乳粒徑,為(27.22±2.02) nm,表明PSO SNES有較好的自納米乳化能力。研究顯示,納米乳濁度與粒徑呈顯著正相關(guān)[23],本實驗采用濁度法考察提取溶劑對PSO納米乳粒徑的影響。PSO經(jīng)5種不同有機溶劑提取后的出油率、理化性質(zhì)、相關(guān)含量測定結(jié)果及制備的納米乳濁度見表1。由表1可知,不同提取溶劑對PSO粘度、酸值、黃酮、多酚、石榴酸含量及納米乳濁度有很大影響。二氯甲烷制備的PSO粘度最高,石油醚最低;乙酸乙酯所得PSO多酚含量最高,且其納米乳濁度最低;石油醚所得PSO石榴酸含量最高。

表1 PSO的出油率、理化性質(zhì)、有效成分及納米乳濁度

2.2 PSO抗氧化活性

不同提取溶劑所得PSO對DPPH·及ABTS+·清除率見圖1。由圖1可知,溶劑對兩種自由基的影響趨勢基本相似。以油濃度為0.2%(v/v)時的清除率做統(tǒng)計學(xué)分析,顯示抗氧化順序為乙酸乙酯、二氯甲烷>環(huán)己烷、正己烷、石油醚>VE(P<0.05),表明雖然不同溶劑提取的PSO抗氧化活性存在差異,但均顯著高于陽性對照VE(P<0.05);5種溶劑中,乙酸乙酯或二氯甲烷所得PSO(體積分數(shù)0.4%除外)對自由基的清除能力顯著強于其他三種溶劑(P<0.05),三種溶劑間無明顯差異(P>0.05)。

圖1 提取溶劑對PSO的DPPH·(A)及ABTS+·(B)清除率的影響

2.3 PSO SNES 抗酵母菌活性

前期研究中發(fā)現(xiàn)PSO SNES對革蘭氏陽性菌抗菌活性不佳,對革蘭氏陰性菌有較強抗菌作用,但不同有機溶劑制得的PSO SNES抗陰性菌活性差異不明顯,因此本文僅探討了PSO SNES對真菌酵母菌的抗菌作用。不同溶劑所得PSO SNES對酵母菌的抑制作用見圖2?？梢?各PSO SNES在低濃度時對酵母菌抑菌率相差相對較大,濃度為8%(v/v)時抑菌率順序為乙酸乙酯、石油醚>正己烷>環(huán)己烷、二氯甲烷(P<0.05);隨著濃度的增高,抑菌率逐漸增大,濃度達32%時抑菌率趨于一致。

圖2 提取溶劑對PSO SNES抗酵母菌活性的影響

2.4 與理化常數(shù)的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果分別見表2～表4。由表2～表4可知,PSO抗氧化活性主要與多酚含量與皂化值呈顯著正相關(guān)(P<0.05),皂化值與多酚含量越高,油的抗氧化活性越強。

表4 PSO SNES抗酵母菌活性與PSO理化常數(shù)的相關(guān)性分析

表2 PSO抗氧化活性與理化常數(shù)的相關(guān)性分析

PSO SNES制出的納米乳濁度受皂化值的影響較大,皂化值大的PSO不僅抗氧化活性強，還可制備出濁度低、粒徑小的納米乳?？赡艿脑驗?皂化值為油中酯及游離脂肪酸含量的總和,在酸值相當?shù)那闆r下,油酯含量越高,皂化值越大。PSO中的酯多以甘油酯和磷脂的形式存在[24],磷脂屬于兩性離子型表面活性劑,其含量高不僅能改善油與自由基的親和作用,同時有助于納米乳的形成。甘油酯包括甘油一、二及三酯,其中甘油一酯和二酯分別含有兩個和一個游離的羥基,增大了油的親水性,使其能具有適宜的親水親油平衡值,改善PSO與自由基的相互作用,增強油對自由基的清除能力。油親水性的提高還利于與納米乳處方中的乳化劑及助乳化劑相結(jié)合,形成粒徑小的納米乳。

PSO SNES抗酵母菌活性與PSO的理化常數(shù)及有效成分含量均無明顯關(guān)聯(lián)。究其原因,納米乳的抗菌活性可能取決于所用油相、乳化劑及助乳化劑的協(xié)同作用,最終使細菌的細胞膜破裂[25],與單一某種因素的關(guān)系不密切。

表3 PSO SNES濁度與PSO理化常數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 主成分分析篩選提取溶劑

因PSO清除DPPH與ABTS+自由基的趨勢基本相似,實驗僅選擇了DPPH自由基的1/CL50作為抗氧化活性指標進行主成分分析。主成分分析的目的是通過降維作用將多個因子變量轉(zhuǎn)化成少數(shù)綜合性變量,利用少數(shù)的指標來反映整體的信息。因此將出油率、有效成分(多酚、黃酮、石榴酸)含量、濁度倒數(shù)、抗氧化活性、抗酵母菌活性7個指標進行主成分分析。采用SPSS18.0軟件將7個指標降維為3個主成分,主成分對方差累積貢獻率為93.047%,表明3個主成分可以有效地反應(yīng)原始變量的絕大部分信息,達到降維目的,從而能夠綜合評價提取溶劑對PSO生物活性及納米乳形成的影響。各指標對主成分的載荷圖見圖3。由圖3可知,主成分1主要代表了黃酮、多酚、石榴酸含量、抗氧化活性及納米乳濁度5個指標,載荷系數(shù)在0.77以上;主成分2及主成分3分別主要與出油率和納米乳抗酵母菌活性相關(guān),載荷系數(shù)在0.81以上。

圖3 主成分載荷圖

為了綜合評價提取溶劑對PSO生物活性及納米乳形成的影響,根據(jù)標準化的各指標與因子載荷矩陣計算各提取溶劑得分及各指標權(quán)重,公式如下:

其中,H為提取溶劑總分,A、B、C分別為主成分1、2及3特征值的平方根,FAC1、FAC2及FAC3為軟件計算出的各主成分因子值,V1、V2及V3分別為主成分1、2及3的方差貢獻率;Wi為第i個指標的權(quán)重,L1i、L2i、L3i分別為第i個指標在主成分1、2及3的載荷系數(shù),n為主成分分析的指標(本實驗n=7)。

乙酸乙酯、二氯甲烷、環(huán)己烷、正己烷及石油醚的計算總分分別為1.46、-0.03、-0.66、-1.44和0.68,乙酸乙酯得分最高,其次為石油醚,正己烷得分最低。說明以乙酸乙酯為提取溶劑,制得的PSO有效成分含量與生物活性綜合評分為最佳。權(quán)重大的指標對綜合得分影響較大,各指標權(quán)重計算結(jié)果見表5。由表5可知,權(quán)重大于0.12的指標由高至低依次為出油率、石榴酸含量、抗酵母菌活性和多酚含量。由于各提取溶劑提取的PSO出油率相差不大,因此提取溶劑在這項指標上得分亦相差不大;在其余幾項權(quán)重較高的指標中,乙酸乙酯提取的PSO抗酵母菌活性與多酚含量為最高,其石榴酸含量僅次于石油醚,與二氯甲烷近似,故乙酸乙酯的總分最高。由于多酚類物質(zhì)帶有多個羥基,極性較大,而在5種有機溶劑中,乙酸乙酯的極性相對較大,使得PSO(乙酸乙酯)多酚含量遠高于其他幾種溶劑;石榴酸在PSO中以酯的形式存在,乙酸乙酯作為酯類溶劑,對石榴酸酯也表現(xiàn)出了優(yōu)異的提取率。

表5 各指標權(quán)重

3 結(jié)論

不同提取溶劑對PSO的有效成分含量及納米乳的形成有很大影響;PSO抗氧化活性與PSO多酚含量及皂化值呈顯著正相關(guān)(r>0.9,P<0.05),PSO SNES形成的納米乳濁度與油的皂化值為負相關(guān)(r=-0.798),即皂化值越大,納米乳粒徑越小。以油的出油率、有效成分含量、抗氧化活性、PSO SNES形成的納米乳濁度及PSO SNES的抗酵母菌活性為指標進行主成分分析與評分,乙酸乙酯、二氯甲烷、環(huán)己烷、正己烷及石油醚的得分分別為1.46、-0.03、-0.66、-1.44和0.68,乙酸乙酯綜合評分為最高,其次為石油醚。后續(xù)實驗可就提取溶劑對油的抗癌、降脂及降糖等活性的影響開展相關(guān)工作。