仁科

（四川省若爾蓋縣藏獸醫(yī)藥研究所，四川 若爾蓋 624504）

翻白草始載于《救荒本草》，是一種常見中藥［1］，又名雞腿兒、雞腿根、雞腳草、鴨腳參，為薔薇科委陵菜屬植物“翻白草”的干燥全草。翻白草性平、味甘、微苦、無毒，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有止血止痢、清熱解毒、消腫之功效，常用于赤痢腹痛、久痢不止、咳血、吐血、大便帶血、崩漏、肺癰、癰腫及結(jié)核等［2］。相關(guān)研究也表明，翻白草具有抗菌、止瀉、免疫抑制、降血糖和抗腫瘤作用［3-5］。由于翻白草的提取物有特殊的藥理學活性，關(guān)于翻白草的化學成分已有大量研究，據(jù)報道其化學成分主要有黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)類等［6-8］。對翻白草化學成分的研究起始于上世紀30年代，主要分離到的是多烯類化合物、黃酮和β-胡蘿卜素。中國科學院昆明植物研究所首次從翻白草的甲醇提取物中分離得到6 個化合物，分別為黃酮類和三萜類化合物［9］。其中黃酮類化合物的毒副作用小，不僅可以降低血糖，其清熱解毒作用還可提高機體免疫功能，防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，由于其價格低廉，很有開發(fā)價值［10］。

近年來，隨著半合成和合成抗菌藥物的廣泛開發(fā)和應用，細菌耐藥性問題日趨嚴重。面對這一嚴峻現(xiàn)狀，國內(nèi)外越來越多的學者在各種中草藥成分抗菌活性方面展開了相關(guān)研究，同時期望從中草藥中得到更加理想的抗菌藥物［11-13］。因此，系統(tǒng)地研究中藥的抑菌活性，進一步開發(fā)新的抗菌藥物對合理利用我國寶貴的中藥植物資源具有十分重要的意義。

基于此，本研究以去離子水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚為溶劑，分別對翻白草全草進行提取，然后以10種細菌標準株為研究對象，分析不同溶劑提取的主要活性成分對細菌的抑制情況，以期為翻白草藥用價值的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材來源 翻白草采于河南省唐河縣城西丘陵地帶，經(jīng)鑒定為薔薇科委陵菜屬植物“翻白草”全草。藥材采集后洗凈泥沙，晾干、粉粹備用。

1.1.2 供試菌株 普通變形桿菌（10491-1）、肺炎克雷伯氏菌（1.10612-1）、痢疾志賀氏菌（1.1869-1）、腸沙門氏菌腸亞種（1.10754-1）、粘質(zhì)沙雷氏菌（1.4256-1）、金黃色葡萄球菌（50094-1a2）、F菌（糞腸球菌ATCC25912）、S菌（屎腸球菌ATCC35667）、阪崎腸桿菌（1.6765-1）、陰溝腸桿菌陰溝亞種（1.2022-3）等10 種標準菌株由西南民族大學獸醫(yī)藥理實驗室保存和提供。

1.1.3 主要儀器及培養(yǎng)基 無菌操作臺、隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等，均由西南民族大學獸醫(yī)藥理學實驗室提供。所用培養(yǎng)基為TSA培養(yǎng)基、MH肉湯、MH肉湯瓊脂培養(yǎng)基，臨用前參照說明書配制。

1.2 方法

1.2.1 翻白草提取物的制備 準確稱取粉碎的翻白草200 g，分別浸泡于2 L不同提取溶劑（去離子水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚）中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回流提取3 次浸取液。每次浸泡48 h，旋蒸至棕褐色浸膏為止，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90 r/min，溫度控制在50 ℃左右。

1.2.2 生化反應和薄層層析 準確稱取實驗室備用的翻白草粉劑10 g，浸泡于100 mL 去離子水溶液中，浸泡48 h 后過濾備用。取若干滅菌試管，在試管中加入適量翻白草濾液，然后加入各類理化檢測試劑進行植物化學成分的分析鑒定。取層析缸，以石油醚∶乙酸乙酯（1∶10，V/V）為展開劑，在硅膠板上點樣后放入層析缸中，展開后在紫外燈下觀察記錄有無熒光，噴上顯色劑后再在紫外燈下觀察熒光情況。

1.2.3 翻白草不同提取物最小抑菌濃度（MIC）的測定 參照CLSI（臨床實驗室標準化協(xié)會，2013 版）指導原則和執(zhí)行標準，采取微量肉湯稀釋法測定翻白草4 種溶劑提取物對10 種標準菌株的體外抑菌敏感性。步驟如下：將MH 肉湯按照每孔100 μL加入96 孔板的1～12列，然后第1列的分別加入100 μL 不同提取溶劑（去離子水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚）的提取物，按照倍比稀釋法操作，依次將第1 列每孔稀釋物加至2～11列，然后在1～11列各孔加入菌懸液，以不加菌懸液的第12 列為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察MIC 結(jié)果。所有陰性對照孔的培養(yǎng)基澄清，說明本實驗方法可行。以抑制細菌生長的翻白草提取物的最高稀釋濃度作為翻白草提取物的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.4 翻白草不同提取物的抑菌圈測定 采用紙片法測量抑菌圈直徑，方法如下：在無菌工作臺中，取多個MH肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分別加入1種標準菌株的懸菌液30 μL，涂布均勻，做好標記；每個培養(yǎng)基中均勻放置4 個經(jīng)高壓蒸汽滅菌過的空白藥敏片，在培養(yǎng)基外壁藥敏片對應的位置分別標記1、2、3、4，在位置1 的藥敏片上均滴上10 μL 去離子水提取物，在位置2 的藥敏片上均滴上10 μL 石油醚提取物，在位置3 的藥敏片上均滴上10 μL 甲醇提取物，在位置4 的藥敏片上均滴上10 μL 乙酸乙酯提取物；然后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物化學成分分析鑒定 采用生化反應和薄層層析對提取物進行活性成分鑒定。結(jié)果得出：翻白草提取物中含有三萜類、甾體類、酚類、鞣質(zhì)類和黃酮類等活性成分（見表1和表2）。

表1 翻白草水提物活性成分化學反應鑒定結(jié)果

表2 翻白草水提物活性成分薄層層析鑒定結(jié)果

2.2 體外抑菌試驗 翻白草4 種溶劑提取物對10 株標準菌株的體外抑菌結(jié)果如表3 和表4 所示。結(jié)果表明，翻白草提取物對試驗菌株均有抑制作用，其中石油醚提取物對糞腸球菌ATCC25912 和屎腸球菌ATCC35667 的最小抑菌濃度最低。

3 小結(jié)

本試驗采用生化反應法和薄層層析法鑒定了翻白草的化學成分，結(jié)果表明翻白草中含有黃酮類、酚和鞣質(zhì)類、三萜和甾體類等化學成分。抑菌試驗表明翻白草全草的去離子水、甲醇、乙酸乙酯、石油醚提取物對供試的10 種細菌均存在不同程度的抑制作用，說明翻白草具有較好的抗菌活性。對不同提取溶劑的體外抑菌效果進行比較，在微量肉湯稀釋法中，4 種溶劑提取的翻白草活性成分的抑菌效果相當，其中石油醚提取物對S菌（屎腸球菌ATCC35667）、F菌（糞腸球菌ATCC25912）有明顯的抑制效果；在紙片擴散法中，去離子水、甲醇、乙酸乙酯三種提取物的抑菌效果相當，且都高于石油醚提取物的抑菌效果。

表3 翻白草4種溶劑提取物對10種標準菌株的體外最小抑菌濃度（MIC）

表4 翻白草4種溶劑提取物對10株標準菌的抑菌圈直徑（d）

上述兩種抑菌試驗中，由于96孔板相鄰兩孔的濃度差很大，故不能得出確切的抑菌濃度；紙片法中因為藥液在擴散時快慢不一，故對翻白草抑菌結(jié)果的評價存在一定的誤差。