郝桂明，王玉霞，王 衛(wèi)，唐素芳

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

匹多莫德（pidotimod）是一種化學合成的免疫調(diào)節(jié)劑，結構類似于二肽，是一種具有口服生物活性的免疫促進劑，具有抗病毒、抗感染、抗氧化性及抗刺激性等特點，既能促進特異性免疫反應，又能促進非特異性反應，從而發(fā)揮顯著的抗菌和抗病毒作用［1］。臨床上主要用于免疫功能低下患者急慢性感染和反復發(fā)作感染的治療，如用于反復呼吸道感染、耳鼻喉感染的治療等，同時也可作為急性感染時抗菌藥物治療的輔助用藥［2］。匹多莫德目前在國內(nèi)外藥典中均未收載，在新藥轉正標準[3]中也未對其特異性雜質(zhì)進行測定的方法。筆者采用HPLC加校正因子的主成分自身對照法對匹多莫德原料藥中的4種有關物質(zhì)同時進行測定，可有效地檢測其特定雜質(zhì)（基本信息見表1），方法靈敏、準確，結果可靠。

表1 匹多莫德原料藥有關物質(zhì)基本信息

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括二極管陣列紫外檢測器、Open-lab CDS色譜工作站；METTLER XS205電子天平；Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。

1.2 試藥劑 匹多莫德原料（批號Z140907、Z140908、Z150102）；L-噻唑烷-4-羧酸對照品由EUTICAL S.p.A公司提供（批號 08/0701，純度：99.5%）；L-焦谷氨酸對照品由EUTICAL S.p.A公司提供（批號1371943，純度：100.1%）；雜質(zhì)Ⅰ對照品由TorontoResearch Chemicals公司提供（批號4-YKZ-93-1，純度：98%）；雜質(zhì)Ⅱ對照品由Toronto Research Chemicals公司提供（批號1-AJK-66-1，純度：98%）；匹多莫德為中檢院對照品（批號100588-201402，純度：99.9%）。甲醇和異丙醇均為色譜純（天津市康科德科技有限公司），磷酸二氫鈉為分析純（阿拉丁化學試劑），水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Agilent 1260高效液相色譜儀，Kromasil 100-5-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH值至 2.50 ± 0.05）-甲醇-異丙醇（97∶2∶1），流速為1.0 ml/min；檢測波長為 210 nm，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱取匹多莫德原料25 mg，置50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ和匹多莫德對照品各10 mg，置20 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 雜質(zhì)對照品溶液 精密稱取L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ對照品各10 mg，分別置同一100 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密稱取L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ對照品各10 mg，分別置同一20 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對照品貯備液。精密稱取匹多莫德原料藥50 mg，置100 ml量瓶中，加流動相適量使溶解，精密加入雜質(zhì)對照品貯備液1 ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液，精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)按匹多莫德峰計算不低于3 000，匹多莫德峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度應符合要求。見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗HPLC圖

2.4 專屬性試驗

2.4.1 空白溶劑 精密量取溶劑10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。空白溶劑無干擾。

2.4.2 酸破壞試驗 取匹多莫德原料約10 mg，置20 ml量瓶中，加4 mol/L鹽酸溶液2 ml溶解后，室溫放置4 h，用4 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.3 堿破壞試驗 取本品約10 mg，置20 ml量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，室溫放置3 h，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.4 氧化破壞試驗 取本品約10 mg，置20 ml量瓶中，加流動相約5 ml使溶解后，加3%過氧化氫溶液1 ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻，室溫放置2 h。精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.5 高溫破壞試驗 取本品約10 mg，置20 ml量瓶中，加適量流動相溶解，水浴加熱4 h，放冷至室溫，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.6 光照破壞試驗 取本品約10 mg，置20 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。日光下放置2周。精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結果表明，匹多莫德原料藥經(jīng)酸破壞、堿破壞、氧化破壞、高溫破壞和光照破壞后，各雜質(zhì)峰之間及與主成分峰均能完全分離。見圖2。

圖2 空白溶劑（A）酸破壞（B）堿破壞（C）氧化破壞（D）高溫破壞（E）光照破壞（F）高效液相色譜圖

2.5 線性關系考查 精密量取“2.2.2”項下對照品儲備液適量，用流動相逐步稀釋使成梯度濃度，分別精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標（X），以相對應的峰面積為縱坐標（Y），分別進行線性回歸，并以方程斜率（K）計算校正因子，匹多莫德及各雜質(zhì)的回歸方程和校正因子見表2。

表2 匹多莫德及各雜質(zhì)的回歸方程和校正因子

2.6 定量限和檢測限考查 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液適量，采取逐步稀釋法測定，記錄色譜圖。以信噪比（S/N）為 10∶1計算定量限，以信噪比（S/N）為3∶1計算檢測限。L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ和匹多莫德的定量限分別為3.0、2.4、1.7、5.0和0.8 ng，檢測限分別為 0.9、0.6、0.6、2.0 和 0.3 ng。

2.7 精密度試驗 取“2.2.2”項下的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ和匹多莫德峰面積的 RSD分別為 0.3%、0.7%、1.3%、0.3%和0.2%，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.1”項下的供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、4、8、12和24 h后取樣測定，記錄色譜圖。結果表明，隨著放置時間延長，L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅰ均有增長的趨勢，其中雜質(zhì)Ⅰ顯著增長。故供試品溶液須臨用新制。

2.9 重復性試驗 按“2.2.1”項下的方法制備供試品溶液共6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅱ均未檢出，雜質(zhì)Ⅰ峰面積的RSD為0.89%，表明本方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知各雜質(zhì)含量的匹多莫德原料藥（批號Z140907）50 mg，共6份，分別置100 ml量瓶中，加流動相適量使溶解，分別精密加入“2.2.3”項下雜質(zhì)對照品溶液1 ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果L-噻唑烷-4-羧酸平均回收率為100.1%，RSD為1.6%；L-焦谷氨酸平均回收率為101.0%，RSD為0.8%；雜質(zhì)Ⅰ平均回收率為99.4%，RSD為0.9%；雜質(zhì)Ⅱ平均回收率為101.4%，RSD為1.7%。見表3-表6。

表3 L-噻唑烷-4-羧酸加樣回收率試驗結果（n=6）

表4 L-焦谷氨酸加樣回收率試驗結果（n=6）

表5 雜質(zhì)Ⅰ加樣回收率試驗結果（n=6）

表6 雜質(zhì)Ⅱ加樣回收率試驗結果（n=6）

2.11 樣品中有關物質(zhì)測定 取匹多莫德原料藥3批，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，并按加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質(zhì)的含量。經(jīng)對3批樣品測定，結果見表7。

表7 匹多莫德原料藥中有關物質(zhì)測定結果

3 討論

3.1 色譜柱品牌的選擇 筆者在前期試驗中選擇較常用的 phenomenex Luna C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Agilent C18（250 nm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分別測定樣品，匹多莫德峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度均小于1.5，不符合《中國藥典》要求。而采用Kromasil 100-5-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm)色譜柱測定樣品時，匹多莫德峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度大于2.0，滿足系統(tǒng)適用性試驗的要求。

3.2 流動相pH值的影響 在流動相的篩選優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，流動相的pH值對匹多莫德與各雜質(zhì)的分離度影響很大。當pH值＜2.45時，L-噻唑烷-4-羧酸與相鄰溶劑峰分離度欠佳；當pH值＞2.55時，匹多莫德峰與相鄰雜質(zhì)峰不能完全分離。因此，試驗應嚴格控制流動相pH值在2.50±0.05的范圍內(nèi)。

3.3 各雜質(zhì)限度的擬定 根據(jù)ICH指導原則，結合現(xiàn)行國家標準的雜質(zhì)限度，擬定匹多莫德的雜質(zhì)限度為：L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ均不得過0.2%，雜質(zhì)總量不得過0.5%。

綜上所述，采用筆者建立的HPLC-加校正因子的主成分自身對照法測定匹多莫德原料藥中的4種有關物質(zhì)靈敏、準確、可靠，可有效控制匹多莫德原料藥的質(zhì)量。