朱作藝,張 玉,王君虹,李 雪,王 偉,*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,浙江杭州 310021;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部創(chuàng)意農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310021)

蜂王漿(Royal Jelly),又稱蜂皇漿,是青年工蜂咽下腺和上顎腺分泌的漿狀物質(zhì),是蜂王終身的食物[1]。蜂王漿具有眾多營養(yǎng)保健功能,具有調(diào)節(jié)免疫力[2]、抗菌消炎[3-4]、抗衰老[5]、抗腫瘤[6]、降血壓[7]、降血糖[8]和促進(jìn)細(xì)胞生長等功能[9]。另外,蜂王漿還具有抗疲勞、降血脂、改善睡眠、保護(hù)肝臟、護(hù)膚養(yǎng)顏等作用,是一種珍貴的天然食物,被稱為“液體黃金”[10]。

我國是世界上生產(chǎn)和輸出蜂王漿最多的國家,大部分蜂王漿產(chǎn)品均為原料產(chǎn)品,但蜂王漿本身口感辛辣,粘稠,溶解性欠佳,這些感官和理化特性制約了蜂王漿的市場空間和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蜂王漿中富含蛋白質(zhì),其蛋白含量約占蜂王漿干物質(zhì)的30%～50%[11]。從營養(yǎng)學(xué)角度,蜂王漿作為原料產(chǎn)品也嚴(yán)重制約了其蛋白質(zhì)的利用價(jià)值,從蜂王漿中提取分離出的大部分成分為大分子量的蛋白質(zhì),不能直接被人體吸收,在體內(nèi)的作用機(jī)制存在一定的模糊性。生物活性肽是源于蛋白質(zhì)的具有生理作用的肽類化合物,具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能,比原料蛋白更容易消化吸收,具有更優(yōu)異的理化特性、營養(yǎng)特性和生物學(xué)活性。除此之外,生物活性肽的食用安全性高,近年來,國內(nèi)外學(xué)者開展了一系列天然動、植物蛋白源多肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和功能活性研究[12-15]。目前,針對蜂王漿,研究較多的是蜂王漿蛋白的鑒定和生物學(xué)活性,而針對其蜂王漿蛋白酶水解后的產(chǎn)物則研究較少,尤其是對蜂王漿蛋白酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)組成和降血糖活性研究更少。

因此,本實(shí)驗(yàn)擬提取鮮蜂王漿蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下進(jìn)行酶解,制得蜂王漿蛋白源活性肽,并研究蜂王漿蛋白活性肽的氨基酸組成、相對分子質(zhì)量分布情況,以及制備的蜂王漿蛋白肽對α-葡萄糖苷酶的抑制作用和其對ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基的清除能力,以期為研制具有降血糖及抗氧化功能的蜂王漿制品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂王漿 2017年3月生產(chǎn)于安徽宿松的油菜花期蜂王漿;木瓜蛋白酶(800 U/mg)、酸性蛋白酶(50 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、菠蘿蛋白酶(300 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(20 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)(>97%)、α-葡萄糖苷酶(Intestinal acetone powders from rat)、4-硝基苯基-α-D-呋喃葡萄糖苷(PNPG)(>99%) 美國Sigma公司;阿卡波糖 德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(ABTS法)、羥自由基測試試劑盒及抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑(均為分析純) 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

PHS-3C pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;AMR-100全自動酶標(biāo)分析儀 杭州奧盛儀器有限公司;EZ-2真空濃縮工作站 美國Genevac公司;N5000紫外-可見光分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;TDL-60B低速臺式離心機(jī) 上海安亭設(shè)備有限公司;SHZ-82A型水浴恒溫振蕩器 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司;SYCOM型S-433D氨基酸分析儀 德國SYKAM公司;TSKgel G2000SWXL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm) 日本TOSOH公司;冷凍干燥機(jī) 上海皓莊儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂王漿蛋白提取 取一定量的鮮蜂王漿,參照文獻(xiàn)[16]采用堿提酸沉法進(jìn)行蜂王漿蛋白提取。堿提酸沉法的最佳工藝參數(shù)(蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH4.0)為:抽提pH10,料液比1∶4(質(zhì)量比),抽提溫度35 ℃,抽提時(shí)間2 h,沉淀時(shí)間1 h,沉淀溫度5 ℃,沉淀后4000 r/min離心15 min,去清液后得到的沉淀為蜂王漿蛋白。

1.2.2 蛋白酶的選擇 稱取一定量的蜂王漿蛋白,加入不同蛋白酶進(jìn)行酶解,酶解條件見表1。酶解結(jié)束后,沸水浴滅酶10 min,7500 r/min離心10 min,取上清液測定α-葡萄糖苷酶抑制率和ABTS自由基清除率,篩選出最佳蛋白酶。

表1 6種蛋白酶的最優(yōu)酶解條件

1.2.3 蜂王漿蛋白肽的制備 稱取蜂王漿蛋白100 g,按照料液比1∶10加入去離子水,總加酶量為6000 U/g,調(diào)pH為4.0，采用酸性蛋白酶酶解4 h,酶解溫度43 ℃,經(jīng)90 ℃高溫滅酶15 min,4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,取上清液冷凍干燥后制得蜂王漿蛋白肽。

1.2.4 蜂王漿蛋白肽氨基酸組成的測定 準(zhǔn)確稱取0.1 g蜂王漿蛋白肽,加入10 mL 6 mol/L HCl水解22 h,用氨基酸自動分析儀分析其氨基酸組成和含量[17]。

1.2.5 蜂王漿蛋白肽分子量大小及分布 準(zhǔn)確稱取10 mg蜂王漿蛋白肽,加入去離子水定容至10 mL,溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,采用凝膠過濾色譜法分析制備的蜂王漿蛋白肽的分子量分布[18]。色譜條件為:色譜柱為TSKgel G2000SWXL(7.8 mm×300 mm);流動相為乙腈/超純水/三氟乙酸=45/55/0.1(V/V);流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長220 nm。選用胰島素(MW=5807 Da)、桿菌肽(MW=1450 Da)、甘氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸(MW=451 Da)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(MW=189 Da)為分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品,以出峰時(shí)間為橫坐標(biāo),相對分子質(zhì)量的對數(shù)值(lg)為縱坐標(biāo),制作校正曲線。

1.2.6 蜂王漿蛋白肽對α-葡糖糖苷酶抑制活性的測定 參照Boath等[19]和Raju等[20]的測定方法,分別配制0.1 mol/L pH6.9 的磷酸緩沖液,5 mg/mL的α-葡糖糖苷酶溶液,5 mmol/L的PNPG溶液和0.67 mol/L的Na2CO3溶液,反應(yīng)試劑按表2依次添加,待添加完100 μLα-葡糖糖苷酶溶液后,混勻,于25 ℃反應(yīng)10 min;再添加PNPG溶液和緩沖溶液,混勻,于37 ℃反應(yīng)10 min;最后加入Na2CO3溶液,混勻后利用酶標(biāo)儀測定405 nm波長處吸光值,并按公式計(jì)算抑制率。阿卡波糖是常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑,本試驗(yàn)以阿卡波糖為陽性對照,對不同濃度(0.1～20 mg/mL)蜂王漿蛋白肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率進(jìn)行測定,并計(jì)算相應(yīng)的半抑制濃度(IC50),評價(jià)其降血糖活性。

表2 α-葡糖糖苷酶活性測定體系的組成成分

1.2.7 蜂王漿蛋白肽體外抗氧化活性的測定

1.2.7.1 ABTS自由基清除能力測定 參照文獻(xiàn)[21]測定。分別量取25 mL 7.4 mmol/L ABTS溶液和25 mL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液,等體積混勻后,室溫避光反應(yīng)12～16 h,然后取一定體積上述混合液,再用無水乙醇稀釋40～50倍,室溫避光后放置30 min后,在734 nm處測定其吸光度為0.70±0.02,制備得到ABTS工作液。取20 μL待測樣品液(濃度范圍為0.1～20 mg/mL)和280 μL ABTS工作液于96孔酶標(biāo)板,734 nm處測定吸光值A(chǔ)1,以去離子水代替樣品液的吸光值為A2,并以維生素C(VC)為陽性對照。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下:清除率(%)=(A2-A1)/A2×100。

1.2.7.2 羥自由基清除能力測定 參照文獻(xiàn)[22]測定。取1.0 mL待測樣品液(濃度范圍為0.1～20 mg/mL)依次加入2.0 mL 1.8 mmol/L FeSO4,1.5 mL 1.8 mmol/L水楊酸-乙醇和0.1 mL 8.8 mmol/L H2O2,37 ℃水浴 30 min。反應(yīng)結(jié)束后取200 μL混合液于96孔酶標(biāo)板,510 nm處測定吸光值A(chǔ)1,以去離子水代替樣品液的吸光值為A2。以VC為陽性對照。羥自由基清除率計(jì)算公式如下:清除率(%)=(A2-A1)/A2×100。

1.2.7.3 超氧陰離子自由基清除能力測定 參照文獻(xiàn)[23]測定。吸取4.5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)于試管中,再吸取2.0 mL蒸餾水于試管中,然后吸取1.0 mL待測樣品(濃度范圍為0.1～20 mg/mL)液于試管中,將其充分混勻后,放置在25 ℃水浴鍋中,放置20 min后,吸取0.5 mL 3.0 mol/L的鄰苯三酚溶液于該試管中,迅速搖勻,用蒸餾水調(diào)零,利用紫外分光光度計(jì)于波長325 nm處測吸光度A1,以去離子水代替樣品液的吸光值為A2。以VC為陽性對照。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下:清除率(%)=(A2-A1)/A2×100。

1.2.7.4 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除率測定參照文獻(xiàn)[24]:取100 μL待測樣品液(濃度范圍為0.1～20 mg/mL)與100 μL DPPH(95%乙醇配制)溶液均勻混合,室溫條件下避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測吸光度值A(chǔ)1。100 μL DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為對照組(A2),100 μL 95%乙醇與100 μL去離子水反應(yīng)為空白組(A0)。以VC為陽性對照。DPPH自由基清除率公式如下:清除率(%)=(A2-A1)/(A2-A0)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由平均值±SD 表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析,組間差異比較采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)來比較其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

本實(shí)驗(yàn)選擇了6種常見的蛋白酶,6種蛋白酶均在其最佳酶解條件(溫度和pH)下,以相同的酶活力、酶解時(shí)間及料液比條件(見表1),對提取的蜂王漿蛋白進(jìn)行酶解,然后分別測定酶解后上清液的α-葡萄糖苷酶抑制率和總ABTS自由基清除率。由圖1A可知,6種蛋白酶中以風(fēng)味蛋白酶制備的蜂王漿蛋白肽具有最高的α-葡萄糖苷酶抑制能力,抑制率達(dá)到52.09%,其后依次是酸性蛋白酶(46.45%)、堿性蛋白酶(40.11%)、菠蘿蛋白酶(35.79%)、木瓜蛋白酶(33.88%)和中性蛋白酶(18.85%)。從圖1B中可以看出,酸性蛋白酶水解液的ABTS自由基清除率最高,為64.64%,其次是中性蛋白酶(52.07%)、風(fēng)味蛋白酶(36.66%)、堿性蛋白酶(33.55%)、木瓜蛋白酶(22.93%)和菠蘿蛋白酶(4.27%)。綜合考慮,由酸性蛋白酶酶解制備得到的多肽兼具較強(qiáng)的降血糖和抗氧化活性,同時(shí)蜂王漿pH在3.5～4.0之間,呈弱酸性,與酸性蛋白酶的酶解條件相匹配,因此,本研究選擇酸性蛋白酶為制備蜂王漿肽的最佳蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶酶解對蜂王漿肽的α-葡萄糖苷酶抑制率(A)及ABTS自由基清除率(B)的影響

2.2 蜂王漿蛋白肽氨基酸組成

本實(shí)驗(yàn)制備的蜂王漿蛋白肽經(jīng)氨基酸儀分析,其氨基酸組成及含量如表3所示,氨基酸的總量為82.19%,其中含量最高的氨基酸為天門冬氨酸(15.15%),其次是谷氨酸(10.36%)和亮氨酸(7.00%)。生物活性肽的氨基酸組成與其活性密切相關(guān),有研究者從動物蛋白中分離得到一系列抗氧化多肽,通過對這些多肽的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),這些抗氧化多肽的末端多為酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、組氨酸和亮氨酸,占總氨基酸的30%左右[25-27]。由表3可知,針對蜂王漿蛋白肽,上述6種氨基酸占其氨基酸總量的28.80%,其中亮氨酸含量為7.00%,苯丙氨酸含量為4.19%,這些氨基酸的存在可能直接影響著蜂王漿蛋白肽的抗氧化活性。

表3 蜂王漿蛋白肽氨基酸組成

2.3 蜂王漿蛋白肽分子量分布

由圖2可以看出,制備的蜂王漿蛋白肽通過凝膠色譜柱的出峰時(shí)間大部分集中在18～21 min內(nèi),通過分子量校正曲線(lgMw=-0.2554tR+7.5677,R2=0.9894,Mw為相對分子質(zhì)量,tR為保留時(shí)間)計(jì)算分子量大小,由表4可知,酶解后的蜂王漿蛋白肽相對分子質(zhì)量集中在1000 Da以下。相對分子質(zhì)量在 400～1000 Da左右的多肽組分峰面積占總面積的14.3%,180～400 Da左右的多肽組分含量最多,占78.9%,這些多肽可能基本以二肽、三肽和四肽為主;還有6.8%左右的組分相對分子質(zhì)量小于180 Da,基本為游離氨基酸和水解過度的氨基酸殘基[28-29]。酶解后的多肽分子量與蛋白酶種類和酶解時(shí)間相關(guān),酶解度不同,所形成的肽類化合物的分子量大小和結(jié)構(gòu)也不同,這將直接影響酶解產(chǎn)物的活性。因此,今后針對不同活性需求的蜂王漿多肽優(yōu)化其酶解程度,將能更好地發(fā)揮蜂王漿的營養(yǎng)功效。

表4 蜂王漿蛋白肽分子量分布

圖2 分子量標(biāo)準(zhǔn)(A)及蜂王漿蛋白肽(B)的凝膠過濾色譜圖

2.4 蜂王漿蛋白肽對α-葡萄糖苷酶的抑制能力

從圖3可知,在0～2 mg/mL濃度范圍內(nèi),蜂王漿蛋白肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著濃度增大而升高,2 mg/mL后升高緩慢,濃度為20 mg/mL時(shí),抑制率為63.86%,其IC50值為6.94 mg/mL。而阿卡波糖濃度為5 mg/mL時(shí),其對α-葡萄糖苷酶的抑制率高達(dá)95.14%。試驗(yàn)結(jié)果表明,蜂王漿蛋白肽具有一定的降血糖活性,其活性低于陽性對照藥物阿卡波糖,這可能是因?yàn)榉渫鯘{蛋白肽是粗酶解產(chǎn)物,未經(jīng)進(jìn)一步的分離純化。藥物阿卡波糖雖然能較好地控制血糖,但長期服用容易產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)會伴隨著許多不良反應(yīng)和副作用。蜂王漿蛋白肽作為天然產(chǎn)物,食用安全性高,目前尚未見有關(guān)于抑制α-葡萄糖苷酶活性的蜂王漿蛋白肽報(bào)道。因此,基于本實(shí)驗(yàn)研究的蜂王漿蛋白酶解產(chǎn)物具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,可進(jìn)一步對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,篩選出高活性的多肽單一組分,對于糖尿病的治療具有重要的意義。

圖3 蜂王漿蛋白肽對α-葡萄糖苷酶的抑制能力

2.5 蜂王漿蛋白肽體外抗氧化活性

2.5.1 ABTS自由基清除能力 從圖4A可知,不同質(zhì)量濃度的蜂王漿蛋白肽和VC對ABTS自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而增加,呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應(yīng)。在0～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi),VC對ABTS自由基的清除率隨著濃度增大而迅速升高;濃度為2.0 mg/mL時(shí),其ABTS自由基清除率高達(dá)88.91%。相同質(zhì)量濃度情況下,蜂王漿蛋白肽對ABTS自由基的清除率低于VC,尤其當(dāng)濃度大于5 mg/mL時(shí),升高緩慢。蜂王漿蛋白肽濃度為20.0 mg/mL時(shí),其清除率為54.03%,對ABTS自由基清除能力的IC50值為14.18 mg/mL。

圖4 蜂王漿蛋白肽對ABTS自由基(A)、羥自由基(B)、超氧陰離子自由基(C)和DPPH自由基(D)的清除能力

2.5.2 羥自由基清除能力 由圖4B可知,在0～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi),蜂王漿蛋白肽與VC的羥自由基清除能力與質(zhì)量濃度之間存在明顯的線性關(guān)系;質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),蜂王漿蛋白肽對羥自由基的清除率高達(dá)74.24%,相同濃度下VC的清除率為89.53%。當(dāng)濃度大于1.0 mg/mL時(shí),兩者對羥自由基的清除率均升高緩慢,蜂王漿蛋白肽清除羥自由基能力的IC50值為0.45 mg/mL,顯著低于文獻(xiàn)報(bào)道的鳀魚酶解肽[29]及鮑魚蛋白肽[30]對羥自由基的清除能力。一般認(rèn)為某種物質(zhì)的IC50低于10.0 mg/mL時(shí),說明其具有良好的抗氧化性[31]。

2.5.3 超氧陰離子和DPPH自由基清除能力 不同質(zhì)量濃度的蜂王漿蛋白肽對超氧陰離子和DPPH自由基清除能力的影響趨勢(圖4C和4D),類似于對ABTS自由基的清除效果,蜂王漿蛋白肽濃度為20.0 mg/mL時(shí),對超氧陰離子和DPPH自由基的清除率分別為62.79%和51.10%,IC50值分別為11.02和18.38 mg/mL,遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的鳀魚酶解肽[29]及鮑魚蛋白肽[30]對DPPH、超氧陰離子自由基等的清除能力。蜂王漿蛋白肽對ABTS、超氧陰離子和DPPH自由基具有類似的清除效果,而對羥自由基清除能力呈現(xiàn)不一樣的影響趨勢,這可能是由于對ABTS、超氧陰離子和DPPH自由基的清除是基于電子傳遞方法,而對羥自由基的清除是基于氫傳遞方法導(dǎo)致的[33]。

以上結(jié)果表明,蜂王漿蛋白肽對羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力,同時(shí)還具有一定的ABTS、超氧陰離子和DPPH自由基清除能力。多肽的抗氧化活性同樣與其氨基酸序列有關(guān),有研究表明由2～4個氨基酸分子組成的小肽,當(dāng)其C-端氨基酸殘基多為芳香族氨基酸(Trp、Tyr)和Pro、His,同時(shí)N-端多含疏水性氨基酸Val、Leu、Ile、Ala、Lys時(shí),其抗氧化活性尤其高[32]。由此可知,蜂王漿原蛋白本不具抗氧化活性,通過蛋白酶的水解,可以釋放出具有類似以上結(jié)構(gòu)特征的小分子肽類化合物,從而產(chǎn)生抗氧化活性。

3 結(jié)論

蜂王漿中富含蛋白質(zhì),本研究篩選了制備蜂王漿降血糖及抗氧化活性肽的最佳蛋白酶,酶解工藝條件為:酸性蛋白酶,酶添加量為6000 U/g,酶解溫度為43 ℃,酶解pH為4.0,酶解時(shí)間為4 h,料液比為1∶10。體外降血糖及抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蜂王漿蛋白肽具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶能力和清除ABTS自由基、DPPH自由基和超氧陰離子能力及較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。由于本研究制備的蜂王漿蛋白肽是粗酶解物,因此對于蜂王漿蛋白肽的分離純化、結(jié)構(gòu)功能鑒定等方面還有待于今后的進(jìn)一步研究,深入挖掘高活性的蜂王漿蛋白肽組分,發(fā)揮蜂王漿的營養(yǎng)功效。