曾梅，徐樹培，張敏，李思聰，王斌，吳讓忠

（1.四川省木里縣動物疫病預防控制中心，四川 木里 615899；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

大腸桿菌是人和動物腸道共生菌群的組成部分，部分致病性大腸桿菌能引起人和動物腹瀉、敗血癥等多種癥狀［1］。大腸桿菌在藥物的選擇壓力下易產生耐藥性，并可通過菌毛將耐藥質粒傳遞給其他大腸桿菌，因而給大腸桿菌病的藥物防控帶來了較大的挑戰(zhàn)［2］。當前大腸桿菌耐藥及多重耐藥現(xiàn)象日益嚴重，動物源耐藥菌株可能會通過環(huán)境污染、動物源食品及與動物的接觸傳播給人類，導致公共衛(wèi)生問題。本研究對四川西昌地區(qū)豬源樣品進行了大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析，以期為合理使用抗生素提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本采集 無菌采集西昌地區(qū)21個豬場的病死豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結作為病料樣本，置滅菌普通肉湯離心管中，送實驗室進行細菌分離。

1.2 試劑、培養(yǎng)基和標準菌株 麥康凱瓊脂、營養(yǎng)肉湯、MH瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑公司；標準菌株：大腸桿菌標準株ATCC 25922，購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.3 實驗動物 昆明系SPF小鼠，購自四川達碩生物技術有限公司。

2 方法

2.1 病料接種 無菌切取病變組織和正常組織交界處的小組織塊置肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下進行24 h 增菌培養(yǎng)。然后蘸取增菌液劃線于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板上，37 ℃純化培養(yǎng)24 h。

2.2 菌落形態(tài)特征觀察 伊紅美藍瓊脂上出現(xiàn)黑棕色、棕綠色且?guī)в薪饘俜垂獾木洌虺霈F(xiàn)中心黑點邊緣呈灰白色的表面光滑的菌落；麥康凱瓊脂上出現(xiàn)典型紅色、粉紅色的光滑菌落。采用16s rDNA PCR作進一步的分子鑒定。

2.3 16S rDNA PCR 測序鑒定［3］從伊紅美藍瓊脂或麥康凱瓊脂上挑取純化后的典型單個菌落進行PCR 試驗，擴增細菌16S rDNA 基因。引物為通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應條件：95℃5min；95℃1min；50 ℃1min，72 ℃2 min，共30 次循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，預擴增片段1 450 bp。PCR 產物由上海生工生物工程技術服務有限公司純化并測序，序列結果用NCBI BLAST 搜索比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性試驗［4］將鑒定了的豬源大腸桿菌接種到MH 瓊脂平板，經37 ℃24 h 純培養(yǎng)，用滅菌生理鹽水洗下菌液，調整渾濁度與0.5 麥氏比濁管（1×108CFU/mL）相當，再分別腹腔注射小白鼠（0.2 mL/只），每株菌同時接種3只小鼠，并設標準株ATCC 25922 為對照，觀察分離菌株對小鼠的致病性。

2.5 藥敏試驗 菌株于MH 肉湯中恒溫（37 ℃）培養(yǎng)12 h后，用生理鹽水稀釋為0.5倍麥氏濃度，均勻涂布于MH瓊脂平板。然后用藥敏紙片分散器將藥敏紙片均勻貼在瓊脂平板表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后測量抑菌圈大小。

3 結果

3.1 細菌分離 從21 個豬場采集的106 份病料樣本中分離到大腸桿菌28 株，分離率達26.4%。各個臟器的分離率分別為心臟7.1%（2/28），肺臟32.1%（9/28），淋巴結21.4%（6/28），肝臟7.1%（2/28），脾臟10.7%（3/28），腎臟21.4%（6/28）。

3.2 致病性試驗 用分離出來的28株大腸桿菌攻毒小鼠，24 h內有6株導致1只小鼠死亡，14株導致2只小鼠死亡，8株導致3只小鼠死亡。從死亡小鼠的器官中也分離到了同種菌。對照組無死亡。

3.3 藥敏試驗 28 株大腸桿菌的藥敏試驗結果見表1。從表1 可知，本次臨床分離菌對阿莫西林、氨芐西林、強力霉素、四環(huán)素、慶大霉素、復方新諾明的耐藥性嚴重，耐藥率高于85%，對阿米卡星和頭孢喹肟保持較高的敏感性，耐藥率分別為14.3%和10.7%。28株大腸桿菌全部表現(xiàn)為多重耐藥，至少耐6種及以上受試藥物，表明西昌地區(qū)豬源腸外致病性大腸桿菌的耐藥性強、耐藥譜廣。

表1 28株大腸桿菌分離株的耐藥性檢測

4 討論

4.1 本試驗對西昌地區(qū)豬源大腸桿菌的耐藥情況進行了檢測分析。結果表明，所分離的28株大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林、強力霉素、四環(huán)素、慶大霉素、復方新諾明的耐藥率高于85%。28株大腸桿菌全部表現(xiàn)為多重耐藥，至少耐6種及以上受試藥物，表明西昌地區(qū)豬源腸外致病性大腸桿菌的耐藥性強、耐藥譜廣。

4.2 檢測結果顯示28株耐藥大腸桿菌對頭孢喹肟、阿米卡星敏感性較高，與2017年孔令漢等［5］、2015 年王斌等［6］報道的結果一致。阿米卡星耐藥率低的主要原因可能與阿米卡星作為人醫(yī)臨床用藥尚未允許在獸醫(yī)臨床使用有關，但值得關注的是，分離菌株中仍有14.3%對阿米卡星耐藥，其耐藥機制值得進一步研究。頭孢喹肟為第四代動物專用頭孢菌素，在我國獸醫(yī)臨床上的使用時間較短，故對分離菌具有較好的抑菌效果。

4.3 β-內酰胺類抗生素作為獸醫(yī)和人醫(yī)常用抗生素，其耐藥性的發(fā)生發(fā)展不僅關系到畜禽健康養(yǎng)殖，而且對人醫(yī)臨床上的耐藥性檢測具有重要的參考價值。本試驗分離的西昌地區(qū)21 個養(yǎng)殖場的28 株豬源大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林的耐藥性高達90%以上，與王斌等［6］、曾博等［7］研究的結果相似。2013 年曾博等［7］曾報道其分離的79 株規(guī)模化豬場腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）對氨芐西林（耐藥率為87.3%）、阿莫西林（耐藥率為91.1%）的耐藥性較強，對頭孢噻呋（耐藥率為7.6%）、氨芐西林/舒巴坦（耐藥率為11.4%）、阿莫西林/棒酸（耐藥率為16.4%）相對敏感。2015 年王斌等［6］報道其分離的40 株ExPEC菌株對氨芐西林（耐藥率為92.5%）的耐藥性較強，對氨芐西林/舒巴坦（耐藥率為12.5%）、頭孢克肟（耐藥率為10.0%）表現(xiàn)出相對較好的敏感性。值得關注的是，近年來復方β-內酰胺酶抑制劑類抗生素和頭孢類抗生素的耐藥性有增加趨勢，可能與這兩類藥物在臨床中大量使用有關［8］。建議養(yǎng)殖戶加強生豬養(yǎng)殖過程中的生物安全管理，通過藥敏試驗篩選敏感藥物，做到精準用藥、科學用藥。