賈文慶，郭英姿，王艷麗，朱小佩，王 政，劉改秀，劉會超，何松林，張翔宇

貯存條件對卵葉牡丹花粉壽命的影響

賈文慶1,2，郭英姿1,2，王艷麗1，朱小佩1，王 政2，劉改秀3，劉會超1，何松林1※，張翔宇1

（1. 河南科技學(xué)院河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，新鄉(xiāng) 453003；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002；3. 洛陽國家牡丹園，洛陽 471000）

為確定卵葉牡丹花粉萌發(fā)力準確測定的適宜培養(yǎng)基及高效保存方法，解析花粉在不同溫度貯存下花粉萌發(fā)率變化的生理機制。采用掃描電鏡觀察分析卵葉牡丹花粉表觀特征，用離體培養(yǎng)法對卵葉牡丹花粉進行了4因素（蔗糖、硼酸、Ca(NO3)2、GA3含量）3水平正交試驗，并研究了不同貯存溫度及時間對花粉萌發(fā)率、超氧化物歧化酶（SOD，Superoxide Dismutase）、過氧化物酶（POD，Peroxidase）、過氧化氫酶（CAT，Catalase）活性、丙二醛（MDA，Malondialdehyde）含量的影響。結(jié)果表明：卵葉牡丹花粉畸形、癟粒率達19.50%，是卵葉牡丹新鮮花粉萌發(fā)率低的主要原因；影響卵葉牡丹花粉萌發(fā)的因子依次為：蔗糖，硼酸，Ca(NO3)2，GA3；花粉萌發(fā)力檢測的最適宜培養(yǎng)基為：110 g/L蔗糖，45 mg/L硼酸，55 mg/L GA3，30 mg/L Ca(NO3)2；2、-20 ℃分別適宜1~6個月花粉的短期貯存，-80 ℃適合花粉1 a左右的中期貯存，-196 ℃適合花粉的長期保存；相關(guān)分析結(jié)果顯示：花粉萌發(fā)率與3種保護酶活性呈顯著正相關(guān)，與丙二醛含量呈顯著負相關(guān)，3種保護酶活性對花粉萌發(fā)率的影響次序為：超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，過氧化物酶；不同貯存溫度下，3種保護酶的敏感性不同，室溫下，POD為敏感性保護酶；2、-20、-80 ℃下，SOD為敏感性保護酶；花粉丙二醛含量及3種保護酶活性基本穩(wěn)定，氧化代謝保持平衡，是卵葉牡丹花粉在-196 ℃下貯存長久保持高萌發(fā)力的內(nèi)因；保護酶活性降低、丙二醛含量升高，不能有效清除活性氧、自由基，生理代謝失衡是卵葉牡丹花粉在室溫、2、-20 ℃下貯存壽命縮短的主要原因之一。

貯存；低溫；酶；卵葉牡丹；花粉表觀特征；萌發(fā)；丙二醛

0 引 言

卵葉牡丹（）為芍藥科芍藥屬落葉灌木，是現(xiàn)在栽培牡丹的重要祖先之一，卵葉牡丹早春、花期葉正面紫紅、背面綠色，花色粉色或粉紅，花期早，是牡丹9個野生種質(zhì)中僅有的春色葉、雙面葉種質(zhì)，結(jié)實多，總脂肪酸含量高[1-4]，利用卵葉牡丹開展芍藥屬植物的種間雜交育種工作，是培育油用牡丹新品種，以及花期早、花色艷麗、春色葉的牡丹觀賞品種最具潛力的途徑之一。

花粉粒的小體積和耐干燥性特性特別適合貯存，是種質(zhì)資源保存的重要材料，雜交是牡丹培育新優(yōu)種質(zhì)的主要途徑之一，雜交特別是遠距離雜交及遠緣雜交，需要解決時空不遇，延長花粉壽命等問題[5-7]，以便與合適的母本進行雜交。雜交前對牡丹父本花粉進行貯存和對萌發(fā)率進行測定，有助于制定適宜的雜交組合方案，現(xiàn)有研究顯示，牡丹花粉自然壽命僅有5～10 d，遠遠不能滿足雜交的需求，篩選適合卵葉牡丹花粉貯存的適宜方案，是延長卵葉牡丹花粉壽命，解決雜交時空不遇問題的唯一途徑，此外，近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，由于溫度和水分的脅迫，花粉萌發(fā)率及壽命與花粉貯存期間活性氧的清除機制及膜脂過氧化水平有關(guān)，保護酶活性及丙二醛含量的高低可以反映花粉的健康程度，與花粉壽命及生活力具有相關(guān)性，是花粉萌發(fā)力的直接表現(xiàn)[5-9]。目前，有關(guān)卵葉牡丹的研究主要集中在分類學(xué)[2-3]、遺傳學(xué)[4]、起源[10]、孢粉學(xué)[11]、雜交[12]等方面，不同牡丹種質(zhì)花粉生活力測定適宜的培養(yǎng)基差異較大[13-18]，卵葉牡丹花粉萌發(fā)僅蓋偉玲等[17]對花粉適宜的蔗糖、硼酸濃度進行了單因素篩選，關(guān)于其萌發(fā)特性、貯存特性及貯存期間花粉生活力下降的生理機制方面的系統(tǒng)研究尚未見報道。為此，本研究以洛陽國家牡丹園收集的卵葉牡丹花粉為材料，探討了花粉萌發(fā)力檢測的適宜培養(yǎng)基，不同的貯存環(huán)境下的花粉壽命，并測定了貯存期間3種保護酶的活性及丙二醛的含量，以期確定卵葉牡丹花粉生活力檢測的最佳、最可靠的培養(yǎng)基配方，明確卵葉牡丹花粉經(jīng)濟、最佳的貯存溫度，探討卵葉花粉壽命與花粉保護酶活性、丙二醛的含量的相關(guān)性，解析卵葉牡丹花粉壽命在不同貯存環(huán)境下降低的生理機制，為牡丹雜交育種提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花粉收集、處理與貯存

1.1.1 花粉收集、處理

卵葉牡丹花粉采自洛陽國家牡丹園，預(yù)先選定生長健壯的植株，2018年4月中旬上午9:00～11:00，采集含苞待放的卵葉牡丹花苞，花柄下部在清水剪成斜口，然后迅速放入瓶中水培，帶回實驗室后置于(25±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，花朵開放后將花萼、花瓣剝?nèi)?，輕彈倒置的花朵，花粉從花藥中掉落或散出，用150目（孔徑為0.10 mm）過篩去除花藥等雜質(zhì)，收集備用。

1.1.2 花粉貯存

將新鮮花粉用45 ℃恒溫干燥箱脫水4 h（花粉含水率從14.8%降到7.8%）后，分成5份，每份20～30個2 mL離心管，每管加1～3粒變色硅膠，裝入1～1.5 g花粉，封口貯存，之后依次放到室溫（18～25 ℃）、2、-20、-80、-196 ℃（放入液氮罐中，定期添加液氮）下貯存。

1.2 花粉超微結(jié)構(gòu)觀察

將1.1.2所得烘干脫水花粉用2%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定1 h，75%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度脫水鍍金，二氧化碳臨界點干燥，鍍金后在日立SU-1510掃描電鏡下觀察、拍照，記錄花粉表面紋飾、大小。

1.3 卵葉牡丹花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基的篩選試驗

在矮牡丹花粉萌發(fā)研究的基礎(chǔ)上，選取對植物花粉萌發(fā)影響較大的硼酸、蔗糖、Ca(NO3)2、GA3作為試驗的4個因素，采用4因素3水平完全隨機正交試驗，共9個固體培養(yǎng)基處理，1個空白對照，濃度梯度見表1，試驗重復(fù)3次，確定4因素的最佳組合。培養(yǎng)基瓊脂添加量為5 g/L，pH值調(diào)至6.0。培養(yǎng)基加熱熬制待瓊脂完全融化后，分裝至培養(yǎng)皿，冷卻后將新鮮花粉均勻撒在培養(yǎng)基上，之后放入放有2層濕潤濾紙的大培養(yǎng)皿里，加蓋。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度保持在(25±1)℃、濕度80%～90%，18 h后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)情況，總計觀察花粉數(shù)大于300粒?；ǚ勖劝l(fā)率計算如下

花粉萌發(fā)率=花粉管長度大于花粉直徑的花粉數(shù)/觀察花粉數(shù)×100 %。

表1 試驗因素水平

1.4 不同貯存溫度對卵葉牡丹花粉萌發(fā)、丙二醛含量及3種保護酶活性的影響試驗

卵葉牡丹花粉貯存8、24、40、72、120、184、264、365 d后，分別從5個貯存環(huán)境中取出1只離心管（其中-20、-80 、-196 ℃取出的花粉在35℃下水浴5～10 min快速解凍），每離心管取出少許采用1.3所得最適培養(yǎng)基培養(yǎng)測定花粉萌發(fā)率，統(tǒng)計花粉貯存壽命（一批花粉萌發(fā)率降到新鮮花粉萌發(fā)率50%的時間，即花粉的半衰期），其余花粉用于保護酶活性和丙二醛含量檢測。

3種保護酶及丙二醛含量溶液的提取：準確稱取0.100 g卵葉牡丹花粉，放入4 ℃預(yù)冷玻璃研缽中，加入少許聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone，PVP）、石英砂，然后加入5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH值為7.0），勻速研磨30～40 s，之后將研磨混合液倒入離心管，8 000 g 4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測。

過氧化氫酶（Catalase，CAT）（可見光分光光度法）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量（硫代巴比妥酸法）、超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase，SOD）（氮藍四唑法）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）（愈創(chuàng)木酚法）采用北京索萊寶科技有限公司提供的試劑盒測定[19]。

數(shù)據(jù)用EXCEL 2003、DPS 6.5進行作圖、方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵葉牡丹植物形態(tài)及花粉表觀特征

卵葉牡丹株形婆娑，葉紫紅，花色艷麗（圖1a）。肉質(zhì)花盤亞組卵葉牡丹花粉粒為3個萌發(fā)溝，為孢粉學(xué)研究的原始類型，平均極軸長47.55m （38.15～53.07），平均赤道軸長22.65m（17.30～24.90m），P/E≈2.09（圖1b～1d），與何麗霞等[11]的研究結(jié)果不同，大于神農(nóng)架居群的39.84m×19.36m，與?？稻尤夯ǚ郏?7.02m×23.05m）相比，極軸更長，但赤道軸稍短，這表明卵葉牡丹不同居群間遺傳特性存在差異，要合理揭示其系統(tǒng)發(fā)育意義，仍需進行更全面更深人的研究。卵葉牡丹花粉形態(tài)觀為長橢圓形，面包狀，兩端逐漸收縮呈尖形或截形；花粉粒的3個萌發(fā)溝基本到達兩極，呈現(xiàn)兩極窄而淺，中間稍寬而深，有毛狀突出物，邊緣明顯增厚，極面觀為長橢圓形，少數(shù)花粉極面觀近圓形（圖 1d）。赤道外壁紋飾基本類型為粗網(wǎng)篩狀，網(wǎng)眼多為橢圓形、圓形、近圓形或不規(guī)則多邊形，網(wǎng)眼平均直徑為3～4.7m，大小網(wǎng)眼不規(guī)則分布，網(wǎng)眼較深（圖1e），網(wǎng)脊平滑，大于網(wǎng)眼直徑?；位ǚ坶L在10～40m之間，總體觀不飽滿、空癟，多為勺狀、條狀、三棱狀、不規(guī)則狀等，約占觀察花粉總數(shù)的19.50%（圖1b）。

2.2 不同培養(yǎng)基對卵葉牡丹花粉萌發(fā)的影響

蔗糖、硼酸、Ca2+是大多數(shù)植物花粉離體萌發(fā)測定常用的物質(zhì)，蔗糖能維持高滲透壓，為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)[14,16]，硼酸促進花粉對糖的吸收，促進花粉管壁的形成，提高萌發(fā)率[20-22]，而Ca2+在花粉管的脈沖式生長、花粉管的生長調(diào)節(jié)方面具有重要作用[9]。卵葉牡丹花粉萌發(fā)的正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果如表2、表3所示，卵葉牡丹花粉在空白培養(yǎng)基上也能萌發(fā)，但萌發(fā)率較低，僅為10.30%，這說明卵葉牡丹部分花粉內(nèi)貯存有少量的營養(yǎng)物質(zhì)。表2極差結(jié)果分析表明：正交設(shè)計中4個因素的（極差）值差異較大，其中蔗糖極差值最大，其他依次是硼酸，Ca(NO3)2和GA3，這表明4個因素中對卵葉牡丹花粉萌發(fā)影響最大的因子為蔗糖，其它主要影響因子依次為：硼酸，Ca(NO3)2和GA3。由表3值可知，蔗糖對卵葉牡丹花粉萌發(fā)率影響最大，其次為硼酸，均達極顯著水平，(Ca(NO3)2)=3.81大于0.05(2，18)=3.55，小于0.01(2，18)=6.01，說明Ca(NO3)2對卵葉牡丹花粉萌發(fā)率有顯著影響，而(GA3)=2.47小于0.10(2，18)=2.62，表明GA3對卵葉牡丹花粉萌發(fā)率無顯著影響，試驗中4個因素主次地位依次為：蔗糖，硼酸，Ca(NO3)2和GA3，與極差分析結(jié)果一致。蔗糖、硼酸不同水平間卵葉牡丹花粉萌發(fā)率差異顯著，蔗糖、硼酸濃度分別為110 g/L和45 mg/L時，花粉萌發(fā)率高，但蔗糖、硼酸濃度提高和下降，卵葉牡丹花粉萌發(fā)率均出現(xiàn)顯著下降，不同濃度間的差異達到極顯著水平；因素Ca(NO3)2中30 g/L水平顯著性高于50、70 mg/L，顯示卵葉牡丹花粉萌發(fā)需要的Ca2+濃度較低，因素GA3中，40 mg/L花粉萌發(fā)率高于其他2個水平?？紤]到蔗糖、硼酸、赤霉素和硝酸鈣4因素的互作作用，適宜卵葉牡丹花粉萌發(fā)最優(yōu)的培養(yǎng)基參數(shù)的水平組合為2231，即110 g/L蔗糖，45 mg/L硼酸，55 mg/L GA3，30 mg/L Ca(NO3)2，花粉萌發(fā)率最高，平均為73.20%，明顯高于其他組合。試驗中發(fā)現(xiàn)，在最佳培養(yǎng)基中，光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果顯示，卵葉牡丹花粉萌發(fā)率為73.2%，不萌發(fā)或者不符合萌發(fā)標準的花粉大多為畸形、癟粒、小粒，占比平均為19%左右，顯示花粉形態(tài)影響了花粉的萌發(fā)，這表明小粒、畸形、癟粒率高是卵葉牡丹花粉萌發(fā)率低的主要原因。

圖1 卵葉牡丹植株形態(tài)及其花粉表觀特征

表2 卵葉牡丹花粉萌發(fā)的正交試驗結(jié)果及極差分析

注：不同小寫字母分別表示在0.05水平上存在差異。

Note: Different lower case letters indicate differences at 0.05 levels.

表3 試驗結(jié)果方差分析表

注：“**”表示差異達到極顯著水平，“*”表示差異達到顯著水平。

Note: “**” indicate very significant difference at 0.01 level, “*” indicate significant difference at 0.05 level.

2.3 不同貯存溫度下花粉萌發(fā)率隨時間的變化

從圖2可以看出，貯存溫度對卵葉牡丹花粉萌發(fā)率影響極大。新鮮花粉的萌發(fā)率為72.60%，隨著貯存時間的延長，除-196 ℃貯存條件外，其他4個溫度下，花粉萌發(fā)率均呈現(xiàn)下降的趨勢，室溫條件下萌發(fā)率下降最快，花粉的半衰期僅為8 d，這可能是較高溫度下，呼吸作用及酶活性較強，消耗了大量營養(yǎng)，導(dǎo)致部分花粉很快喪失萌發(fā)力，貯存第40天，花粉萌發(fā)率降為0；2 ℃貯存，花粉半衰期出現(xiàn)在第72天，之后迅速下降，貯存第264天，萌發(fā)率僅為3%；-20 ℃貯存，萌發(fā)率前期下降緩慢，后期下降加速，花粉半衰期為184 d，-80 ℃貯存條件下，花粉萌發(fā)率隨著時間的延長呈緩慢下降的趨勢，曲線較為平緩，貯存第365天，花粉萌發(fā)仍達到58%，這表明花粉半衰期超過365 d。-196 ℃下花粉萌發(fā)率則成波動下降而后緩慢上升的趨勢，貯存第365天花粉萌發(fā)率高達75.5%，顯著高于新鮮花粉萌發(fā)率72.6%（圖2），這與李秉玲等[18]對日本牡丹品種‘日幕’和‘白王’的研究結(jié)果相似，花粉經(jīng)超低溫保存1～2 a后花粉萌發(fā)率有較大的提高。綜合來看，貯存溫度越低，卵葉牡丹花粉貯存壽命越長，-80 、-196 ℃適合卵葉牡丹花粉的中長期貯存，作為種質(zhì)資源保存最佳的貯存溫度為-196 ℃。

2.4 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉MDA含量隨時間的變化

從圖3可以看出，不同環(huán)境下隨著貯存時間的延長，丙二醛含量呈現(xiàn)不同的趨勢。室溫、2 ℃下，卵葉牡丹花粉丙二醛含量呈現(xiàn)先升高，而后迅速降低的趨勢，其中，室溫下貯存72 d，首先達到高峰，2 ℃下隨后在184 d出現(xiàn)高峰，結(jié)合圖2的分析可以看出，2個高峰均出現(xiàn)在花粉萌發(fā)率大幅下降后，這表明花粉受到傷害加劇導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化快速升高，而后又隨著多數(shù)花粉的死亡而迅速下降；-20 ℃下丙二醛含量呈現(xiàn)先緩慢后快速升高的趨勢，貯存第365天MDA達到最高，為貯存前的4.5倍，而-80 ℃則呈現(xiàn)波動緩慢升高的趨勢，貯存第365天，丙二醛含量為貯存前的1.92倍，顯示-20 ℃、-80 ℃下貯存1 a后，-80 ℃花粉細胞膜脂過氧化程度加劇程度較-20 ℃下重。-196 ℃下卵葉牡丹花粉MDA含量總體變化幅度較小，貯存365 d，MDA含量由貯存前的7.2mol/g升高到7.5mol/g，但僅提高了0.3mol/g，這表明在-196 ℃貯存下卵葉牡丹花粉細胞膜系統(tǒng)維持穩(wěn)定，并未造成嚴重的膜脂過氧化。

注：RT代表室溫，同一折線上的不同字母表示在0.05水平上差異顯著，花粉離體培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為110 g·L-1蔗糖，45 mg·L-1硼酸，55 mg·L-1 GA3，30 mg·L-1 Ca(NO3)2，下同。

圖3 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉丙二醛含量隨時間的變化

2.5 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉保護酶活性隨時間的變化

2.5.1 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉SOD活性隨時間的變化

圖4試驗結(jié)果顯示，室溫下，卵葉牡丹花粉SOD呈迅速下降的趨勢，這說明卵葉牡丹花粉超氧自由基不斷減少，導(dǎo)致保護能力快速下降，而低溫（-2 、-20 ℃）下，SOD隨時間延長呈現(xiàn)先快速升高后降低的趨勢，-2 ℃下在貯存第24天，花粉SOD活性最先達到高峰，表明此時花粉受低溫脅迫加劇，需要提高SOD活性減少活性氧、自由基對花粉的傷害，-20 ℃下SOD活性則在第72天達到最高，之后伴隨著花粉萌發(fā)率的下降而迅速下降，這表明此時脅迫加劇，SOD活性不足以清除過多的自由基而導(dǎo)致花粉萌發(fā)率顯著降低。-80 ℃、-196 ℃下，隨著時間的延長，均呈現(xiàn)總體緩慢波動上升的趨勢，變化幅度比較平緩，-80 ℃下，伴隨著花粉萌發(fā)率的緩慢降低SOD活性呈上升短暫下降后波動上升的趨勢，貯存360 d，SOD活性為240 U/g，達到貯存前的1.56倍，而-196 ℃貯存下SOD變化較小，貯存365 d僅為新鮮花粉的1.15倍，此時花粉萌發(fā)率較新鮮花粉無差異，這表明超低溫貯存，SOD活性保持較為持久，能有效清除過多的活性氧、自由基，花粉細胞處于生理代謝平衡狀態(tài)，所以花粉仍具有較高活性。

圖4 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉SOD活性隨時間的變化

2.5.2 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉POD活性隨時間的變化

低溫脅迫下，植物材料易出現(xiàn)活性氧、自由基種類及數(shù)量增加，造成代謝紊亂、膜脂過氧化，植物通常通過提高保護酶的活性，增加脯氨酸、抗壞血酸等物質(zhì)來清除過量的活性氧、自由基，以維持代謝平衡和膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而避免或減少損傷。POD是植物保護系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，可有效清除醛、酚、胺以及SOD的副產(chǎn)物H2O2。由圖5可以看出，5個貯存溫度下，卵葉牡丹花粉POD活性變化與SOD活性變化基本相似，僅室溫、-80 ℃下變化規(guī)律略有不同。室溫、2 ℃、-20 ℃、-80 ℃貯存下，卵葉牡丹花粉POD活性隨時間的增長，基本呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，室溫貯存至第8天時，POD活性升至135 U/g，達到原來的2.45倍，之后迅速下降，-2 ℃、-20 ℃、-80 ℃下，POD活性則分別出現(xiàn)在貯存后的第72、120、184天，伴隨著高峰的出現(xiàn)，4個貯存溫度下，花粉萌發(fā)率均出現(xiàn)顯著降低，其中2 ℃、-20 ℃下，POD出現(xiàn)高峰后迅速下降，而-80 ℃下，上升與下降速度都較為緩慢，變化不顯著，這表明與室溫、2 ℃、-20 ℃下相比，-80 ℃下，花粉受到的脅迫較小。-196 ℃貯存，過氧化物酶活性呈波動上升、下降、再上升的趨勢，最高峰分別出現(xiàn)第120天，此時POD活性為原來的1.11倍，之后POD活性開始下降，貯存第365天，POD活性為59.64 U/g，是貯存前花粉的1.08倍，這表明卵葉牡丹花粉貯存1 a后，仍然具有較強清除H2O2、苯、醛和胺等有害物質(zhì)的能力，進而保護花粉減少低溫傷害，保持較高的花粉萌發(fā)力。

圖5 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉POD活性隨時間的變化

2.5.3 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉CAT活性隨時間的變化

CAT等抗氧化酶可清除H2O2及有害自由基，對防御活性氧、自由基毒害具有重要作用。圖6表明，隨著貯存時間的延長，室溫、2 ℃下，CAT活性呈現(xiàn)先升高而后迅速下降的趨勢，其中室溫下在第24天出現(xiàn)峰值，2 ℃下則在第72天出現(xiàn)峰值，室溫下變化幅度較-2 ℃下劇烈，二者差異顯著。-20 ℃下，則呈現(xiàn)先緩慢降低后緩慢升高，再迅速下降的趨勢，這表明-20 ℃下后期花粉萌發(fā)率的下降與CAT活性降低，清除活性氧的能力下降有關(guān)。-80 ℃，卵葉牡丹花粉的CAT活性呈現(xiàn)先緩慢降低再緩慢升高而后又下降的曲線，但整體變化幅度較小，最高變化幅度僅為1.34倍，這說明相比2 、-20 ℃下花粉受到的傷害較??；-196 ℃貯存卵葉牡丹花粉的CAT活性呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢，總體上起伏較小，最高值出現(xiàn)在第365天，為125 mg/g，達到貯存前花粉CAT的1.12倍，顯示卵葉牡丹花粉保護機制處于健康狀態(tài)，仍然具有較強的H2O2清除能力，能夠有效減輕花粉受到的脅迫傷害，保持花粉較高的萌發(fā)力。

圖6 不同貯存溫度下卵葉牡丹花粉CAT活性隨時間的變化

2.6 卵葉牡丹花粉萌發(fā)率與MDA含量、3種保護酶活性的關(guān)系分析

從表2相關(guān)分析可以看出，卵葉牡丹花粉萌發(fā)率與丙二醛含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系，花粉萌發(fā)率與3種保護酶（過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性）呈顯著正相關(guān)（<0.01），說明在卵葉牡丹花粉的貯存過程中，3種保護酶活性對花粉萌發(fā)率起著主導(dǎo)作用，從影響花粉萌發(fā)率的程度來看，順序依次為：超氧化物歧化酶活性，過氧化氫酶活性，過氧化物酶活性。

表4 花粉萌發(fā)率與MDA 含量、3種保護酶活性的相關(guān)分析表

注：*表示在0.05水平上顯著的相關(guān)性；**表示在0.01水平上顯著的相關(guān)性。

Note: * and ** mean significantly correlation at 0.05, and 0.01 level, respectively.

3 討 論

3.1 不同培養(yǎng)基對卵葉牡丹花粉萌發(fā)率的影響

現(xiàn)有的研究表明不同的牡丹種質(zhì)花粉萌發(fā)對蔗糖、硼酸的需求差異較大，黃牡丹[13]、牡丹‘鳳丹白’等（150 g/L蔗糖及60～80 mg/L硼酸）[16]，矮牡丹（90 g/L蔗糖及45 mg/L硼酸）[14]，日本牡丹（50 g/L及1 000 mg/L硼酸）[18]，滇牡丹（50 g/L蔗糖）[23]，因此探討卵葉牡丹花粉萌發(fā)力測定的適宜培養(yǎng)基對于后續(xù)的雜交育種等工作的開展具有重要意義。本試驗結(jié)果顯示，蔗糖、硼酸對卵葉牡丹花粉萌發(fā)影響極顯著，Ca2+對花粉萌發(fā)影響顯著，而GA3則對花粉萌發(fā)率影響不顯著，這表明蔗糖、硼酸、Ca2+是影響卵葉牡丹花粉萌發(fā)的主要因素，GA3雖對部分植物花粉萌發(fā)有促進作用[24]，但對卵葉牡丹花粉萌發(fā)無顯著作用。綜合來看，卵葉牡丹花粉萌發(fā)最佳的培養(yǎng)基為：110 g/L蔗糖，45 mg/L硼酸，50 mg/L Ca(NO3)2，蔗糖需求方面，低于黃牡丹、牡丹‘鳳丹白’，但高于滇牡丹、矮牡丹等野生種質(zhì)，硼酸需求較其他牡丹種質(zhì)低，這表明不同牡丹種質(zhì)花粉對硼酸、蔗糖的適應(yīng)性不同，這些萌發(fā)特性的差異可能是基因型不同造成的。

3.2 不同貯存溫度卵葉牡丹花粉萌發(fā)率隨時間的變化

低溫貯存是生物材料長期保存最有前途的方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物、水果、蔬菜和觀賞植物[25-29]?；ǚ垠w積小占用空間少，使花粉粒特別適合貯存，作為基因庫的重要組成部分，適宜花粉貯存庫建立可以持續(xù)為育種計劃提供有活力和可育的稀缺植物花粉，滿足育種的需求[29]。牡丹花粉自然情況下的壽命僅10 d左右，常規(guī)的4 ℃貯存僅能延長花粉壽命1～2個月[14-15,18]，很難滿足牡丹種質(zhì)貯存、遠緣雜交、隔年雜交的需要，因此探討牡丹花粉不同貯存條件下的壽命，對于根據(jù)需要選擇合適的、經(jīng)濟的貯存方法貯存牡丹花粉具有重要意義。研究表明，美洲山核桃花粉貯存13 a，與新鮮花粉萌發(fā)率統(tǒng)計學(xué)差異不明顯[30]，超低溫貯存2 a的日本牡丹花粉，仍具有較高的萌發(fā)率，個別品種甚至超過新鮮花粉的萌發(fā)率[18]，本研究結(jié)果也表明，與室溫、2 ℃、-20 ℃貯存環(huán)境下牡丹花粉萌發(fā)率隨貯存時間延長快速下降相比，-80 ℃、-196 ℃下，卵葉牡丹花粉仍保持較高的萌發(fā)率，適合花粉的中、長期貯存，特別是-196 ℃貯存1 a后，花粉萌發(fā)率高達75.5%，比新鮮花粉萌發(fā)率提高了2.9%，這表明-196 ℃下卵葉牡丹花粉貯存1 a后，花粉細胞處于生理代謝平衡的健康狀態(tài)，仍保持較高的萌發(fā)力，適合作為牡丹花粉種質(zhì)資源的長期保存，這為克服牡丹遠緣雜交、遠距離雜交的時空障礙，也為卵葉牡丹的種質(zhì)長期保存奠定了基礎(chǔ)。

3.3 不同貯存溫度下花粉萌發(fā)率與丙二醛含量的關(guān)系

MDA是膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，含量高低代表質(zhì)膜透性的強度，與細胞是否受到傷害密切相關(guān)性[19，31]。植物材料不同，貯存溫度的高低對細胞膜系統(tǒng)影響不同，保存效果有較大差異，牡丹‘鳳丹白’花粉[31]、桃葉衛(wèi)矛[26]超低溫保存后丙二醛與新鮮材料基本一致，貯存后的花粉、種子仍然保持較高的萌發(fā)力，而留蘭香[27]、牡丹‘八千代椿’花粉[31]經(jīng)超低溫處理后與對照組相比丙二醛（MDA）含量顯著升高，貯存后的牡丹‘八千代椿’花粉萌發(fā)力、留蘭香再生能力均出現(xiàn)下降。本試驗也證實了這一點，隨貯存時間延長，室溫、4 ℃貯存條件下，卵葉牡丹花粉MDA含量呈先升高而后迅速降低的趨勢，伴隨著高峰的出現(xiàn)，花粉萌發(fā)率迅速下降，-20 ℃、-80 ℃下，呈逐漸上升的趨勢，其中-20 ℃下，上升趨勢顯著，伴隨著花粉萌發(fā)率的逐漸下降，而-196 ℃下MDA含量比較平穩(wěn)，萌發(fā)率基本無變化或有部分提高。這表明花粉細胞膜在-196 ℃貯存下膜脂過氧化程度低，膜系統(tǒng)穩(wěn)定，貯存1 a后，花粉細胞內(nèi)SOD、CAT和POD仍具有較高的活性，協(xié)同作用有效的清除了多余的活性氧、自由基，保持了氧化平衡狀態(tài)，這可能是卵葉牡丹花粉萌發(fā)率仍然很高的原因。

3.4 不同貯存溫度下花粉萌發(fā)率與3種保護酶活性的關(guān)系

研究表明，保護酶活性一定程度上是生物體機能維持的重要指標[32-39]，低含水量、低溫、低氧可以降低植物的代謝活動，減少營養(yǎng)消耗，是延長保存時間的有效途徑[18,25-30]，植物花粉在保存期間，在環(huán)境脅迫下，代謝紊亂，活性氧、自由基顯著增加，植物通常通過增加保護酶的活性來清除過量的活性氧，以維持代謝平衡和膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而避免或減少損傷[36-40]，因此保護酶活性的穩(wěn)定性與保存質(zhì)量具有相關(guān)性，保護酶的大幅升高與降低，可能預(yù)示保存材料萌發(fā)率的下降[6-8,30]。本研究結(jié)果表明，室溫下8～24 d，POD、CAT先后出現(xiàn)最高峰值，2 ℃下24～72 d，SOD、POD、CAT先后出現(xiàn)最高峰值，-20 ℃下72～120 d，SOD、POD、CAT先后出現(xiàn)最高峰值，然后下降，-80 ℃下184～264 d，POD、CAT先后出現(xiàn)最高峰值，在此期間，卵葉牡丹花粉萌發(fā)率均出現(xiàn)了顯著下降，這表明在花粉萌發(fā)率下降最快期間，花粉細胞膜質(zhì)過氧化加劇，活性氧、自由基增多，3種保護酶先后啟動，協(xié)同花粉內(nèi)抗壞血酸等物質(zhì)清除活性氧、自由基、醛、酚等有害物質(zhì)，減少損害，但隨著時間延長、脅迫加劇，3種保護酶活性及體內(nèi)抗壞血酸、脯氨酸等不足以消除花粉細胞內(nèi)的活性氧，導(dǎo)致有害物質(zhì)積累，花粉細胞死亡，花粉萌發(fā)率隨之降低。而在-196 ℃下，卵葉牡丹花粉在貯存1 a的不同時間階段，3種保護酶活性均保持平穩(wěn)，花粉萌發(fā)率接近或超過新鮮花粉萌發(fā)率，這說明-196 ℃下，卵葉牡丹花粉處于代謝平衡狀態(tài)，健康程度高，因此花粉仍然具有較高的萌發(fā)力。隨著貯存時間的延長，室溫下卵葉牡丹花粉POD活性最先達到高峰值，CAT隨后達到高峰值，然后下降，SOD活性則迅速下降，說明室溫下POD是敏感保護酶；2 ℃、-20 ℃、-80 ℃下，SOD活性首先升高，分別在第24、72、40天達到高峰值，隨后下降，而POD、CAT活性則在貯存72～264 d才陸續(xù)出現(xiàn)高峰，這表明2 ℃、-20 ℃、-80 ℃下，SOD為敏感性保護酶。

花粉低溫保存可以有效地實現(xiàn)單倍體階段的基因組保存，為核遺傳多樣性提供了豐富的來源[29,40]，大部分植物花粉在貯存后花粉萌發(fā)率下降，但一部分物種花粉超低溫（-196 ℃）貯存后，出現(xiàn)萌發(fā)率升高或明顯升高的“冷刺激”的現(xiàn)象，如矮牡丹[14]、山龍眼屬[14]、日本牡丹品種‘日幕’、‘白王’、阿月渾子[18]、芍藥[35]花粉等，本試驗也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，-196 ℃超低溫貯存1 a后，卵葉牡丹花粉萌發(fā)率高達75.5%，較新鮮花粉有較大提高，這表明在超低溫貯存下，卵葉牡丹花粉生命代謝并非處于理論上的“停滯”狀態(tài)，張亞利[25]研究也發(fā)現(xiàn)，超低溫保存后，伴隨著梅花萌發(fā)率的提高，花粉內(nèi)Ca2+濃度較新鮮花粉顯著增加，貯存前后存在差異蛋白，本試驗結(jié)果表明，伴隨著萌發(fā)率的升高，花粉SOD、POD、CAT活性有不同程度的提高，而丙二醛含量卻出現(xiàn)下降，花粉膜系統(tǒng)穩(wěn)定，生命代謝系統(tǒng)處于平衡的健康狀態(tài)，能有效清除過多的自由基、活性氧，牡丹‘島大臣’也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[31]，這是否是卵葉牡丹花粉超低溫貯存出現(xiàn)“冷刺激”現(xiàn)象的生理機制，需要進一步研究探討。

4 結(jié) 論

卵葉牡丹花粉不同居群間遺傳特性存在差異，單純以花粉表觀不足以揭示其系統(tǒng)演化規(guī)律；花粉小粒、畸形和癟粒率高是卵葉牡丹花粉萌發(fā)率低的主要原因。卵葉牡丹花粉離體培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)基為：110 g/L蔗糖，45 mg/L硼酸，55 mg/L GA3，30 mg/L Ca(NO3)2。蔗糖是影響卵葉牡丹花粉萌發(fā)率最大的因子，其次是硼酸、Ca(NO3)2、GA3等。

不同溫度貯存下，卵葉牡丹花粉3種保護酶的作用不同，SOD在2 、-20 和-80 ℃時是敏感的保護酶，而在室溫下，POD是敏感的保護酶，花粉萌發(fā)率與3種保護酶活性呈顯著正相關(guān)，與丙二醛含量呈顯著負相關(guān)，3種保護酶活性對花粉萌發(fā)率的影響次序為：SOD，CAT，POD。卵葉牡丹花粉在貯存期間，3種保護酶活性、丙二醛含量保持穩(wěn)定，細胞處于代謝平衡狀態(tài)，健康程度高，是-196 ℃下貯存1 a后卵葉牡丹花粉仍然保持較高萌發(fā)力的生理原因；貯存期間環(huán)境脅迫加劇，花粉3種保護酶先后升高，達到高峰值后快速下降，丙二醛含量快速增高，膜脂過氧化程度加劇，不能有效清除活性氧、自由基，生理代謝失衡，是室溫、2 、-20 ℃下花粉貯存壽命縮短的內(nèi)因之一。

貯存溫度是影響卵葉牡丹花粉貯存壽命的關(guān)鍵因子之一，且貯存溫度越低，卵葉牡丹花粉的貯存壽命越長。2 、-20 ℃下，花粉貯存壽命分別為2～3個月、5～6個月，綜合經(jīng)濟、適用考慮，家用冰箱即可滿足卵葉牡丹花粉短期貯存的需求；-80 ℃下花粉貯存壽命超過1 a，適宜卵葉牡丹花粉的中期貯存；卵葉牡丹花粉最佳的貯存溫度為-196 ℃，適宜卵葉牡丹花粉種質(zhì)資源的長期保存。

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Effects of storage conditions on pollen longevity of

Jia Wenqing1,2, Guo Yingzi1,2, Wang Yanli1, Zhu Xiaopei1, Wang Zheng2, Liu Gaixiu3, Liu Huichao1, He Songlin1※, Zhang Xiangyu1

(1.,,453003,; 2.,450002,; 3.,471000,)

is one of the important ancestors of cultivated species of tree peony, serving as an important genetic resource in peony cross breeding, due to its purple-red leaves. The pollen is widely known to directly influence reproductive success and genetic structure of the main plant population. This study aims to investigate the storage characteristics ofpollen, further to elucidate the physiological mechanism of pollen storage at different temperatures, in order to determine the accurate and efficient storage method for the viability ofpollen. In this study, the pollen morphology ofwas characterized using scanning electron microscopes. Four factors (sucrose, boric acid, Ca (NO3)2, GA3) at three different levels were selected in the orthogonal test to investigate the characteristics ofin vitro germination. The experiment was conducted to explore the effect of storage temperatures and duration on the pollen germination rate, malondialdehyde (MDA), and the activity of superoxide dismutase (SOD), peroxidase(POD), catalase (CAT). The results show that the rates of abnormal and shrunken pollen were as high as 19.5%, indicating the low viability ofpollen. The important factors affecting the germination rate ofpollen were listed in order, sucrose, boric acid, Ca (NO3)2, GA3. The optimum concentrations of media were achieved in vitro pollen germination, when containing 110 g/Lsucrose, 45 mg/Lboric acid, 55 mg/L GA3, 30 mg/L Ca(NO3)2. The optimum temperatures were 2℃ and -20℃for the pollen storage of 1-2 months and 4-6 months, respectively. The optimum condition was -80℃ for the intermediate storage within one year, whereas the promising temperature was -196℃for the long-term preservation ofpollen. The germination rate was 75.5% after 365 days of storage, indicating that the optimum condition can effectively prolong pollen longevity. The germination rate of pollen was positively correlated with three protective enzymes, while negatively correlated with malondialdehyde content. The influence of three protective enzymes on pollen germination rate was ranked in order: superoxide dismutase (SOD) , catalase (CAT), peroxidase (POD). The sensitivity of three protective enzymes was different at different storage temperatures. Specifically, SOD served as a sensitive protective enzyme at 2, -20℃ and -80℃, whereas POD served as sensitive protective enzymes at room temperature. The protective enzyme activity decreased, while the malondialdehyde content increased, leading to the active oxygen can not be effectively removed. This process was one of the main reasons for the decrease in pollen viability after storage at room temperature, 2, -20 and -80℃. The malondialdehyde content and the activity of three protective enzymes in pollen remained basically stable. The three protective enzymes can effectively maintain the internal balance of oxidative metabolism, and thereby reduce the levels of oxidative damage. This can be the internal cause to keep high germination rate after cryopreservation. This finding can provide a promising experimental and theoretical basis for cross-temporal pollination hybridization and germplasm resource conservation.

storage; low temperature; enzymes;; pollen grain morphology; germination; MDA

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Jia Wenqing, Guo Yingzi, Wang Yanli, et al. Effects of storage conditions on pollen longevity of[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(14): 307-315. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.14.037 http://www.tcsae.org

2020-03-24

2020-07-03

國家重點研發(fā)計劃支持課題 (2018YFD1000401)；河南省科技發(fā)展計劃項目（202102110082）；國家自然科學(xué)基金（C161201）

賈文慶，博士，副教授，主要從事觀賞植物資源創(chuàng)新與利用研究。Email：jiawq2012@126.com

何松林，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事觀賞植物栽培生理及生物技術(shù)研究。Email：hsl213@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.14.037

S685.11

A

1002-6819(2020)-14-0307-09