黃迪，李敏，周瀟瀟，周紫峣，向曉雪，岳建國(guó)*

（1.四川省成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，又稱(chēng)豬藍(lán)耳病。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將該病列為二類(lèi)動(dòng)物傳染病［1］。其主要臨床癥狀如下：妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎和死胎等嚴(yán)重繁殖障礙，各年齡段豬發(fā)生呼吸障礙［2］。近年來(lái)臨床癥狀趨于復(fù)雜，且多表現(xiàn)為混合感染，加大了該病診斷的難度［3］。PRRS具有發(fā)病急、傳播快、流行廣、病死率高等特點(diǎn)，自上世紀(jì)90 年代傳入我國(guó)以來(lái)，至今仍未被清除，給我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了持續(xù)威脅。2019年6～9月，筆者采用熒光定量PCR方法對(duì)成都市三個(gè)無(wú)害化處理廠的237 份組織病料樣本進(jìn)行PRRSV 核酸檢測(cè)，旨在了解成都市養(yǎng)殖場(chǎng)中PRRS的發(fā)病情況，以期為成都市PRRS流行病學(xué)調(diào)查和疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 樣品采集于成都市無(wú)害化處理廠，來(lái)源于成都市15 個(gè)市（區(qū)）縣，共抽檢采樣豬淋巴組織237份。

1.1.2 主要試劑 磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨生物技術(shù)有限公司；豬藍(lán)耳病病毒通用型單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京億森寶生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 取2 mL 無(wú)菌Lysing Matrix 組織研磨管，加入1 mL PBS 液，再加入適量淋巴組織樣品，置于FastPrep-24?5G 研磨儀，研磨30 s后取下研磨管，置于離心機(jī)8 000 r/min離心1 min，取上清保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA抽提 參照磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，配合KingFisher DUO自動(dòng)化提取儀器，執(zhí)行Tian_KingFisher_Duo.bdz 程序進(jìn)行DNA 抽提。程序執(zhí)行完畢，取出DNA，用封口膜封好保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 從試劑盒中取出熒光qRT-PCR 反應(yīng)液（PRRSV-qRT-PCR MIX）、酶混合物（Enzymes MIX），冰上融化并振蕩混勻后，10 000 r/min離心10 s。

PCR 反應(yīng)管內(nèi)依次加入熒光PCR 反應(yīng)液14 μL，酶混合物1 μL，處理后樣品或陰性對(duì)照（NTC）、陽(yáng)性對(duì)照（PRRSV-PTC）5 μL，配制成20 μL 的qRT-PCR 反應(yīng)體系，10 000 r/min 離心10 s。將各反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀器反應(yīng)槽內(nèi)，循環(huán)條件如下：

第一步：反轉(zhuǎn)錄，45 ℃10 min，1個(gè)循環(huán)；第二步：預(yù)變性，95 ℃10 min，1 個(gè)循環(huán)；第三步：PCR擴(kuò)增，95 ℃15 s、60 ℃45 s，40 個(gè)循環(huán)。在60 ℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)，報(bào)告基團(tuán)：FAM，淬滅基團(tuán)：NONE。

1.3 結(jié)果判定 直接讀取檢測(cè)結(jié)果?；€(xiàn)和閾值設(shè)定原則依據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

在試驗(yàn)成立的條件下，Ct值≤35 的樣本為陽(yáng)性，表明PRRSV 核酸陽(yáng)性；Ct值顯示為“None”的樣本為陰性，表明PRRSV 核酸陰性；如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。

2 結(jié)果與分析

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。共檢測(cè)病死豬淋巴組織樣本237 份，結(jié)果得出PRRSV 陽(yáng)性樣本有10 份，陽(yáng)性率為4.22%。

表1 2019年夏季成都市病死豬繁殖與呼吸綜合征qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 藍(lán)耳病防控現(xiàn)狀及建議 由于PRRS 的高傳染性、高致病性，使得我國(guó)PRRS的防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。為有效控制PRRS，相應(yīng)的生物安全措施必不可少。控制PRRS的核心環(huán)節(jié)是穩(wěn)定種豬群［4］。鑒于PRRSV 具有高度變異、易重組、毒株類(lèi)型復(fù)雜的特點(diǎn)，各養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)應(yīng)重視閉群環(huán)節(jié)。PRRSV 陽(yáng)性豬場(chǎng)應(yīng)淘汰陽(yáng)性種豬，停止引種，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)；陽(yáng)性和陰性豬群應(yīng)做好隔離消毒；豬只引種和運(yùn)輸要嚴(yán)格檢疫，防止病毒引入和擴(kuò)散；提高人員生物安全意識(shí)，嚴(yán)格執(zhí)行生物安全標(biāo)準(zhǔn)；保證圈舍干燥通風(fēng)、溫度適宜，將感染風(fēng)險(xiǎn)降到最低。

防控PRRS 的另一核心環(huán)節(jié)則是合理、科學(xué)地使用疫苗。部分養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)因疫苗選用不當(dāng)、接種計(jì)劃制定不合理以及滅活苗、弱毒苗濫用，加速了PRRSV 毒力返強(qiáng)和毒株間重組，導(dǎo)致PRRS疫情仍有散發(fā)并有多發(fā)趨勢(shì)［5］，也為我國(guó)PRRS的防控和凈化帶來(lái)了較大難度。

3.2 藍(lán)耳病防控目標(biāo) 為了進(jìn)一步加強(qiáng)動(dòng)物疫病防控工作，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、財(cái)政部曾聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于調(diào)整完善動(dòng)物疫病防控支持政策的通知》，高致病性豬藍(lán)耳病暫不實(shí)施國(guó)家強(qiáng)制免疫政策。遵照通知要求，陰性養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)應(yīng)杜絕PRRS免疫接種；穩(wěn)定感染的養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)不建議進(jìn)行免疫接種；不穩(wěn)定感染養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)，應(yīng)先做好周邊區(qū)域的流行病學(xué)調(diào)查，明確當(dāng)?shù)亓餍卸局辏挪樯锇踩[患，進(jìn)而選擇相應(yīng)毒株的弱毒苗按照適當(dāng)?shù)拿庖哂?jì)劃進(jìn)行免疫。免疫方式和時(shí)間，受生產(chǎn)者的目標(biāo)影響，如果生產(chǎn)者的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)場(chǎng)戶(hù)內(nèi)PRRSV 凈化，則最終應(yīng)停止PRRSV 疫苗的免疫［6］。

目前我國(guó)正處于非洲豬瘟等動(dòng)物疫病防控的關(guān)鍵時(shí)期，各養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)應(yīng)重視生物安全防護(hù)，嚴(yán)格執(zhí)行生物安全規(guī)程；相關(guān)部門(mén)應(yīng)遵照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《國(guó)家高致病性藍(lán)耳病防治指導(dǎo)意見(jiàn)（2017-2020年）》，嚴(yán)格落實(shí)免疫預(yù)防、檢測(cè)凈化、檢疫監(jiān)管、應(yīng)急處置、無(wú)害化處理等綜合防控措施，積極開(kāi)展場(chǎng)群或區(qū)域凈化工作。成都地區(qū)力爭(zhēng)在2020 年底實(shí)現(xiàn)市內(nèi)核心育種場(chǎng)達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)，其他養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)的防治目標(biāo)。本研究結(jié)果對(duì)各區(qū)（市）縣養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)的PRRS感染情況進(jìn)行了摸底，為成都市PRRS 流行病學(xué)調(diào)查和疫情防控提供了科學(xué)參考。本研究?jī)H對(duì)PRRSV進(jìn)行了通用型單重?zé)晒釶CR檢測(cè)，如需進(jìn)一步確定各養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)的流行毒株（如經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV），則應(yīng)進(jìn)一步對(duì)相關(guān)病原進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究表明，2019 年夏季在成都市抽檢的237 份豬淋巴組織樣品中，仍有PRRSV 陽(yáng)性檢出，綜合陽(yáng)性率為4.22%，表明成都市各區(qū)（市）縣養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)中仍散在藍(lán)耳病毒。