王 晶，樊亞東，王立新，王 麗*

（1.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

抗纖丸是天津市第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，由血府逐瘀湯加減化裁而來，具有活血化瘀和扶正祛邪之功，臨床用于治療慢性活動(dòng)性肝炎、肝纖維化及肝硬化已近50年。自上世紀(jì)90年代開始，課題組經(jīng)過多年的藥理和臨床研究證實(shí)［1，2］，抗纖丸具有減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子、降解各型膠原基質(zhì)等多種抗肝纖維化的作用，藥用價(jià)值和安全性較為肯定。

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累，纖維性瘢痕形成的病理過程。早期肝纖維化經(jīng)過及時(shí)干預(yù)治療，可減緩或防止進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌［3］。目前大量研究表明：相較于化學(xué)藥物，中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、

多層次的藥理作用優(yōu)勢(shì)，能夠整體系統(tǒng)地抑制肝纖維化的進(jìn)展［4］。中藥復(fù)方抗纖丸成分復(fù)雜，針對(duì)其治療肝纖維化的活性成分、作用靶點(diǎn)和作用途徑仍不明確，尚待深入。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和多向藥理學(xué)，尤其適合揭示中醫(yī)藥的復(fù)雜作用機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探索和闡述抗纖丸治療肝纖維化的藥理學(xué)機(jī)制，為其在臨床的使用提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫和分析軟件 中藥分子作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)分析工具（Batman-TCM）（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/） 數(shù)據(jù)庫；OMIM 疾病數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org）；Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://www.Drugbank.ca/）；Uniport數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）；網(wǎng)絡(luò)圖像可視化軟件Cytosca pe3.4.0軟件（https://cytoscape.org/）;Metascape網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái)（metascape.org/gp/index）；BioGPS數(shù)據(jù)庫（http://biogps.org/）；Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）。

1.2 方法

1.2.1 抗纖丸化學(xué)成分與靶點(diǎn)挖掘 通過Batman-TCM數(shù)據(jù)庫挖掘抗纖丸（當(dāng)歸、川芎、赤芍、鱉甲、川楝子、黃芩、太子參、白花蛇舌草、黃芪、五味子、冬蟲夏草和甘草）單味中藥的化學(xué)成分。設(shè)置化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的閾值（score cutoff＞20）篩選抗纖丸單味藥的潛在蛋白靶點(diǎn)。

1.2.2 肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以“hepatic fibrosis”和“l(fā)iver fibrosis”為檢索詞，分別通過OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫獲取肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。使用Uniport數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，對(duì)蛋白進(jìn)行名稱規(guī)范轉(zhuǎn)化操作。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將“1.2.1”和“1.2.2”項(xiàng)中得到的靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，篩選重復(fù)靶點(diǎn)，并導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。選取分值＞0.9分的高置信度區(qū)間，并根據(jù)自由度值（一個(gè)節(jié)點(diǎn)在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中與該點(diǎn)直接作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，自由度越大則其參與的生物功能越多）篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.4 抗纖丸中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將抗纖丸單味藥、化合物成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件繪制中藥-成分、成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。采用Merge功能最終建立中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 基因功能與通路分析 為進(jìn)一步研究抗纖丸治療肝纖維化的作用情況，使用Metascape平臺(tái)對(duì)肝纖維化和抗纖丸相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行總體分析。將抗纖丸治療肝纖維化的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析和GO生物過程富集分析。同時(shí)將關(guān)鍵作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BioGPS和Genecards數(shù)據(jù)庫中獲得組織分布和亞細(xì)胞分布相關(guān)信息，并作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 抗纖丸作用化合物及靶點(diǎn) 檢索數(shù)據(jù)庫得到抗纖丸化合物及相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)，見表1。刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，獲得抗纖丸作用化合物共577個(gè)，涉及相關(guān)作用靶點(diǎn)1 788個(gè)。

2.2 肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn) 在OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫中分別找到肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)536和297個(gè)，去除重復(fù)基因，共得到632個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將抗纖丸作用靶點(diǎn)與肝纖維化靶點(diǎn)進(jìn)行比較，查找抗纖丸治療疾病的作用靶點(diǎn)共計(jì)194個(gè)。為篩選出關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，將194個(gè)蛋白導(dǎo)入SERING平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化，見圖1。根據(jù)自由度篩選得到55個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，見表2。

表1 抗纖丸化合物成分和靶點(diǎn)情況

表2 55個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)自由度

圖1 抗纖丸作用靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系

2.4 構(gòu)建抗纖丸中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將抗纖丸12味中藥、涉及的213個(gè)化合物成分和55個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制中藥-成分、成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。采用Merge功能合并網(wǎng)絡(luò)，對(duì)單味中藥、成分和靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)識(shí)。如圖2所示，共涉及280個(gè)節(jié)點(diǎn)和564條邊。節(jié)點(diǎn)表示單味中藥、成分和疾病靶點(diǎn)，邊表示三者彼此間的關(guān)聯(lián)。其中六邊形節(jié)點(diǎn)表示單味中藥，三角形節(jié)點(diǎn)表示化合物成分，圓形節(jié)點(diǎn)表示關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 抗纖丸中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 基因功能與通路分析 將1 788個(gè)抗纖丸治療相關(guān)靶點(diǎn)和632個(gè)肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Metascape平臺(tái)，使用最新版本數(shù)據(jù)庫（最后更新時(shí)間為2019-09-14）轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的H.sapiens種類的基因。外圈大半圓為抗纖丸治療相關(guān)靶點(diǎn)，外圈小半圓為肝纖維化靶點(diǎn)。內(nèi)圈用深色的連線將兩者重疊的基因進(jìn)行連接，并用內(nèi)圈深色部分標(biāo)識(shí)，淺色曲線連接屬于同一豐富本體術(shù)語的基因，見圖3。使用KEGG pathway、GO Biological Processes、Reactome gene Sets、Canonical Pathways、CORUM對(duì)55個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。對(duì)排名前20名的通路途徑進(jìn)行展示，“靶點(diǎn)數(shù)”表示提供的列表中具有參與特定通路的基因數(shù)量；P值由累積超幾何分布計(jì)算而得，P值越小，表示這個(gè)通路中富集的差異基因越多，“Log10（P）”是log以10為底的值?！癓og10（q）”是log以10為底的多測(cè)試調(diào)整后的P值，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示:抗纖丸治療肝纖維化可能與活性氧代謝過程調(diào)控、炎癥反應(yīng)調(diào)控、轉(zhuǎn)移酶活性正調(diào)控、脂質(zhì)代謝過程調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控和膠質(zhì)細(xì)胞再生等密切相關(guān)。

圖3 抗纖丸和肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)重疊概況

表3 抗纖丸治療肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)富集通路

2.6 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)組織分布和亞細(xì)胞分布 將55個(gè)抗纖丸治療肝纖維化的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入BioGPS數(shù)據(jù)庫，獲得其組織分布信息。為保證結(jié)果的可靠性，值保留每個(gè)基因表達(dá)量較高的前5位組織，將組織分布信息導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建組織-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4-A。其中菱形節(jié)點(diǎn)表示組織，節(jié)點(diǎn)表示度值大小，V型節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，關(guān)鍵作用靶點(diǎn)主要分布于肝臟（liver，度值=33）、心肌細(xì)胞（cardiac myocytes,度值=18）、心臟（heart，度值=16）、全血（whole blood，度值=13）、CD56+自然殺傷細(xì)胞和胚胎肝（CD56+NK cells、fetal liver，度值=12）、CD33+髓細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、平滑肌、CD34+細(xì)胞 （CD33+myeloid、CD14+monocytes、smooth muscle、CD34+，度值=10）、脂肪組織（adipocyte，度值=8）。此外，眾多免疫細(xì)胞和免疫器官如：BDCA4+樹突細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、721 B淋巴細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞也在治療中發(fā)揮一定作用。這些結(jié)果能夠?yàn)榭估w丸治療作用的藥理學(xué)分子研究提供指導(dǎo)。將上述55個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Genecards數(shù)據(jù)庫，獲取和保留confidence大于5的各靶點(diǎn)亞細(xì)胞分布信息。采用Cytoscape軟件構(gòu)建亞細(xì)胞-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4-B。其中圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，三角形節(jié)點(diǎn)代表亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，靶點(diǎn)更多分布于細(xì)胞膜（plasma membrane，度值=29）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular，度值=27）、細(xì)胞核（nucleus，度值=20）、細(xì)胞基質(zhì)（cytosol，度值=15）。此外，結(jié)果也提示高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核內(nèi)體、細(xì)胞骨架、線粒體以及溶酶體可能為藥物作用的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖4 抗纖丸關(guān)鍵作用靶點(diǎn)組織分布（A）關(guān)鍵作用靶點(diǎn)亞細(xì)胞分布（B）圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)無肝纖維化病名記載，根據(jù)其病理變化和臨床表現(xiàn)，可歸屬于“脅痛”、“積聚”范疇。基本病機(jī)為正虛邪盛，邪毒久積，氣滯血瘀，肝絡(luò)受損，依據(jù)病患體質(zhì)可出現(xiàn)不同臨床表現(xiàn)。肝纖維化本質(zhì)是“虛損生積”，肝臟性質(zhì)損傷，陰精虧損，無以化氣，導(dǎo)致氣血不行，血凝成積［5，6］。根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論，抗纖丸方中當(dāng)歸、川芎、赤芍活血化瘀，鱉甲滋陰軟堅(jiān)共為君；黃芪扶正益氣，冬蟲夏草益肺腎補(bǔ)精髓，五味子收斂固澀益氣生津，太子參健脾生津四者共為臣；川楝子疏肝通絡(luò)為佐；黃芩、白花蛇舌草清熱解毒，甘草調(diào)和諸藥為使；十二味中藥調(diào)理肝脾腎三臟，活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)以達(dá)益氣扶正祛邪之功效。

活化的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell,HSC）是生成纖維組織的關(guān)鍵細(xì)胞，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。不同病因刺激造成肝臟慢性損傷,肝細(xì)胞凋亡、壞死或壞死性凋亡,導(dǎo)致肝臟炎癥。肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和淋巴細(xì)胞可通過釋放細(xì)胞內(nèi)容物、細(xì)胞因子和活性氧簇等，刺激靜止的肝星狀細(xì)胞活化，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度增生與沉積，形成肝竇和纖維間隔的毛細(xì)血管化，并伴有間隔內(nèi)的血管增生，最終發(fā)生肝纖維化［7］。目前治療肝纖維化的主要策略主要有：治療原發(fā)病、改善肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷與凋亡、調(diào)節(jié)ECM合成與降解、干細(xì)胞移植和基因治療等［8］。

網(wǎng)絡(luò)分析顯示：抗纖丸可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激（GO:2000377）、肝臟炎癥反應(yīng)（GO:0040017、GO：0050900、GO：0050727、GO：0001816、GO:0045785）、脂質(zhì)代謝（GO：0062012、GO：0019216、GO:1905952、GO：0048660、GO：0042063）發(fā)揮治療肝纖維化的作用。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明［3］，氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生活性氧ROS介導(dǎo)纖維化進(jìn)展。DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化破壞誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死及凋亡，放大炎癥反應(yīng)，促使纖維化發(fā)生。肝臟的慢性炎癥包括：白細(xì)胞的浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞的活化等，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的壞死和凋亡，壞死的肝細(xì)胞刺激Kupffer細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，直接啟動(dòng)HSC的激活［9］。而HSC的激活又可促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，形成炎癥和纖維化之間的惡性循環(huán)，促進(jìn)纖維化進(jìn)展［10］。川芎的主要活性成分川芎嗪可抑制HSC增殖，促進(jìn)其凋亡，通過參與Hedgehog通路發(fā)揮抗纖維化作用［11］。此外川芎嗪還可通過NLRP3炎癥小體途徑減輕炎癥，抑制HSC中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)［12，13］。鱉甲提取物可通過TGF-β1/Smad NF-κB信號(hào)通路抑制 HSC 激活［14］。

脂肪細(xì)胞因子由脂肪組織分泌，其中瘦素是循環(huán)脂肪形成激素，具有促進(jìn)纖維發(fā)生的作用。而脂聯(lián)素作為血漿中最豐富的脂肪因子，其表達(dá)與AMPK和PPARγ調(diào)控有關(guān)，對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用［3］。五味子提取物聯(lián)苯雙酯可調(diào)控HSC中PPARγ表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡［15］。脂聯(lián)素可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的活化，進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化的作用。當(dāng)歸、川芎等藥材的水溶性提取物阿魏酸鈉可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶，抑制膠原分泌，控制肝纖維化發(fā)展［16］。

中藥黃芩中的黃酮類化合物黃芩苷可抑制脂類代謝、炎癥和纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮抗纖維化的作用［17］。

抗纖丸治療的關(guān)鍵組織靶點(diǎn)多分布于肝臟（胚胎肝）、心臟（心肌細(xì)胞）、血液、平滑肌、脂肪組織以及相關(guān)免疫細(xì)胞，包括CD56+自然殺傷細(xì)胞、CD33+髓細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、BDCA4+樹突細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、721 B淋巴細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞等。這些結(jié)果與抗纖丸可能發(fā)揮抗炎、改善血液循環(huán)、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等生物學(xué)功能的基礎(chǔ)相符。亞細(xì)胞分布研究表明55個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)傾向分布于細(xì)胞膜上，其中高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核內(nèi)體、細(xì)胞骨架、線粒體以及溶酶體可能為藥物作用的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這些組織分布和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的梳理研究，為抗纖丸治療肝纖維化的藥理學(xué)分子研究提供指導(dǎo)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示抗纖丸治療肝纖維化的多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜機(jī)制。結(jié)果顯示抗纖丸可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激、肝臟炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝，發(fā)揮重要的治療作用。拓寬了抗纖丸在治療肝纖維化方面的視角，也為中藥復(fù)方治療肝纖維化提供了機(jī)制研究方面的思路。