朱理輝，羅勇，鄧萍萍，陳宏輝，陳汶，李國慶，王正根，張琍

（南華大學附屬第二醫(yī)院 1.消化內科，2.重癥醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001）

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者就診時為中晚期，無手術治療機會，目前中晚期胃癌的治療主要采用以化療為主的綜合治療[1]。白藜蘆醇又稱為芪三酚屬天然多酚類化合物，是藥食作物（如桑椹、虎杖、葡萄、花生等）的主要成分，具有很強的抗氧化活性[2]，屬于植物源性藥物，具有毒副作用少和植物衍生成分廣泛靶標的特點。其在抗腫瘤治療中的作用已有許多研究，包括結腸癌、皮膚惡性黑色素瘤、子宮內膜癌等[3-5]，但其對胃癌細胞增殖的影響及相關作用機制尚不清楚。本研究通過觀察不同濃度白藜蘆醇對胃癌細胞株MKN45 增殖及絲裂原活化蛋白激酶（MEK）/細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）信號通路相關蛋白表達的影響，為臨床治療及新藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胃癌細胞株MKN45（中國科學科院上海細胞研究所），白藜蘆醇和PD98059（美國Sigma Aldrich 公司），四甲基偶氮唑藍（MTT）檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），胎牛血清及RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），二甲亞砜（DMSO）（中國醫(yī)藥集團有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma Aldrich 公司），兔抗Ras 及Raf 一抗（美國Cell Signaling 公司），兔抗MEK 及ERK1/2 一抗（美國Santa Cruz 公司），二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司），熒光顯微鏡（德國萊卡公司），低溫高速離心機（美國貝克曼庫爾特公司），凝膠成像儀（美國Bio Rad 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人胃癌MKN45 細胞為貼壁生長細胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 u/ml 青霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每日光學顯微鏡下觀察，細胞呈單層生長，鋪滿培養(yǎng)瓶時傳代。傳代時常規(guī)吸去培養(yǎng)液，PBS 洗2 ～3 遍，以0.25%胰酶消化適度，吸去胰酶，加適量培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞制成細胞懸液。

1.2.2 實驗分組實驗分為對照組（DMSO，100 μg/ml，100 μl）、MEK/ERK 信號通路抑制劑PD98059 組（20 mg/L，100 μl）（PD98059 組）、白藜蘆醇低劑量組（100 μmol/L）、白藜蘆醇高劑量組（400 μmol/L）。將228.2 mg 白藜蘆醇加入10 ml DMSO 溶解，配置成濃度為100 mmol/L 的儲存液，應用微孔濾膜濾過后將白藜蘆醇母液-20℃避光保存?zhèn)溆谩⒖紬詈榍颷6]的研究結果，進行預試驗，最終設置白藜蘆醇組的濃度為100 和400 μmol/L，臨用前取白藜蘆醇母液用細胞培養(yǎng)基稀釋成100 和400 μmol/L 的終濃度，使DMSO的最終濃度低于0.2%。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期細胞用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，吹打重懸細胞至濃度為5×104個/ml的細胞懸液，平行接種于96孔培養(yǎng)板中,待細胞接近70%融合時,將MKN45 按照1.2.2 分組方法隨機分為4 組： 對照組、PD98059 組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇高劑量組。于1、2 和4 h 輕輕棄去各組細胞培養(yǎng)孔內的培養(yǎng)液，加入20 μl的MTT 繼續(xù)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。無菌PBS 沖洗后在各組細胞中加入150 μl DMSO，震蕩處理。用酶標儀檢測培養(yǎng)后細胞培養(yǎng)板各個培養(yǎng)孔光密度（OD）值，并計算抑制率。細胞的增殖抑制率=（對照組OD 值-實驗組OD 值）/對照組OD 值×100%。IC50 計算方法（寇式法）： IC50=lg-1 [Xm-I（P-0.5）]，其中 Xm： 最大濃度對數(shù)值；I： 最大濃度/相鄰濃度的對數(shù)值；P： 各組生長抑制率之和；0.5 為經(jīng)驗常數(shù)。每組重復6 次。

1.2.4 Western blotting 法 檢 測Ras、Raf、MEK、ERK1/2 蛋白的表達4 組細胞相應處理4 h 后，PBS洗滌細胞，適量的裂解液冰上裂解30 min，收集細胞，4℃、14 000 r/min 離心15 min，收集上清液。BCA 試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，SDS-PAGE 電泳分離，4℃轉膜過夜。取出PVDF膜進行小沖洗。用純化水配置5%胎牛血清進行封閉（10 min）。在20℃的室溫條件下將PVDF 膜分別與Ras、Raf、MEK、ERK1/2 第一抗體（稀釋倍數(shù)為200）培養(yǎng)60 min，無菌PBS 沖洗（5 min/次，共沖洗3 次）后，與二抗（稀釋倍數(shù)為500）共培養(yǎng)50 min。PBS 沖洗3 次后DAB 顯色，拍照。每組重復6 次。

1.2.5 免疫細胞化學法檢測MEK、ERK1/2 蛋白熒光強度的變化將在無菌蓋玻片上生長良好并經(jīng)相應處理后的MKN45 用無菌PBS 沖洗3 次并用冰丙酮（-20℃）固定。并將其在無菌凈化工作臺上吹干，用1.0%體積分數(shù)的Triton-100 增加各組細胞通透性。用5.0%胎牛血清白蛋白溶液封閉。分別用相應濃度的MEK、ERK1/2 第一抗體稀釋液于20℃條件下處理細胞3 h，無菌PBS 漂洗3 次。將漂洗后的細胞載玻片與FITC 標記二抗避光37℃孵育2 h，無菌PBS 漂洗3 次后用熒光顯微鏡拍照（二抗孵育完畢至拍照時間控制在90 min）。每組重復6 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對MKN45 細胞增殖的抑制作用

各組在0、1、2 及4 h 時MKN45 細胞增殖抑制率的比較，采用重復測量設計的方差分析，結果： ①不同時間點MKN45 細胞的增殖抑制率有差異（F=449.928，P=0.000）。②組間MKN45 細胞的增殖抑制率有差異（F=242.550，P=0.000），與對照組比較，PD98059 組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇高劑量組對MKN45 細胞的增殖抑制率升高（P＜0.05），以白藜蘆醇高劑量組最高。③各組MKN45 細胞的增殖抑制率的變化趨勢有差異（F=258.470，P=0.000）。見表1。

2.2 白藜蘆醇對癌細胞株MEK/ERK 信號通路中Ras、Raf、MEK 和ERK1/2 蛋白表達的影響

細胞處理4 h 后，各組細胞Ras、Raf、MEK 和ERK1/2 蛋白的相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PD98059 組、白藜蘆醇低劑量組和白藜蘆醇高劑量組均低于對照組，且白藜蘆醇高劑量組低于低劑量組。見表2和圖1。

同時，免疫細胞化學法檢測結果顯示，MEK 及ERK1/2 蛋白主要定位于細胞質，且PD98059 組、白藜蘆醇低劑量組和白藜蘆醇高劑量組細胞MEK 及ERK1/2 的熒光強度均減弱，見圖2、3。

表1 白藜蘆醇對MKN45 細胞株增殖的抑制作用 （n =6，±s）

表1 白藜蘆醇對MKN45 細胞株增殖的抑制作用 （n =6，±s）

組別 0 h 1 h 2 h 4 h對照組 0.010±0.000 0.010±0.000 0.010±0.000 0.010±0.000 PD98059 組 0.053±0.010 0.193±0.078 0.290±0.033 0.398±0.104白藜蘆醇低劑量組 0.042±0.019 0.123±0.025 0.188±0.026 0.262±0.035白藜蘆醇高劑量組 0.035±0.019 0.255±0.054 0.425±0.040 0.540±0.047

表2 各組MKN45 細胞Ras、Raf、MEK 和ERK1/2 蛋白的相對灰度值 （n=6，±s）

表2 各組MKN45 細胞Ras、Raf、MEK 和ERK1/2 蛋白的相對灰度值 （n=6，±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與白藜蘆醇低劑量組比較，P ＜0.05。

組別 Ras Raf MEK ERK1/2對照組 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 PD98059 組 0.725±0.018① 0.659±0.025① 0.783±0.003① 0.729±0.015①白藜蘆醇低劑量組 0.787±0.015① 0.774±0.015① 0.814±0.005① 0.800±0.018①白藜蘆醇高劑量組 0.532±0.017①② 0.651±0.013①② 0.750±0.003①② 0.698±0.014①②F 值 178.583 103.148 1413.797 98.065 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 白藜蘆醇對MKN45 細胞株Ras、Raf、MEK和ERK1/2 表達的影響

圖2 白藜蘆醇對MKN45 細胞株MEK 蛋白表達的影響（×400）

圖3 白藜蘆醇對MKN45 細胞株ERK1/2 蛋白表達的影響（×400）

3 討論

白藜蘆醇屬于多酚類化合物，是惡性腫瘤的化學預防物質，對癌細胞有促凋亡、抗增殖作用，以及抑制動物腫瘤生長的能力。已有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可能通過抑制COX-2 的表達和活性誘導細胞凋亡[7]、阻斷TNF-α/TNF-β 受體誘導的NF-κB 活化抑制腫瘤細胞的增殖[8]、干擾葡萄糖發(fā)酵和促進呼吸來減緩腫瘤細胞的生長[9]、抑制類花生酸合成、阻滯細胞周期進展等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。白藜蘆醇抗腫瘤的另一個作用可能是與化療藥物的相互作用，降低順鉑腎毒性[11]。本研究顯示，MKN45 細胞在經(jīng)PD98059、100 μmol/L 白藜蘆醇和400 μmol/L 白藜蘆醇處理后，與對照組比較，表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且隨著時間的延長和劑量增加，細胞增殖抑制率升高，呈時間劑量依賴性，PD98059 阻斷MEK/ERK 信號通路同樣可抑制胃癌細胞增殖，提示白藜蘆醇對MKN45 增殖的抑制作用，可能與阻斷MEK/ERK 信號通路有關。

MEK/ERK 信號轉導通路是細胞外信號刺激向細胞內轉導進而誘發(fā)細胞發(fā)生生理或病理過程的主要途徑，其參與調控細胞的增殖、分化、凋亡、轉移及癌變等多種生理或病理學過程[12-13]，且已有證據(jù)顯示其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有相關性[14]。白藜蘆醇可以通過下調ERK1/2 和糖原合成酶激酶-3 信號級聯(lián)作用抑制釩酸鈉（Na3VO4）誘導的神經(jīng)來源外泌體表達蛋白p-S396-tau 的表達水平，白藜蘆醇減少長期暴露于Na3VO4或FeCl2后細胞外活性氧產生和海馬毒性的增加，而此過程與其影響ERK 信號轉導通路有關[15]。提示MEK/ERK 信號通路可能是藥物干預治療的潛在靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白藜蘆醇處理后胃癌細胞的MEK/ERK 信號通路蛋白Ras、Raf、MEK 和ERK1/2 表達水平降低，經(jīng)PD98059 阻斷MEK/ERK 信號通路后同樣可使Ras、Raf、MEK 和ERK1/2 表達水平降低。CHEN 等[3]研究證實，白藜蘆醇可能通過抑制MEK/ERK 信號通路來促進人結腸癌SW620 細胞凋亡。提示白藜蘆醇可能是通過抑制MEK/ERK 信號通路中Ras、Raf、MEK 和ERK1/2 蛋白表達發(fā)揮抑制胃癌細胞增殖的作用。

本研究雖然檢測了白藜蘆醇抑制胃癌細胞株MKN45 的增殖效果，且發(fā)現(xiàn)MEK/ERK 信號通路蛋白參與其中。但尚未對MEK/ERK 信號通路中關鍵蛋白磷酸化形式的表達變化進行檢測。下一步將對此進行研究，為更準確地闡明其相關抗腫瘤機制提供參考。