孟偉峰 朱 衍 童偉隆 趙桂琴

相關(guān)研究報道，慢性阻塞性肺疾病的主要病理改變是氣道炎癥，且炎性反應(yīng)與肺功能具有相關(guān)性[1-2]。但炎性因子的異常變化在其他疾病中亦會發(fā)生，故不能作為評價肺功能損傷程度的最佳指標(biāo)。臨床研究提示，呼吸道病毒感染是慢性阻塞性肺疾病急性加重的主要原因，在該病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。病毒感染可誘導(dǎo)機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，而臨床關(guān)于呼吸道病毒感染與炎癥因子在慢性阻塞性肺疾病中的相關(guān)報道甚少，且缺乏關(guān)于呼吸道病毒感染與肺功能的研究?；诖?，本研究將探討呼吸道病毒、炎癥細(xì)胞因子、肺功能在慢性阻塞性肺疾病急性加重期的診斷價值及其相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以2017 年11 月—2019 年11 月于浙江省紹興市第七人民醫(yī)院收治入院的慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者102 例為研究對象。其中男78 例，女24 例，年齡46～69（56.83±8.21）歲。本研究方案的制定符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》的相關(guān)要求，且已通過我院倫理委員會審核。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合2013年《慢性阻塞性肺病診治指南（修訂版）》[5]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；（2）無哮喘病史、過敏性鼻炎及支氣管擴張者；（3）所有患者及其家屬均自愿參與研究并簽署知情同意書；（4）近8 周內(nèi)無服抗病毒藥物者；（5）近8 周內(nèi)無COPD 急性發(fā)作及病毒感染病史；（6）臨床資料完整者；（7）精神正常且依從性較好者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肝腎功能障礙；（2）合并肺栓塞、活動性肺結(jié)核等其他疾?。唬?）合并其他惡性腫瘤者；（4）不能配合完成研究；（5）長期使用全身性糖皮質(zhì)激素。

1.3 方 法 （1）標(biāo)本采集：痰液標(biāo)本在患者入院24h 內(nèi)留取。采樣前囑咐患者保持平靜，無痰的患者給予霧化吸入3%氯化鈉溶液10min 后留痰；有痰的患者給予生理鹽水漱口，將深咳吐出的痰存放在無菌痰杯中。采用生理鹽水將痰液洗滌后通過低倍鏡篩查，鱗狀上皮細(xì)胞＜10 個/視野，白細(xì)胞＞25 個/視野，或同個視野下鱗狀上皮細(xì)胞/白細(xì)胞＜2.5，為合格，不合格者需再次留取。將痰液標(biāo)本放置于4℃冰箱，在48h 內(nèi)進行檢測。（2）肺功能檢測：患者入院24h 后，均采用肺功能檢測儀（日本，福田，ST320）對患者1s 用力呼氣容積（FEV1）與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）、FEV1 占預(yù)計值百分比（FEV1%）進行測定。（3）提取病毒核酸：采用體液病毒DNA/RNA 小量試劑盒（美國AXYGEN 公司，批號AP-MN-BFVNA-50）進行檢驗。（4）病毒檢測：采用呼吸道病原體多重?zé)晒釶CR 檢測試劑盒（美國Roche 公司，批號53-0101-96），采用熒光PCR 擴增儀（美國，羅氏公司，LightCycler 480Ⅱ型），對11 種病毒進行檢測包括流感病毒（InfA、InfB 型）、冠狀病毒（OC43、HKU1、229E 型）、人博卡病毒（HBoV）、腸道病毒（HEV）、人鼻病毒（HRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人偏肺病毒（HMPV）及腺病毒（ADV）等。熒光PCR擴增儀檢測病毒陽性后，再選用相應(yīng)病毒引物僅行PCR 擴增。本研究中所述呼吸道病毒序列、靶點及片段長度（見表1）。RT-PCR 擴增：按DNase/RNase Free H2O 8μL+5x RT Buffer 4μL+RT primer mix 2μL+Reverse transcriptase1μL+Sample 5μL 的比例共20μL，在PCR 管內(nèi)加入試劑和樣品以進行目的片段反轉(zhuǎn)錄，混勻后按48℃1min、42℃60min、95℃5min 溫度孵育，4℃保存；按10×PCR Buffer 2μL+25mmol/L MgCl24μL+PCR primer mix 2μL+Solution X 2μL+TaqDNA Polymerase 0.7μL+RT 產(chǎn)物9.3μL 的比例共20μL，在另一PCR 管內(nèi)加入試劑和樣品以進行目的片段的PCR，混勻后按94℃1min、94℃ 30min、60℃ 30min、70℃ 1min 進行熱循環(huán)反應(yīng)，重復(fù)35 次，70℃1min，4℃保存。根據(jù)病毒檢驗結(jié)果陽性或陰性將其分為陽性組與陰性組。（5）炎癥細(xì)胞因子測定：抽取所有患者清晨空腹時靜脈血3～5mL，以2500r/min 離心15min，收集上清置于-30℃冰箱保存，用于檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、調(diào)節(jié)活化正常T 細(xì)胞表達和趨化因子（RANTES）、干擾素誘導(dǎo)蛋白（IP-10）、干擾素-γ（INF-γ）、可溶性白細(xì)胞介素-2 受體（sIL-2R）、IL-8、IL-6 水平。均采用定量酶聯(lián)檢測法進行檢測（海森雄科技實業(yè)有限公司），需嚴(yán)格按照說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件分析所有數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，偏態(tài)分布定量資料采用M（P25，P75）進行描述，兩組間樣本均數(shù)比較采用t 檢驗表示；多組樣本均數(shù)間比較采用方差分析，組間兩兩比較用LSD 法表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗表示；采用Spearman 相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測結(jié)果 102 例患者共39 例經(jīng)病毒檢測為陽性，陽性率為38.24%（39/102）。其中最為常見的病毒為A 型流感病毒共15 例，陽性率為38.46%（15/39），以9 月—次年1 月為高發(fā)期；其次為鼻病毒共11 例，陽性率為28.21%（11/39），以7—11 月為高發(fā)；再次為人偏肺病毒5 例，陽性率為12.82%（5/39），以12 月—次年1 月為高發(fā)；副流感病毒3 型2例，陽性率為5.13%（2/39），在5 月與10 月發(fā)現(xiàn)；呼吸道合胞病毒2 例，在11 月與12 月發(fā)現(xiàn)；冠狀病毒OC43 型1 例，在4 月發(fā)現(xiàn)；腸道病毒1 例，在11 月發(fā)現(xiàn)；腺病毒1 例，在3 月發(fā)現(xiàn)。其中發(fā)生同時感染鼻病毒伴博卡病毒和鼻病毒伴流感病毒A 型患者2例，分別發(fā)生在4 月與3 月。

2.2 一般情況比較 兩組患者年齡、性別、吸煙、體質(zhì)指數(shù)、使用ICS、高血壓、冠心病、心律失常、mMRC評分、WBC、NEUT、EOSC、ALT、SCr、CD4+比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組住院時間、糖尿病、肺功能指標(biāo)（FEV1/FVC、FEV1%）、發(fā)熱、CAT 評分及CD8+比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 呼吸道病毒序列、靶點及片段長度[6-7]

2.3 炎性細(xì)胞因子比較 病毒陽性組患者血清IL-6、IL-8、IP-10、RANTES、sIL-2R、INF-γ、TNF-α 及CRP 水平均高于病毒陰性組，但兩組INF-γ 相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。見表3。

2.4 相關(guān)性分析 FEV1%、FEV1/FVC、糖尿病、發(fā)熱、CAT 評分、CD4+、IP-10、sIL-2R、TNF-α 水平與病毒陽性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.452、-0.552、-12.987、-0.672、-0.563、-0.872、-0.982、-0.972、-7.372，P 均＜0.001）。

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是呼吸科常見的一種慢性炎癥性疾病，受呼吸道感染的影響會加重病情，常見的病原體為病毒[8]。由于呼吸道病毒的分布與季節(jié)性呈正相關(guān)，本研究為減少季節(jié)性分布造成的偏倚，設(shè)置研究時間為2 年。本研究結(jié)果顯示，慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者病毒檢測陽性率為38.24%，其中最為常見的是流感病毒A 型，其次為鼻病毒。本研究結(jié)果與杜小兵等[9]及趙春柳等[10]研究相似。穩(wěn)定期的慢性阻塞性肺疾病患者可檢出病毒；而急性加重期患者痰液經(jīng)檢測可觀察到病毒核酸，且伴嚴(yán)重的氣促、咳嗽、咳痰及發(fā)熱等癥狀。本研究結(jié)果顯示，病毒陰性組的住院時間、糖尿病、肺功能指標(biāo)（FEV1/FVC、FEV1%）、發(fā)熱、CAT 評分及CD8+均優(yōu)于病毒陽性組（P＜0.05），提示糖尿病、發(fā)熱、穩(wěn)定期CAT 評分可增加病毒感染風(fēng)險，而肺功能指標(biāo)（FEV1/FVC、FEV1%）降低、CD8+細(xì)胞比例下降，延長住院時間，則易導(dǎo)致穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者感染病毒，加重病情，不利于康復(fù)。

表2 兩組慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者一般資料比較

表3 兩組慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清炎性細(xì)胞因子比較（）

表3 兩組慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清炎性細(xì)胞因子比較（）

注：IL-6 為白介素-6；IL-8 為白介素-8；IP-10 為干擾素誘導(dǎo)蛋白；RANTES 為趨化因子；sIL-2R 為可溶性白細(xì)胞介素-2 受體；INF-γ 為干擾素-γ；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；CRP 為C 反應(yīng)蛋白

Kido 等[11]通過研究證實，慢性阻塞性肺疾病患者肺部產(chǎn)生的炎癥可轉(zhuǎn)移至血液且可隨血液在體內(nèi)循環(huán)，形成系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)中的重要組成部分為細(xì)胞因子，各個細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮不同的作用，在慢性阻塞性肺疾病急性加重期以急性呼吸道病毒感染為主。在炎癥因子中IL-6 屬于白細(xì)胞介素的一種，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能[12]；IL-8 是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，參與和調(diào)節(jié)機體內(nèi)生殖生理和病理過程[13]；IP-10 是CXC 趨化因子家族的一員，可與相應(yīng)的CXCR3 受體相互作用，參與抗病毒、活化吞噬細(xì)胞等作用[14]。sIL-2R 是一種復(fù)合性粘蛋白，可仰制已活化的T 細(xì)胞的克隆化擴增[15]。TNF-α 由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物活性，可促使炎癥細(xì)胞黏附，從而導(dǎo)致大量的活性氧自由基產(chǎn)生，對機體造成氧化損傷，并可釋放IL-6 及IL-8 等炎性因子，增加機體的炎癥反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，病毒陽性組的IL-6、IL-8、IP-10、RANTES、sIL-2R、TNFα 及CRP 均高于病毒陰性組，提示慢性阻塞性肺疾病急性加重期在呼吸道病毒感染后系統(tǒng)性炎癥水平明顯升高。

Sithisarn 等[17]研究提示，IP-10 水平與所感染病毒量具有一定的相關(guān)性；Ng 等[18]研究則證實，IP-10水平越高則患者病毒感染后的病情越嚴(yán)重。由于病毒感染初期的臨床癥狀并不明顯，患者就診不及時，且病毒陽性組血清IP-10 水平明顯高于病毒陰性組，故病毒陽性導(dǎo)致的病情更嚴(yán)重。由于本研究未對病毒定量檢測，故無法深入分析病毒載量高低的問題。另一方面本研究中sIL-2R 升高，這可能是由于病毒感染后導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的活化造成的。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC、糖尿病、發(fā)熱、CAT 評分、血清CD4+、IP-10、sIL-2R、TNF-α 水平與病毒陽性呈負(fù)相關(guān)，提示呼吸道病毒及炎癥細(xì)胞因子會導(dǎo)致肺功能下降，從而影響慢性阻塞性肺疾病急性加重期的病情，且三者之間具有一定的相關(guān)性。

總而言之，呼吸道病毒、炎癥細(xì)胞因子、肺功能在慢性阻塞性肺疾病急性加重期均具有一定的診斷價值，且三者之間具有一定的相關(guān)性。