李成行 李月翠 張莉莉

結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)于結(jié)核防控至關(guān)重要，然而部分患者臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)不典型，診斷困難[1-2]。涂片及培養(yǎng)是肺結(jié)核傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法，但陽(yáng)性率均偏低，培養(yǎng)還存在時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的缺點(diǎn)[3]。結(jié)核RNA 檢測(cè)的技術(shù)原理是以16S rRNA 為靶標(biāo)，通過(guò)恒溫RNA 擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT），快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有結(jié)核分枝桿菌的存在。結(jié)核RNA檢測(cè)不僅擴(kuò)增效率更高（30min 內(nèi)擴(kuò)增10 億倍）、反應(yīng)更穩(wěn)定，還能夠區(qū)分死菌活菌。且由于RNA 在環(huán)境中更容易降解，因此實(shí)驗(yàn)室污染更少[4-5]。本研究擬采用結(jié)核RNA 檢測(cè)技術(shù)（TB SAT），對(duì)疑似結(jié)核病患者的痰液或支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析比較，評(píng)估其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年1 月—2017 年6 月浙江省永康市第一人民醫(yī)院收治的272 例肺部影像學(xué)異常的疑似結(jié)核患者，男151 例，女121 例。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，符合《赫爾辛基宣言》倫理原則，所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]（1）肺結(jié)核確診標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)具有疑似肺結(jié)核表現(xiàn)、涂片陽(yáng)性，或分枝桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性，或肺組織病理學(xué)檢查陽(yáng)性的患者。（2）臨床診斷肺結(jié)核的判斷標(biāo)準(zhǔn)：胸部影像學(xué)顯示與活動(dòng)性肺結(jié)核相符的病變，具有咳嗽、咯痰、咯血等癥狀，免疫學(xué)檢查陽(yáng)性，經(jīng)過(guò)診斷性抗結(jié)核治療隨訪病灶好轉(zhuǎn)或經(jīng)鑒別診斷排除其他肺部疾病者。（3）非肺結(jié)核患者的判斷標(biāo)準(zhǔn)：指診斷為肺結(jié)核以外的其他肺部疾病，且經(jīng)過(guò)非結(jié)核病治療好轉(zhuǎn)者。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者存在明顯的咳嗽、咳痰等臨床變現(xiàn)；（2）符合活動(dòng)性肺結(jié)核病變的胸部X 片表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有結(jié)核病的患者，不能耐受氣管鏡檢查者。

1.4 儀器與試劑 TB SAT 采用的Mag-X 全自動(dòng)核酸提取儀由中國(guó)嘉興凱實(shí)生物科技有限公司提供、所用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀由美國(guó)ABI 公司提供、所用300W 水浴超聲儀和RNA 恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒由中國(guó)上海仁度生物科技有限公司提供（批號(hào)20160201、20160501）；抗酸桿菌涂片染色液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供（批號(hào)C150901）；全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)BACTEC MGIT 960 及其配套試劑均由美國(guó)BD 公司提供（批號(hào)20160301）。

1.5 方 法 留取所有研究對(duì)象1 份晨痰或肺泡灌洗液（BALF）樣本。BALF 視清濁度不同，對(duì)于帶有黏液的BALF 標(biāo)本可適量加入一些4%NaOH 溶液進(jìn)行液化，最多不超過(guò)樣本量的1 倍體積。

涂片檢查：遵照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[7]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。培養(yǎng)檢查：吸取2mL 待檢標(biāo)本至50mL 離心管中，嚴(yán)格按照BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)操作說(shuō)明書進(jìn)行操作，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為42 天。儀器報(bào)告陽(yáng)性后，取培養(yǎng)液進(jìn)行涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽(yáng)性；若未見(jiàn)抗酸桿菌則為陰性。

TB SAT 檢測(cè)：將待檢標(biāo)本用13000r/min 離心5min，棄上清液，加入50μL 裂解緩沖液，重懸后放入超聲清洗器中超聲處理15min，超聲功率為300W。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照與待檢標(biāo)本同步進(jìn)行。超聲結(jié)束后，取2μL 處理物加入預(yù)先混合好的30μL 擴(kuò)增檢測(cè)液中。再將反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60℃保溫1min后，再置于42℃保溫5min，同時(shí)將酶液預(yù)熱至42℃。預(yù)熱后，向每支反應(yīng)管中加入10μL 酶液，混勻后將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中啟動(dòng)反應(yīng)程序。反應(yīng)程序?yàn)闊晒馔ǖ涝O(shè)定為FAM，每個(gè)循環(huán)為42℃、1min，共40 個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，正態(tài)性檢測(cè)采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)；正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用t 檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用Wilcoxon 檢驗(yàn)；率的比較采用卡方檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 272 例患者中，培養(yǎng)陽(yáng)性肺結(jié)核患者85 例，培養(yǎng)陰性經(jīng)過(guò)臨床診斷肺結(jié)核患者95例，年齡（36.17±13.15）歲；非結(jié)核患者92 例，年齡（43.25±15.33）歲，其中肺炎68 例（73.91%）、支氣管擴(kuò)張7 例（7.61%）、肺癌7 例（7.61%）、真菌感染7 例（7.61%）、非結(jié)核分枝桿菌肺病3 例（3.26%）。

2.2 涂片、培養(yǎng)及TB SAT 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的效能評(píng)價(jià) 以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)[6]，確認(rèn)活動(dòng)性肺結(jié)核病180 例，非結(jié)核病患者92 例。涂片、培養(yǎng)、TB SAT 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度分別為26.11%、47.22%及59.44%。TB SAT 的檢測(cè)靈敏度明顯高于涂片（χ2=40.852，P＜0.01）和培養(yǎng)（χ2=5.402，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 TB SAT 檢測(cè)診斷涂陰肺結(jié)核的效能 以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)[6]，133 例涂陰肺結(jié)核患者：培陽(yáng)41 例，培陰92 例；TB SAT 陽(yáng)性60 例（涂陰培陽(yáng)肺結(jié)核患者陽(yáng)性37 例，涂陰培陰肺結(jié)核患者陽(yáng)性23例），TB SAT 陰性73 例；92 例非結(jié)核患者：TB SAT陽(yáng)性1 例，陰性91 例。TB SAT 診斷涂陰肺結(jié)核的靈敏度為45.11%（60/133），特異度為98.91%（91/92），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.36%（60/61），陰性預(yù)測(cè)值為55.49%（91/164）。見(jiàn)表2。

2.4 療效評(píng)估 TB SAT 檢測(cè)陽(yáng)性患者治療3、6 個(gè)月后，TB SAT 陽(yáng)性率分別為66.67%（30/45）及21.74%（5/23），陽(yáng)性率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。

3 討論

對(duì)早期結(jié)核患者進(jìn)行快速準(zhǔn)確診斷是目前結(jié)核防控的難點(diǎn)，目前已有的常規(guī)檢測(cè)很難滿足臨床的需求[8-9]。本研究采用的結(jié)核RNA 檢測(cè)（TB SAT）技術(shù)原理是以16S rRNA 為靶標(biāo)，通過(guò)恒溫RNA 擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT），快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有結(jié)核分枝桿菌的存在[10]，還能夠區(qū)分死菌活菌，因此這種方法可有效輔助診斷肺結(jié)核病、以及評(píng)估抗結(jié)核治療療效[11]。

本研究采用疑似肺結(jié)核患者的BALF 標(biāo)本，比較涂片鏡檢、培養(yǎng)、TB SAT 方法的診斷性能。本研究發(fā)現(xiàn)，TB SAT 的靈敏度明顯優(yōu)于培養(yǎng)以及涂片法，而特異度與培養(yǎng)以及涂片法相當(dāng)；提示TB SAT 檢測(cè)具有高靈敏度高特異度的優(yōu)勢(shì)，能更好的幫助臨床醫(yī)生進(jìn)行早期診斷和治療。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，TB SAT檢測(cè)在涂陽(yáng)培陽(yáng)患者中的靈敏度及特異度高達(dá)100%、在涂陰培陽(yáng)患者中的靈敏度高達(dá)90.24%、在涂陰培陰患者的靈敏度為25.00%。這表明TB SAT檢測(cè)在涂片陽(yáng)性患者或培養(yǎng)陽(yáng)性患者中，均表現(xiàn)出了優(yōu)異的檢測(cè)性能；由于TB SAT 還可進(jìn)一步提升在涂陰培陰患者中的檢出率，提示其臨床應(yīng)用價(jià)值與培養(yǎng)相當(dāng)甚至可能略高，可更好的輔助臨床醫(yī)生對(duì)涂陰或菌陰患者進(jìn)行早期診斷和治療[3，12-13]。

表1 涂片、培養(yǎng)及TB SAT 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的效能

表2 TB SAT 在涂陰肺結(jié)核中的診斷價(jià)值[%（例）]

總的來(lái)說(shuō)，TB SAT 具備快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異度高的特點(diǎn)，診斷性能與液體培養(yǎng)相當(dāng)甚至可能略高，還可輔助療效評(píng)估，在結(jié)核病診療上具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。