文│白明月（山東省禹城市畜牧業(yè)發(fā)展中心）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）又稱紅鼻病，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV）引起的一種主要發(fā)生在牛的傳染病，主要特征是高熱、流鼻液，隨后發(fā)展為呼吸困難等癥狀，除導(dǎo)致牛生長緩慢、產(chǎn)奶量下降外，亦可造成繁殖力下降、流產(chǎn)等，同時IBRV還可引起免疫抑制，繼發(fā)其他呼吸道病原，給各國養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。雖然IBR發(fā)病后死亡率不高，但由于其可影響國際貿(mào)易，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告的傳染病，我國也將其列為二類動物疫病。該病最早于1955年由Miller在美國科羅拉多的育肥牛群中發(fā)現(xiàn)，并于1956年由Madin首次分離出病毒，之后一些學(xué)者相繼在發(fā)病牛的眼結(jié)膜、腦、外陰、流產(chǎn)胎兒等組織、材料中分離出病毒，1964年Huck確認IBRV為皰疹病毒。我國于1980年由周泰沖在新西蘭進口奶牛中首次分離到IBRV，之后流行病學(xué)調(diào)查顯示IBR在我國廣泛流行，嚴重制約我國養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。

表1 選取牛場相關(guān)信息

一、材料與方法

1.材料。

（1）病毒、細胞與血清。IBRV陽性毒株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心研究員楊宏軍饋贈，牛胚腎細胞（MDBK）、IBR陽性血清、陰性血清均購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC），待檢血清采集自山東省濟南、泰安、德州、東營、濰坊、臨沂等6市共15個奶牛場或奶牛養(yǎng)殖小區(qū)，共計1981份樣品。上述牛場未暴發(fā)過IBR且均未接種包含IBRV抗原的疫苗。

（2）試驗動物。2～6月齡健康奶牛篩選自泰安市及周邊養(yǎng)殖場，要求IBRV抗原、抗體均為陰性。IBRV抗原檢測時取待檢牛的鼻拭子，浸泡于1.0毫升含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中，低溫運送至實驗室，反復(fù)凍融3次，8000r/min（r/min指每分鐘所旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)）離心10分鐘，取上清液抽提DNA后直接PCR檢測；IBRV抗體檢測時無菌采血，析出血清后使用IBRV ELISA抗體檢測試劑盒［Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus（BHV-1） gB Antibody Test Kit］進行檢測。

表2 不同牛場犢牛ELISA法檢測抗體陽性率匯總（2016—2018年）

表3 不同牛場成年牛ELISA法檢測抗體陽性率匯總（2016—2018年）

表4 不同地區(qū)ELISA法檢測抗體平均陽性率匯總（2016—2018年）

（3）主要試劑及儀器。IBRV ELISA抗體檢測試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品。2×Taq Plus MasterMix（Dye）購于康為世紀生物科技有限公司；低熔點瓊脂糖、中性紅染色液均為索萊寶公司產(chǎn)品；胎牛血清為Biological Industries（BI）公司產(chǎn)品。

2.試驗方法。

（1）山東省牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)查。為了解山東省內(nèi)IBR的感染情況，本課題組在2016—2018年，連同地方畜牧獸醫(yī)局的春防秋防工作，選取濟南、泰安、德州、東營、濰坊、臨沂等6市15個奶牛場開展流行病學(xué)調(diào)查，分別對15個牛場中2～6月齡犢牛和1歲以上成年牛（包括懷孕牛）進行采血，犢牛采血方式為頸靜脈采血，成年牛通過尾根靜脈采血，共計采血1981份，其中犢牛采血489份，成年牛采血1492份。操作時使用10毫升注射器無菌采血5.0毫升，之后將血液負吸到促凝管中，混勻后靜置，置于4℃析出血清后收集到EP管中，56℃水浴30分鐘進行滅活，-20℃保存待用。15個牛場相關(guān)信息如表1。

（2）ELISA法檢測血清樣品。按說明書進行操作，具體如下：

試驗前準備。將試劑盒所有組分恢復(fù)至18～26℃，并混勻；洗滌液的準備：對恢復(fù)至18～26℃的洗滌液進行10倍稀釋；取出用抗原包被的反應(yīng)板，并記錄好樣品位置；每孔加入50微升稀釋的洗滌液；分別將50微升的陰性對照加入到適當?shù)?個孔中，分別將50微升的陽性對照加入到適當?shù)?個孔中，分別將50微升的被檢樣品加入到剩下的檢測孔中；將反應(yīng)板中的溶液振蕩混勻；37℃條件下孵育2小時；棄掉孔內(nèi)液體，用大約300毫升洗滌液洗滌加樣孔，共洗滌5次。每次洗滌后棄去孔內(nèi)液體，最后1次洗滌后將孔內(nèi)殘留的洗滌液排干；在每個反應(yīng)孔中加入100微升酶標抗體；在18～26℃條件下孵育1小時；棄掉孔內(nèi)液體，用大約300毫升洗滌液洗滌加樣孔，共洗滌5次。最后1次洗滌后將孔內(nèi)殘留的洗滌液排干；在每個反應(yīng)孔中加入100微升的TMB底物溶液；在18～26℃條件下避光孵育10分鐘；在每個反應(yīng)孔中加入100微升的終止液終止反應(yīng)；在450納米波長下測定樣品及陽性、陰性對照的吸光值。

酶標儀讀數(shù)后進行計算，當阻斷率＜45%時，判為樣品陰性；當45%≤阻斷率 ＜55%時，判為可疑；當阻斷率≥55時，判為樣品陽性。

二、結(jié)果與分析

山東省牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果。將采集的1981份血清樣品全部使用試劑盒進行檢測，結(jié)果顯示，濟南等6市15個牛場中有14個牛場檢測出IBRV gB抗體陽性牛（表2、表3）。其中，濟南、泰安、德州、東營、濰坊、臨沂等6市試驗牛場的IBRV gB抗體整體平均陽性率分別為10.2%、58.0%、12.4%、20.3%、18.5%和5.0%（表4）。通過數(shù)據(jù)分析可知，山東省的牛場普遍感染IBRV，但不同牛場的檢測結(jié)果差異較大，有些牛場，如TA1，犢牛與成年?？贵w檢出率都很高，而牛場DZ4的IBRV gB抗體檢出率則為0。試驗結(jié)果顯示，不同牛場犢牛、成年牛的抗體檢出率并無明顯相關(guān)性。

三、討論

1.不同牛場IBRV抗體存在差異的原因。經(jīng)檢測可知，不同牛場IBRV抗體陽性率存在較大差異，部分牛場則未檢出，原因之一在于不同牛場采取的管理措施不同，如牛場TA1，未實行自繁自養(yǎng)的模式，主要從東北、內(nèi)蒙古和浙江等地引牛，犢牛的流動性較大，在引牛的過程中不清楚當?shù)嘏鲆卟?、免疫等情況，加之長途運輸，可能導(dǎo)致牛感染IBRV或是IBRV隱形感染，之后配種產(chǎn)犢，由于病毒垂直傳播的特性，導(dǎo)致新生犢牛也存在IBRV抗體。反觀牛場DZ4，實行自繁自養(yǎng)，近3年中均未檢出IBRV抗體陽性牛，說明牛場的管理方式對于疫病的防控會起到關(guān)鍵作用。

2.犢牛與成年?？贵w關(guān)系的分析。對于自繁自養(yǎng)的牛場，如濟南市的3個牛場，牛場DZ5、DY2等，新生犢牛全部來源于牛場的懷孕牛，犢牛出生后需飼喂初乳，如果懷孕牛曾經(jīng)感染過IBRV，體內(nèi)會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并隨著初乳被犢牛吸收。初乳在犢牛體內(nèi)的生物半衰期只有3周左右，但9月齡也能檢測到，同時考慮到IBRV垂直傳播的特性，體內(nèi)有IBRV抗體的懷孕牛產(chǎn)犢后的犢牛IBRV抗體檢測應(yīng)為陽性。本研究采集的犢牛與成年牛樣品雖然只有部分為母子關(guān)系，但抗體陽性率整體符合規(guī)律，即懷孕牛IBRV抗體陽性牛產(chǎn)犢后犢牛IBRV抗體也為陽性。而另外部分的牛場，由于經(jīng)常引進、賣出犢牛，加之引進的犢牛背景不清楚，部分犢牛育成后會配種產(chǎn)犢，導(dǎo)致犢牛與成年牛之間沒有明顯的IBRV抗體相關(guān)性。

四、結(jié)論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，山東省的牛場普遍感染IBRV，抗體陽性率為5%～58%，不同牛場檢測結(jié)果差異較大，不同牛場犢牛、成年牛的抗體檢出率并無明顯相關(guān)性。