吳碩，賈彥麗，智福軍

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 石家莊果樹(shù)研究所，河北 石家莊 050061)

核桃 (JuglansregiaL.) 為胡桃科胡桃屬落葉喬木，其果實(shí)可作干果，又可作油料，是重要的木本油料樹(shù)種[1-2]。低溫傷害是北方核桃生產(chǎn)中存在的主要問(wèn)題，尤其核桃幼樹(shù)，枝條髓心大、含水量高，極易遭受凍害影響[3-6]。近年來(lái)，隨著全球變暖帶來(lái)的極端氣候頻發(fā)，凍害發(fā)生普遍且有加重趨勢(shì)，已成為制約核桃生產(chǎn)的突出問(wèn)題[7-9]。因此評(píng)價(jià)和篩選抗凍核桃品種對(duì)于核桃生產(chǎn)的防凍減災(zāi)和抗凍育種都有重要的指導(dǎo)意義。

前人研究發(fā)現(xiàn)，核桃莖葉的組織結(jié)構(gòu)、胞膜透性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度可以作為核桃品種抗寒性鑒定的預(yù)選指標(biāo)[6-7，10]。在低溫條件下，植物膜透性、電導(dǎo)率、組織含水量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖和可溶性蛋白等)以及保護(hù)酶活性等都會(huì)發(fā)生變化[11-14]，抗凍和易受凍害品種的物質(zhì)含量和變化趨勢(shì)顯著不同，可以作為品種抗寒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

本研究擬評(píng)價(jià)2個(gè)從贊皇優(yōu)選的抗凍核桃品系，通過(guò)與已知的較抗寒品種遼寧1號(hào)和抗寒性較差的清香品種在不同低溫處理下，對(duì)比與抗寒性相關(guān)的各項(xiàng)保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)指標(biāo)，分析抗寒性生理生化指標(biāo)含量和變化規(guī)律，明確優(yōu)選試材抗寒性，為篩選抗凍核桃品種及抗凍育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年12月11日，在贊皇嶂石巖下北莊采集贊核1號(hào)(Ⅰ)和贊核2號(hào)(Ⅱ)2個(gè)核桃優(yōu)系，以及較抗寒品種遼寧1號(hào)(Ⅲ)和較不抗寒品種清香(Ⅳ)2個(gè)品種的1 a生無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的枝條，帶回石家莊果樹(shù)研究所中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

將采集的枝條剪成25 cm的枝段，用自來(lái)水沖洗數(shù)遍，洗掉泥土、灰塵，再用蒸餾水沖洗 3次，用潔凈的紗布擦干水分，保鮮袋封裝備用。每個(gè)品種(系)的枝條分成等份的4份，每份10根。處理溫度設(shè)置為CK(對(duì)照，0 ℃)，-10 ℃，-20 ℃和-30 ℃，以-5 ℃每小時(shí)降溫，降至所設(shè)溫度后維持12 h，然后以5 ℃每小時(shí)升溫至0 ℃。每處理重復(fù)3次。

1.2 試驗(yàn)方法

將處理后枝條，剪成1～2 mm碎片，混勻后液氮速凍，錫紙包裹后裝保鮮袋-70 ℃保存。用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、可溶性糖和可溶性蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)核桃1 a生枝條SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(簡(jiǎn)稱(chēng)SOD)能夠催化超氧化物通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫的酶。環(huán)境脅迫可造成體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，SOD酶活性下降，活性氧自由基大量積累，膜完整性下降。因此。SOD活性與植物逆境下抗逆能力密切相關(guān)。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下SOD活性變化情況見(jiàn)圖1。

圖1 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下SOD活性變化Figure 1 Changes of SOD activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由圖1可知，4個(gè)品種(系)1 a生枝條隨溫度下降變化趨勢(shì)不同，其中Ⅰ和Ⅱ變化相似，隨溫度變化，呈現(xiàn)升-降-升的趨勢(shì)。Ⅲ在0 ℃至-20 ℃變化趨勢(shì)與Ⅰ和Ⅱ相同，但在溫度由-20 ℃降至-30 ℃時(shí)，SOD酶活性仍呈下降趨勢(shì)。Ⅳ變化趨勢(shì)則與其余品種相反，呈現(xiàn)降-升-降的變化趨勢(shì)。

在0 ℃時(shí)，Ⅳ SOD活性顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，為325 U/g。隨溫度下降，I活性變化不顯著，變化幅度僅為20 U/g。在-10 ℃時(shí)I和ⅢSOD酶活性達(dá)到頂峰，分別為204 U/g和223 U/g。Ⅱ在-30℃時(shí)酶活性最高，為201 U/g。

在0 ℃時(shí)Ⅳ的 SOD活性顯著高于其余品種(系)，表明SOD酶活性已經(jīng)被激活，用于消除低溫帶來(lái)的活性氧傷害。也表明Ⅳ受低溫凍傷程度明顯高于其余品種(系)。此后隨溫度下降，Ⅳ的SOD活性均低于0 ℃時(shí)，表明低溫已對(duì)其造成傷害，部分細(xì)胞受到凍害，SOD活性下降。Ⅰ、Ⅲ和Ⅱ的SOD活性分別在-10 ℃和-30 ℃達(dá)到峰值，表明在此溫度下SOD活性被完全激發(fā)，表明其抗寒能力均高于0 ℃時(shí)達(dá)到峰值的Ⅳ。

2.2 低溫對(duì)核桃1 a生枝條CAT活性的影響

過(guò)氧化氫(Hydrogenperoxide，H2O2)是生物細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種活性氧。逆境脅迫下，活性氧的產(chǎn)生量超過(guò)系統(tǒng)清除能力，由此造成氧化損傷。植物在低溫脅迫下，體內(nèi)CAT酶活性代表植物對(duì)低溫的抗性能力。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下CAT活性變化情況見(jiàn)圖2。

圖2 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下CAT活性變化Figure 2 Changes of CAT activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由圖2可知，在低溫脅迫下，4個(gè)品種(系)枝條中CAT活性同SOD活性一致，呈現(xiàn)出2種不同的變化趨勢(shì)。其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ變化趨勢(shì)相同，CAT活性隨低溫脅迫的加劇呈逐步增加的趨勢(shì)。Ⅳ的CAT含量變化趨勢(shì)相反，隨溫度下降而下降，且隨溫度下降，CAT活性不升反降，可能是枝條隨溫度下降，受凍嚴(yán)重且部分細(xì)胞死亡，酶含量下降活性降低。

在0 ℃時(shí)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的CAT活性都為0，可能是此時(shí)酶活性較低，測(cè)試試劑盒檢測(cè)靈敏度不夠，故未測(cè)得CAT活性。但此時(shí)Ⅳ的CAT含量最高，為52 nmol/(min·g)，表明此溫度下枝條已受到了凍害，CAT酶活性被激發(fā)出來(lái)清除低溫產(chǎn)生的活性氧傷害。溫度下降到-10 ℃時(shí)，Ⅲ的CAT活性高于I和Ⅱ，此時(shí)酶活性為Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ。當(dāng)溫度下降到-20 ℃時(shí)，Ⅲ變化趨緩，而I的CAT活性明顯增加。Ⅱ在0～-30 ℃之間CAT含量上升較平緩，一直處于較低水平。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的CAT活性在-30 ℃達(dá)到峰值，分別為21 nmol/(min·g)、19 nmol/(min·g)和25 nmol/(min·g)，表明此溫度下低溫對(duì)其傷害加重，枝條的CAT活性被完全激發(fā)抵抗凍害，枝條有較好的抗寒性能。

2.3 低溫對(duì)核桃1 a生枝條POD活性的影響

過(guò)氧化物酶(POD)是協(xié)同SOD和CAT，共同清除自由基的酶。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下POD活性變化情況見(jiàn)圖3。

圖3 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下POD活性變化Figure 3 Changes of POD activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由圖3可知，4個(gè)品種(系)1 a生枝條隨溫度下降POD活性變化與SOD和CAT基本一致，也呈現(xiàn)2種不同的趨勢(shì)。I、Ⅱ和Ⅲ的POD活性隨溫度下降呈現(xiàn)升-降-升的趨勢(shì)。而Ⅳ呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，為降-升-降。

在0 ℃時(shí)，I、Ⅱ和Ⅲ的POD活性均為25 U/(g·min)，高于Ⅳ19 U/(g·min)。I、Ⅱ和Ⅲ的 POD活性在-10 ℃時(shí)出現(xiàn)最高值，分別為33 U/(g·min)、32 U/(g·min)和33 U/(g·min)。而Ⅳ的POD活性最高值出現(xiàn)在-20 ℃時(shí)，為34 U/(g·min)，活性最低值為-30℃時(shí)，9 U/(g·min)。

2.4 低溫對(duì)核桃1 a生枝條MDA活性的影響

丙二醛含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度的體現(xiàn)。丙二醛含量高，說(shuō)明植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重。一般植物在逆境條件下，如高溫、鹽堿以及強(qiáng)光等逆境條件下就會(huì)產(chǎn)生膜質(zhì)過(guò)氧化。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下MDA含量變化情況見(jiàn)圖4。

圖4 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下MDA含量變化Figure 4 Changes of MDA content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由圖4可知，4個(gè)核桃品種(系)1 a生枝條的MDA含量變化趨勢(shì)一致，均為隨溫度下降而先升后降，變化趨勢(shì)為緩-急-平。在-10 ℃至-20 ℃時(shí)，MDA含量呈現(xiàn)明顯增加。4個(gè)核桃品種(系)的峰值均為-20 ℃時(shí)，分別為43 nmol/g、44 nmol/g、40 nmol/g和45 nmol/g。在各個(gè)溫度下4個(gè)核桃品種(系)均表現(xiàn)為Ⅳ>Ⅱ> Ⅰ >Ⅲ。

2.5 低溫對(duì)核桃1 a生枝條可溶性糖含量的影響

可溶性糖是維持細(xì)胞穩(wěn)定性的指標(biāo)，可溶性糖含量越高，細(xì)胞越不易失水，抗性越強(qiáng)。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性糖含量變化情況見(jiàn)圖5。

圖5 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性糖含量變化Figure 5 Changes of soluble sugar content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由圖5可知，隨溫度下降，4個(gè)核桃品種(系)1 a生枝條呈現(xiàn)2種不同的變化趨勢(shì)，其中I、Ⅱ和Ⅳ變化趨勢(shì)一致，為降-升-降。而Ⅲ則呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。

不同的低溫處理對(duì)4個(gè)核桃品種(系)1 a生枝條的可溶性糖含量的影響不大，變化范圍在20～42 μg/g之間，多數(shù)集中于25～35 μg/g之間。表明隨著溫度的降低，可溶性糖含量變化在相對(duì)小的范圍內(nèi)變化。在0 ℃時(shí)Ⅱ可溶性糖含量最高，為42 μg/g。I和Ⅲ分別在-20 ℃和-10 ℃含量達(dá)到峰值，分別為35 μg/g和36 μg/g。在各溫度下，Ⅳ含量均顯著低于其余各品種。

2.6 低溫對(duì)核桃1 a生枝條可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)使細(xì)胞維持一定的膨壓，保證植物氣孔運(yùn)動(dòng)和光合作用等生理過(guò)程的正常進(jìn)行。核桃 1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性蛋白含量變化情況見(jiàn)圖6。

圖6 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性蛋白含量變化Figure 6 Changes of soluble protein content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由圖6可知， 4個(gè)核桃品種(系)1 a生枝條變化趨勢(shì)基本一致，在0～-30 ℃之間呈現(xiàn)降-升-降的變化趨勢(shì)，僅Ⅲ在0～-10 ℃之間呈微弱的上升趨勢(shì)。各品種(系)可溶性蛋白含量均在-20℃達(dá)到峰值。

在0 ℃時(shí)，可溶性蛋白含量為Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ，而在其余溫度時(shí)，均為Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ。在低溫脅迫下，Ⅲ的可溶性蛋白含量增幅最大，說(shuō)明其對(duì)低溫應(yīng)激反應(yīng)最強(qiáng)。其次依次為Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ。Ⅳ可溶性蛋白含量隨溫度下降變化幅度最小，僅為14 μg/g，表現(xiàn)為對(duì)溫度脅迫較不敏感。

3 結(jié)論

贊核1號(hào)、贊核2號(hào)、遼寧1號(hào)和清香4個(gè)核桃品種(系)在0 ℃、-10 ℃、-20 ℃和-30 ℃下，保護(hù)酶(POD、CAT、SOD等)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如可溶性糖和可溶性蛋白等)變化不盡相同。呈現(xiàn)出2類(lèi)變化趨勢(shì)：第1類(lèi)為贊核1號(hào)、贊核2號(hào)、遼寧1號(hào)變化趨勢(shì)相同，且與清香變化趨勢(shì)相反。具體表現(xiàn)在負(fù)載清除自由基，保護(hù)細(xì)胞膜完整性的SOD、POD和CAT活性上。其中SOD和POD呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律，均為贊核1號(hào)、贊核2號(hào)和遼寧1號(hào)隨溫度下降表現(xiàn)為升-降-升的變化趨勢(shì)，而清香變化趨勢(shì)與其變化相反。CAT活性隨溫度的變化也呈現(xiàn)2種不同的變化趨勢(shì)，同樣為贊核1號(hào)、贊核2號(hào)和遼寧1號(hào)變化相同，隨溫度下降而酶活性上升，清香的變化趨勢(shì)則相反，隨溫度下降而下降。第2類(lèi)為4個(gè)核桃品種(系)變化趨勢(shì)相同，表現(xiàn)在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量上。其中4個(gè)核桃品種(系)的MDA含量均隨溫度溫度下降而上升，而可溶性蛋白含量呈現(xiàn)隨溫度下降而降-升-降。4個(gè)核桃品種(系)可溶性糖含量呈現(xiàn)大體一致的變化趨勢(shì)，含量隨溫度下降呈現(xiàn)降-升-降，僅在0 ℃到-10 ℃時(shí)，遼寧1號(hào)呈現(xiàn)輕微上升趨勢(shì)。

對(duì)比4個(gè)核桃品種(系)各酶活性和物質(zhì)含量可見(jiàn)，贊核1號(hào)和贊核2號(hào)多介于遼寧1號(hào)和清香之間，且贊核2號(hào)數(shù)值趨近于遼寧1號(hào)，而贊核1號(hào)數(shù)值多趨近于清香，但贊核1號(hào)和贊核2號(hào)數(shù)值差異極小。由此可推斷出，贊核系列抗寒性介于遼寧1號(hào)和清香之間。且贊核系列酶活性和物質(zhì)含量與遼寧1號(hào)變化趨勢(shì)較為相似，而與清香變化差異較大，表現(xiàn)出贊核系列有良好的抗寒性能。