李 潔， 宮路路， 柳陳堅(jiān)， 崔霖蕓， 張 寧

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)教學(xué)部，貴州遵義563000； 2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

β-半乳糖苷酶，又稱乳糖酶，英文名稱βgalactosidase，簡(jiǎn)寫為GAL，國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)將其命名為 EC3.2.1.23［1］，為蛋白家族 GHF-2 類型.該酶能夠水解乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，用來(lái)回收乳清中的乳糖，生產(chǎn)功能性食品添加劑［2］.利用其水解活性水解牛奶中的乳糖，制成低乳糖牛奶，抑或制成腸溶片作為藥物，治療乳糖不耐受癥［3］.利用其水解產(chǎn)物半乳糖作為供體，未分解的乳糖為受體，合成低聚半乳糖 GOS（galacto-oligosaccharide）［4］.由此可見(jiàn)，β -半乳糖苷酶在醫(yī)藥行業(yè)、食品行業(yè)上應(yīng)用廣泛［5］.

自然界中，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的生物種類很多，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物［6］，尤其是微生物，如真菌、酵母菌、細(xì)菌.其中，研究較多的微生物有大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtils）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、乳桿菌（Lactobaills）、乳鏈球菌（Streptococcus lactis）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、乳酸克魯維酵母（Klyeromyces lactis）、乳酸脆壁酵母（Klyveromyces lacis fragilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Asperillus oryzae）等［7］.

鑒于產(chǎn)β-半乳糖苷酶的微生物來(lái)源豐富，本研究以此為啟發(fā)，以云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉為原料，進(jìn)行β-半乳糖苷酶乳酸菌篩選.在宋園亮等［8］的努力下，篩選得到一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶乳酸菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）.結(jié)合分子克隆技術(shù)，將該菌來(lái)源β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶重組大腸桿菌菌株，將其命名為 E.coli BL21／p ET28abgaB-18（以下簡(jiǎn)稱18號(hào)菌株）.結(jié)合鎳柱分離技術(shù)對(duì)重組菌株表達(dá)的β-半乳糖苷酶進(jìn)行分離，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實(shí)驗(yàn)室保存的重組18號(hào)菌株.

1.1.2 試劑 卡納霉素（TaKaRa 公司）IPTG；聚丙烯酰胺，考馬斯亮藍(lán)R-250，溴酚藍(lán)，咪唑，NiSO4·6H2O（上海生工）；鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），ONP（Sigma公司）；碳酸鈉（天津試劑三廠），磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑）.

1.1.3 儀器 恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器有限公司），超聲波細(xì)胞破碎儀（天翎儀器TL-650Y）高速離心機(jī)（SIGMA K 3-18），鎳柱（Qiagen），水平電泳儀（GENIUS），金屬?。‵UNAKOSHI），普通恒溫培養(yǎng)箱（NAPCO6500TC），紫外分光光度計(jì)（Genova）.

1.2 方法

1.2.1 β-半乳糖苷酶重組18號(hào)菌株誘導(dǎo)表達(dá) 吸取18號(hào)重組菌株20μL菌液接種至大腸桿菌培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基5 mL中，加入20μL卡那霉素溶液（質(zhì)量濃度為100μg／mL）后混勻.恒溫?fù)u床（溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速270 r／min）振蕩培養(yǎng)12 h.吸取4 mL 培養(yǎng)液，擴(kuò)大接種至400 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，270 r／min 條件下培養(yǎng)，待菌體OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入400 μL IPTG（200 mg／mL）誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h.培養(yǎng)液于4℃，5 000 r／min離心10 min，棄上清液后加入磷酸鹽緩沖液（pH值為7.5）4 mL，置于冰水內(nèi)超聲破碎，離心20 min（溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速12 000 r／min）.收集上清液，沉淀，用磷酸鹽緩沖液懸浮待用.

1.2.2 β-半乳糖苷酶重組18號(hào)菌株蛋白純化 向經(jīng)10 mmol／L PBS 平衡緩沖液（pH 7.4）處理的鎳柱內(nèi)加入1.2.1中的上清液，用不同濃度咪唑的平衡緩沖液沖洗鎳柱，并收集；選擇合適的收集液待用.

1.2.3 重組β-半乳糖苷酶蛋白SDS-PAGE電泳 分別取未純化的細(xì)胞破碎液的上清液和沉淀，以及經(jīng)鎳柱純化后的蛋白液各5μL，與5μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer混合，100℃煮沸10 min，13 000 r／min 離心 10 min；取離心上清液25μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳.

1.2.4 重組β-半乳糖苷酶酶活測(cè)定 β-半乳糖苷酶酶活單位定義為1 mL菌液產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶在35℃、pH 7.5的條件下，每分鐘水解ONPG產(chǎn)生1μmol鄰硝基苯酚（ONP）所需要的酶量定義為一個(gè)酶活性單位，以U／mL表示.

反應(yīng)體系為250μL重組β-半乳糖苷酶蛋白液，與等量體積ONPG溶液混勻，35℃恒溫孵育30 min，加入250 μL 碳酸鈉溶液終止反應(yīng)［9］.檢測(cè)反應(yīng)體系在OD420處的吸光度.每個(gè)反應(yīng)體系平行測(cè)量3次（下同），并計(jì)算酶活.

1.2.5 重組β-半乳糖苷酶最適溫度和最適pH測(cè)定 將反應(yīng)體系（詳見(jiàn)1.2.4，下同）分別在不同溫度（-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃）的水浴條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，結(jié)束后按照1.2.4進(jìn)行檢測(cè).

在最佳反應(yīng)溫度下，將反應(yīng)體系置于不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）［10］的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)，結(jié)束后按照1.2.4進(jìn)行檢測(cè).

現(xiàn)在當(dāng)?shù)剜l(xiāng)鎮(zhèn)派出所警力嚴(yán)重不足。由于基層警務(wù)需要承擔(dān)大量的人口管理事務(wù)，兩勞釋放人員、精神病人、重點(diǎn)信訪人員都屬于基層警務(wù)的職責(zé)內(nèi)容。警察執(zhí)法在村莊社會(huì)中的重點(diǎn)是鄉(xiāng)村治安，解決糾紛只是派出所功能的一部分[37]。在“羊吃花生”案中，“青楞”故意制造糾紛以報(bào)復(fù)自己用水不得?！扒嗬恪鼻址傅膶?duì)象是村里的門頭大戶，“青楞”知道現(xiàn)在不能用拳頭解決問(wèn)題，于是才敢公然挑戰(zhàn)權(quán)威勢(shì)力。按理，“青楞”的行為應(yīng)該受到制裁，但村干部的調(diào)解無(wú)法解決問(wèn)題，而派出所嚴(yán)格依法辦事，也不再理會(huì)警務(wù)職責(zé)之外的鄉(xiāng)土利益訴求。

1.2.6 重組β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測(cè)定 將重組β-半乳糖苷酶置于不同溫度［11］（30、40、50、60、70、80 ℃）進(jìn)行熱處理 2 h，結(jié)束后按照1.2.4 進(jìn)行檢測(cè).

將重組β-半乳糖苷酶置于pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 的緩沖液中處理 1 h［12］，結(jié)束后按照 1.2.4 進(jìn)行檢測(cè).

1.2.7 金屬離子對(duì)重組β-半乳糖苷酶活性影響的測(cè)定 吸取重組β-半乳糖苷酶純化液25μL，依次加入225μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的CaCl2·2H2O、CuSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、Mg-SO4·7H2O、KCl、MnSO4、BaCl2和 ZnSO4等不同金屬離子溶液，加入250μL ONPG溶液誘導(dǎo)培養(yǎng)，以未處理酶液作為對(duì)照，依據(jù)1.2.5的測(cè)定結(jié)果，選定最適溫度、最適pH進(jìn)行酶促反應(yīng)，結(jié)束后按照1.2.4 進(jìn)行檢測(cè).

1.2.8 初步純化的重組 β-半乳糖苷酶 Km與Vmax測(cè)定 在35℃，pH 7.5條件下，測(cè)定不同濃度ONPG的酶促反應(yīng)速率，根據(jù)米氏方程計(jì)算出β-半乳糖苷酶的Km和Vmax大小.

按照雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）將米氏方程改寫為

根據(jù)酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同［S］對(duì)應(yīng)V，求出二者倒數(shù)，以1／V對(duì)1／［S］作圖繪制直線.橫軸截距為 x＝-1／Km，得 Km＝-1／x；縱軸截距為 y＝1／Vmax，得Vmax＝1／y，并計(jì)算出β-半乳糖苷酶Km和Vmax大小.

2 結(jié)果與討論

2.1 重組β-半乳糖苷酶酶活測(cè)定在測(cè)定1.2.2中分離得到的重組β-半乳糖苷酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)按照1.2.4方法進(jìn)行酶促反應(yīng)時(shí)，吸取鎳柱分離得到的重組β-半乳糖苷酶蛋白液250μL加入到含等量體積ONPG溶液的反應(yīng)容器中，溶液立即變成黃色（黃色為反應(yīng)產(chǎn)物ONP的顏色，反應(yīng)前無(wú)色）.由于酶促反應(yīng)時(shí)間很短，難以計(jì)算反應(yīng)時(shí)間.其原因是酶濃度過(guò)高，反應(yīng)進(jìn)程過(guò)快，影響酶促反應(yīng)速率測(cè)定，需探索重組蛋白的反應(yīng)濃度.按照稀釋倍數(shù) 45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 進(jìn)行稀釋，其結(jié)果如圖1所示，在低于45倍濃度進(jìn)行稀釋時(shí)，稀釋后的酶液與底物反應(yīng)很快，很難把握酶促反應(yīng)時(shí)間；繼續(xù)加大稀釋倍數(shù)，酶促反應(yīng)速率逐步平緩下降.本實(shí)驗(yàn)選擇稀釋100倍（稀釋便捷，反應(yīng)時(shí)間可控，可檢測(cè)性強(qiáng)）酶液參與酶促反應(yīng)測(cè)定.

圖1 酶促反應(yīng)稀釋倍數(shù)測(cè)定Fig.1 Determination of dilution multiple of enzymatic reaction

將酶液稀釋100倍后，測(cè)定酶活，再換算成每1 mL重組大腸桿菌菌液酶活，得到重組β-半乳糖苷酶酶活為16.5 U／mL，即每1 mL重組大腸桿菌菌液的酶活為16.5 U.

2.2 重組β-半乳糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜將1.2.2中純化酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其結(jié)果如圖2所示.在泳道1中，66.2和35 kDa處有清晰蛋白條帶，推測(cè)為重組β-半乳糖苷酶的2個(gè)亞基，電泳圖譜中亦有雜蛋白條帶.因此，該方法只能對(duì)重組蛋白進(jìn)行初步分離純化.

圖2 重組菌株18號(hào)菌株SDS-PAGEFig.2 The SDS-PAGE figure of recombinant strain No.18

圖3中，泳道1為重組菌株細(xì)胞裂解液上清液，在上清液中很難判斷重組蛋白條帶；泳道2為細(xì)胞裂解液沉淀，在細(xì)胞裂解液沉淀中可發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達(dá)（圖3中大、小亞基所示）.由此可見(jiàn)，重組蛋白主要出現(xiàn)在細(xì)胞裂解液沉淀中，結(jié)合圖2，則說(shuō)明上清液中有重組蛋白，但與沉淀中蛋白量相比較少，蛋白主要在沉淀中，因此，該蛋白主要以包涵體形式存在于細(xì)胞中.

圖3 18號(hào)菌株由來(lái)胞內(nèi)蛋白電泳結(jié)果Fig.3 Results of intracellular protein electrophoresis of strain No.18

2.3 重組β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度和最適pH將β-半乳糖苷酶與ONPG混勻后置于不同溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，待結(jié)束后測(cè)定其OD420的吸光度，繪制相對(duì)酶活曲線如圖4（為便于數(shù)據(jù)處理，以下作圖均按照相對(duì)酶活繪制）.可以看出，溫度在0～35℃變化時(shí)，隨著溫度升高，相對(duì)酶促反應(yīng)速率逐漸加快，35℃時(shí)達(dá)到最大.因此，得到其最適溫度為35℃.隨著反應(yīng)體系溫度升高，相對(duì)酶促反應(yīng)速率逐漸下降：在35～50℃時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率下降緩慢；在50～85℃時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率下降明顯；大于85℃時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率接近于0，推測(cè)酶在此時(shí)處于失活狀態(tài).

圖4 Lb.brevis GJ1-3來(lái)源β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度Fig.4 The optimum temperature ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

將β-半乳糖苷酶與底物混勻后置于不同pH緩沖溶液中進(jìn)行酶促反應(yīng)，待結(jié)束后測(cè)定其OD420的吸光度，并探討pH對(duì)該酶活性影響.根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，繪制相對(duì)酶活曲線如圖5（以最大反應(yīng)速率做參考）.可以看出，pH值為0～5.0時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)接近于0；pH值為5.0～6.5時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率迅速上升；pH值為6.5～8.0時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率比較穩(wěn)定；pH值為7.5時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大，得到該酶最適pH值為7.5.當(dāng)溶液pH值大于8.0時(shí)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率急劇下降；pH值為8.5～10.5的范圍內(nèi)，相對(duì)酶促反應(yīng)速率接近于0，推測(cè)酶在此時(shí)處于失活狀態(tài).

圖5 Lb.brevis GJ1-3來(lái)源β-半乳糖苷酶最適pHFig.5 The optimum p H ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

2.4 重組β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性將β-半乳糖苷酶與底物混勻后，置于不同溫度條件下孵育2 h，在最佳反應(yīng)條件下（35℃，pH 7.5）進(jìn)行酶促反應(yīng)，并測(cè)定其OD420的吸光度，繪制相對(duì)酶活曲線如圖6.可以看出：在溫度30～50℃范圍內(nèi)，酶穩(wěn)定性較好；當(dāng)溫度升高到60℃以上時(shí)，相對(duì)酶活性急劇下降.推測(cè)酶在較高溫度下空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響了酶促反應(yīng).因此，該酶在30～50℃范圍內(nèi)能夠保持很好的熱穩(wěn)定性，較高溫度條件下極易失活，屬于常溫酶.

圖6 Lb.brevis GJ1-3來(lái)源β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性Fig.6 The thermal stability ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

將該酶置于不同pH緩沖液中孵育1 h，隨后將其置于最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)，并測(cè)定其OD420的吸光度，繪制相對(duì)酶活曲線，探討不同pH條件下酶促反應(yīng)速率，如圖7所示.結(jié)果表明：酶在pH值小于4.0的范圍內(nèi)，相對(duì)酶活接近于0，說(shuō)明其穩(wěn)定性很差；pH值為4.0～8.0時(shí)，酶穩(wěn)定性逐漸增加；當(dāng)酶處在pH值為8.0以上溶液中，其穩(wěn)定性很快下降；pH值大于11時(shí)，相對(duì)酶活趨近于0，推測(cè)其結(jié)構(gòu)遭到破壞而失活.由此可見(jiàn)，該酶在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)具有較好的pH穩(wěn)定性.

圖7 Lb.brevis GJ1-3來(lái)源β-半乳糖苷酶pH穩(wěn)定性Fig.7 The p H stability ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

2.5 金屬離子對(duì)重組β-半乳糖苷酶活性影響將該酶與不同金屬離子醋酸鹽緩沖液（pH 7.5）混勻，測(cè)定不同金屬離子對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 金屬離子對(duì)Lb.brevis GJ1-3來(lái)源β-半乳糖苷酶活性的影響Tab.1 Effects onβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3 by different irons

可以看出，在加入金屬離子 Mg2＋、Mn2＋的反應(yīng)體系中，與未添加金屬離子對(duì)照組相比，重組β-半乳糖苷酶具有很好的催化活性，推測(cè) Mg2＋、Mn2＋能夠促進(jìn)酶促反應(yīng)；在加入金屬離子Cu2＋、Ba2＋與K＋的反應(yīng)體系中，重組β-半乳糖苷酶與未添加金屬離子對(duì)照組相比，酶促反應(yīng)速率都有所下降；Cu2＋存在時(shí)酶活性下降至三分之一，明顯抑制了酶促反應(yīng)；Ba2＋與K＋存在時(shí)，酶促反應(yīng)速率也有一定下降.由此可見(jiàn)，Mg2＋、Mn2＋能夠很好促進(jìn)酶促反應(yīng)，是該酶的激活劑；Cu2＋、Ba2＋與 K＋影響了酶促反應(yīng)，具有一定抑制作用，為該酶反應(yīng)抑制劑；其他金屬離子對(duì)酶促反應(yīng)影響不大.

2.6 重組β-半乳糖苷酶 K m與 V max將重組β-半乳糖苷酶與一系列不同濃度ONPG溶液（2、4、8、10、16、20 mmol／L）均勻混合，在最適條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，分別測(cè)定不同ONPG濃度下的酶活性，并繪制出1／V 對(duì) 1／［S］直線，如圖8.通過(guò)計(jì)算得到Km＝0.816 mmol／L，Vmax＝45.87 mmol／（L·min）.

圖8 Lb.brevis GJ1-3來(lái)源β-半乳糖苷酶的動(dòng)力學(xué)結(jié)果Fig.8 The kineties ofβ-galactosidase from Lb.brevis GJ1-3

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究將β-半乳糖苷酶重組18號(hào)菌株在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá).表達(dá)蛋白經(jīng)處理后分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖2和圖3.在圖2中，第1泳道內(nèi)有2個(gè)蛋白條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量在 66.2 和35 kDa 附近.結(jié)合 Pridmore［6］等報(bào)道的短乳桿菌全基因組序列，以及其編碼的β-半乳糖苷酶基因序列，利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該酶有2個(gè)大小亞基構(gòu)成：編碼大亞基的核苷酸序列大小為1 887 bp，其編碼的蛋白質(zhì)亞基大小為71.6 kDa；編碼小亞基的核苷酸序列大小為966 bp，其編碼的蛋白質(zhì)亞基大小為34.5 kDa.圖2中蛋白條帶大致在這個(gè)數(shù)值附近，然其位置不是很理想，需進(jìn)一步探討.除此之外，亦有雜蛋白出現(xiàn)，說(shuō)明鎳柱親和分離效果不理想.在圖3中，有2個(gè)表達(dá)量很大的蛋白，上清液中目的條帶不明顯.利用上清以及上清蛋白純化液進(jìn)行酶促反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入酶液，反應(yīng)變色，且反應(yīng)瞬間結(jié)束，說(shuō)明酶濃度高，底物相對(duì)較少，說(shuō)明反應(yīng)體系中有重組酶存在，且濃度很高，因此，需稀釋酶液.由此可見(jiàn)，18號(hào)菌株表達(dá)的重組β-半乳糖苷酶主要以包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，僅有部分酶蛋白存在于細(xì)胞裂解上清液中，需進(jìn)一步優(yōu)化重組菌株培養(yǎng)條件，改善其酶分泌情況.

重組β-半乳糖苷酶最適溫度為37℃，屬于常溫酶，在30～50℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性良好，50℃時(shí)能夠保留90%的相對(duì)酶活；60℃時(shí)相對(duì)酶活降低到10%以下.潘渠等［14］研究嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶異源性表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶在60℃時(shí)仍能保持一半活性.說(shuō)明溫度對(duì)該酶活性影響較大，較高溫度便會(huì)引起酶變性失活.重組酶最適pH值為7.5，在 pH 6.0～8.0范圍內(nèi)，穩(wěn)定性較好；pH 6.0時(shí)，相對(duì)酶活降到10%以下；當(dāng)pH值增加到10.0時(shí)，酶仍保留50%相對(duì)酶活.說(shuō)明該酶對(duì)酸比較敏感，對(duì)堿適應(yīng)能力較強(qiáng).與聶春明［10］研究相比，酶的 pH適應(yīng)范圍較廣.Mg2＋、Mn2＋對(duì)該酶活性有一定促進(jìn)作用，其中Mg2＋促進(jìn)作用較好，為酶的激活劑，Cu2＋為其抑制劑.Chanalia 等［13］在研究乳酸片球菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ca2＋、Mg2＋和 Mn2＋對(duì)該酶具有活化作用.Wutor等［15］研究發(fā)現(xiàn) Cu2＋也是該酶的抑制劑.聶春明［10］研究金屬離子對(duì)乳酸桿菌來(lái)源重組β-半乳糖苷酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，Mg2＋具有很好促進(jìn)作用，高濃度金屬離子會(huì)抑制β-半乳糖苷酶活性.宋園亮等［8］研究短乳桿菌β-半乳糖苷酶性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Mg2＋、K＋能夠促進(jìn)酶活性，Ba2＋和 Cu2＋抑制酶活性.說(shuō)明Mg2＋為其激活劑，Cu2＋為抑制劑.潘渠等［14］將嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，測(cè)得重組菌株β-半乳糖苷酶的 Km＝2.18 mmol／L，Vmax＝273 mmol／（L·min）.在本研究中，經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得該重組β-半乳糖苷酶特征性常數(shù)Km＝0.816 mmol／L，最大反應(yīng)速率 Vmax＝45.87 mmol／（L·min）.從 Km大小對(duì)比發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌來(lái)源重組β-半乳糖苷酶與底物ONPG具有很好的親和力，然而最大反應(yīng)速率不是很高.酶經(jīng)鎳柱純化后，酶蛋白基本達(dá)到電泳純，但雜蛋白仍然存在.接下來(lái)將通過(guò)不同分離純化技術(shù)，對(duì)酶液進(jìn)行進(jìn)一步分離提純，獲得更多關(guān)于短乳桿菌來(lái)源β-半乳糖苷酶的性質(zhì)，為其工業(yè)化應(yīng)用以及科學(xué)研究提供更為詳盡的理論參考.