張 抒 王夢(mèng)蕾 鄭益志

銀屑病是一種炎癥性皮膚疾病，具有頑固性和復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)。姜黃素已被證明具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤的特性，在銀屑病、白癜風(fēng)等皮膚疾病中得到廣泛應(yīng)用[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損組織中有近百種微小RNA（miRNA）表達(dá)上調(diào)，上調(diào)水平2～42 倍不等，其中miR-203 表達(dá)量升高最明顯[3]。本研究使用外源性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）預(yù)處理HaCaT 細(xì)胞，模擬銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖狀態(tài)[4]。檢測(cè)不同濃度姜黃素作用的HaCaT 細(xì)胞增殖情況及經(jīng)VEGF、姜黃素及兩種聯(lián)合干預(yù)后細(xì)胞miR-203 表達(dá)的改變情況，觀察姜黃素對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)miR-203 表達(dá)的影響，探討其治療銀屑病的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì) 胞 HaCaT 細(xì)胞由浙江中醫(yī)藥大學(xué)龐艷陽(yáng)博士惠贈(zèng)。

1.2 藥物與試劑 姜黃素（批號(hào)130823）、CCK-8 試劑盒（批號(hào)130926）美國(guó)Sigma 公司；VEGF（批號(hào)83572）英國(guó)Abcam 公司；0.25%含EDTA 胰酶（批號(hào)27250）、磷酸鹽緩沖液（PBS 緩沖液）（批號(hào)20012）杭州吉諾生物技術(shù)公司；1640 培養(yǎng)基（批號(hào)30809.01）美國(guó)Hylcone 公司；胎牛血清（批號(hào)140112）杭州四季青公司；無(wú)水乙醇（分析純AR）（批號(hào)2005786）無(wú)錫晶科化工有限公司；二甲基亞砜（DMSO）（批號(hào)131115） 天津天河化學(xué)試劑廠；Prime ScriptTMRT Master Mix（Code No.RR036A）（Perfect Real Time）試劑盒、Mini BEST Universal RNA Extraction Kit（Code No.9767） 日本Takara 公司；Ultra SYBR Mixture（Low ROX）（批號(hào)CW0957C）北京康為世紀(jì)公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 儀 器 生物學(xué)安全臺(tái)（SW-Ⅱ-A/B3）上凈凈化設(shè)備有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（3111）、生化培養(yǎng)箱（MIP-150）、低溫高速離心機(jī)（CL31R）美國(guó)Thermo Forma 公司；倒置生物顯微鏡（XPS-18）重慶重光實(shí)業(yè)有限公司；電子天平（AL204/01） 上海Mettler Toledo 公司；手掌式離心機(jī)（LX-100）海門其林貝爾儀器制造有限公司；多模式酶標(biāo)儀（EnSpire）美國(guó)Perkin Elmer 公司；7900 HT 高通道熒光定量PCR儀美國(guó)ABI 公司；BioPhotometer Plus 核酸蛋白定量測(cè)定儀美國(guó)Eppendorf 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 姜黃素溶液配制 取姜黃素粉末25mg，溶于0.5mL DMSO 中，均勻振蕩，待到完全溶解后加入無(wú)水乙醇至5mL，均勻振蕩，配置成濃度為5mg/mL 的儲(chǔ)存液，分裝后，-20℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩ＥR用前用含0.1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋成目標(biāo)濃度工作液。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞增殖情況 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT 細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，接種于96 孔板，外圈各孔用無(wú)菌PBS 溶液填充；當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿板底70%時(shí)，吸去原培養(yǎng)液，用含25ng/mL VEGF[5]的DMEM 培養(yǎng)液干預(yù)24h（37℃，5%CO2條件下，下同）；吸去原培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞，每孔給予100μL 用DMEM 培養(yǎng)液稀釋的濃度分別為0、19.5、39、78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000ng/mL 的姜黃素溶液，每組濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h；96 孔板棄舊液，無(wú)菌PBS 溶液清洗一次后，每孔加入100μL 實(shí)驗(yàn)試劑（含10μL CCK-8 溶液和90μL DMEM 培養(yǎng)液），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nm 測(cè)定吸光度值（OD 值）。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）法檢測(cè)經(jīng)VEGF、姜黃素及兩種聯(lián)合干預(yù)后細(xì)胞miR-203 表達(dá)改變情況

2.3.1 細(xì)胞鋪板及加藥 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT 細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，接種于6 孔板；當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿板底，約80%時(shí)，吸去舊培養(yǎng)液，根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組：2mL 含0.1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液（空白組）、25ng/mL VEGF 溶液、5000ng/mL 姜黃素溶液、1380ng/mL 姜黃素溶液、5000ng/mL 姜黃素溶液與25ng/mL VEGF 聯(lián)合溶液，1380ng/mL 姜黃素溶液與25ng/mL VEGF 聯(lián)合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.3.2 設(shè)計(jì)合成引物 查閱文獻(xiàn)得出具體序列如下[6]：miRNA-203 上游引物5'-GTCGTACCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGT -3'，miRNA-203 下游引物5'-GCCCGTGAAATGTTTAGGACCAC-3'，hGAPDH 上游引物5'-TCTCTGCTCCTCCTGTTCGA-3'，hGAPDH 下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。以hGAPDH 為內(nèi)參，檢測(cè)miRNA-203 的相對(duì)表達(dá)量。

2.3.3 HaCaT 細(xì)胞總RNA 提取 遵照Prime ScriptTMRT Master Mix Code No.RR036A （Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書。取出6 孔板，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，吸去舊培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS 溶液清洗一次后，每孔加入200μL 裂解液，室溫靜置2min；加入等體積的70%乙醇，移液槍輕輕吹打使溶液均勻混合；立即將混合液移入含2mL Collection Tube 的RNA Spin Column 中，12000r/min 離心1min，棄濾液后將RNA Spin Column 放回2mL Collection Tube 中；在RNA Spin Column 中加入500μL Buffer RWA，12000r/min 離心30s，棄濾液；加入600μL Buffer RWB，12000r/min 離心30s，棄濾液，此操作再重復(fù)一遍；將RNA Spin Column 重新安置回2mL Collection Tube 上，12000r/min 離心2min；取出RNA Spin Column 置于1.5mL 的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央處加入30μL 65℃的RNase Free dH2O，室溫靜置5min；以12000r/min轉(zhuǎn)速離心2min 洗脫RNA，即可獲得實(shí)驗(yàn)所需樣本。

2.3.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用NanoDropND-1000 紫外分光度計(jì)測(cè)量總RNA OD260/280；配制RT 反應(yīng)液（冰上進(jìn)行），每個(gè)樣本按10μL 反應(yīng)體系配置：5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）2μL，Total RNA 10μL 的反應(yīng)體系最大可使用到500ng的總RNA，RNase Free dH2O 補(bǔ)足到10μL。輕輕混勻之后放入儀器進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）37℃15min；（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）85℃5s；4℃。轉(zhuǎn)錄后所得cDNA 可直接用于realtime PCR 反應(yīng)，也可-20℃保存。

2.3.5 Real-time PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)體系：于冰上將以下試劑依次加入八連管各孔中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。50μL 反應(yīng)體系如下：2×UltraSYBR Mixture（Low ROX）25μL；上游引物（Forward Primer）1μL；下游引物（Reverse Primer）1μL；Template DNA 2μL；ddH2O up to 50μL。PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃10min；變性95℃15s；退火/延伸60℃1min；變性和退火/延伸步驟重復(fù)35～40 個(gè)循環(huán)；融解曲線分析95℃15s、60℃1min、95℃15s、60℃15s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算方法：miRNA-203 相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct 方法[7]，△△Ct=△Ct-Avg.△Ct=（Ct miRNA-203-Ct hGAPDH）-Avg.（Ct miRNA-203-Ct hGAPDH）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，CCK-8 法結(jié)果采用回歸分析Probit 法，Real-time PCR 法多組間均值比較采用單因素方差分析，總體均值比較采用welch 檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunnett 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HaCaT 細(xì)胞增殖情況 姜黃素在0～5000ng/mL內(nèi)濃度依賴性抑制HaCaT 細(xì)胞增殖，2500ng/mL 的姜黃素對(duì)HaCaT 細(xì)胞有明顯的抑制作用（P＜0.05），計(jì)算出半數(shù)抑制濃度IC50=6390ng/mL。最終選取5000ng/mL 和1380ng/mL 姜黃素溶液分別作為高濃度組和低濃度組對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。見表1。

3.2 Real-time PCR 結(jié)果 各組miR-203 表達(dá)水平均值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，HaCaT 細(xì)胞在25ng/mL VEGF 溶液干預(yù)刺激下miR-203 的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；高濃度組5000ng/mL 姜黃素溶液能夠明顯下調(diào)HaCaT 細(xì)胞miR-203 表達(dá)（P＜0.05），而低濃度組1380ng/mL 姜黃素溶液則無(wú)明顯差異（P＞0.05）；高濃度組5000ng/mL姜黃素溶液同樣能夠下調(diào)VEGF 誘導(dǎo)下HaCaT 細(xì)胞中miR-203 的表達(dá)（P＜0.05），見表2。

表1 不同濃度姜黃素對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖的影響（）

表1 不同濃度姜黃素對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖的影響（）

注：與0ng/mL 姜黃素比較，aP＜0.05

表2 各組HaCaT 細(xì)胞miR-203 表達(dá)水平比較（）

表2 各組HaCaT 細(xì)胞miR-203 表達(dá)水平比較（）

注：VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；與空白組（濃度為0ng/mL）比較，aP＜0.05；與VEGF 組比較，bP＜0.05

4 討論

銀屑病是由多基因遺傳決定、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)、免疫功能異常性慢性炎癥性皮膚病，諸多因素相互作用致使皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化異常、新生血管形成和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[8]。miR-203 通過(guò)調(diào)控翻譯水平抑制細(xì)胞因子信號(hào)抑制劑-3（S0CS-3）的表達(dá)，是銀屑病炎癥持續(xù)狀態(tài)的原因[9]，干預(yù)miR-203介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可能為治療銀屑病的一種新途徑。miR-203 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的第一種皮膚特異性miRNA，特異性表達(dá)于角質(zhì)細(xì)胞和皮膚上皮細(xì)胞，不但參與調(diào)控胚胎期表皮分化、構(gòu)建皮膚保護(hù)層，且與靶基因共同作用參與細(xì)胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡等[10]。miR-203 的過(guò)表達(dá)可明顯降低細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[11]。姜黃素被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)諸多信號(hào)分子生物活性的潛力，在銀屑病的治療中發(fā)揮了積極作用[12]。而姜黃素的安全性，耐受性和無(wú)毒性高劑量也已通過(guò)人體臨床試驗(yàn)確認(rèn)[13]。本實(shí)驗(yàn)選取0、19.5、39、78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000ng/mL的濃度梯度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性抑制HaCaT 細(xì)胞增殖，2500ng/mL姜黃素明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）。與空白組比較，miR-203 在25ng/mL VEGF 誘導(dǎo)下的HaCaT 細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），而5000ng/mL 姜黃素能明顯抑制HaCaT 細(xì)胞中miR-203 的表達(dá)（P＜0.05），同樣能下調(diào)25ng/mL VEGF 刺激干預(yù)下HaCaT 細(xì)胞中miR-203 表達(dá)（P＜0.05）。推測(cè)姜黃素通過(guò)下調(diào)miR-203 表達(dá)來(lái)干預(yù)miR-203 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，從而達(dá)到治療銀屑病目的。