周曼麗，簡維雄,2*，王健章,3，馮宇，錢舒樂,3，張家齊,3，俞赟豐

(1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學國家重點學科中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

人體和各種生命物質(zhì)皆是由蛋白質(zhì)組成。迄今為止，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)有100多萬種, 可以按不同的組成、結構和修飾組成各種細胞和生命物質(zhì)。蛋白質(zhì)組學從整體角度分析了細胞生命過程中，其內(nèi)部動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達水平、修飾狀況、蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)與其他生物分子之間的相互作用, 從而了解蛋白質(zhì)的功能及其在生命過程中的作用。由于疾病的發(fā)生和藥物治療靶點大多數(shù)是在蛋白質(zhì)(包括酶、受體及信號轉導蛋白) 水平，因此，蛋白質(zhì)組學適用于研究藥物的作用機制、尋找有效的藥物靶點以及開發(fā)新藥。為此，本項目應用同位素標記(iTRAQ)技術開展了復方鉤藤降壓片和替米沙坦對左心室肥厚干預的蛋白質(zhì)組學研究,現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 動物

選用SPF級12周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)20只，隨機平均分為CGTA干預組和TMST干預組。體質(zhì)量(250±20)g，雄性。在人工調(diào)控的環(huán)境中22 ℃～26 ℃飼養(yǎng)，自由進食飲水，連續(xù)干預12周后用于實驗。飼料及墊料由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(SHR大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼料購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)。

1.2 試劑

Trypsin(Promega公司，美國)；三乙胺碳酸氫鹽儀、TEAB(Applied Biosystem公司，意大利)；乙腈、甲酸(Sigma公司，美國)；2-D Quant Kit(GE Healthcare公司，美國)；8標iTRAQ 試劑(Applied Biosystem公司，意大利)；復方鉤藤降壓片(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科)；替米沙坦片劑(江蘇萬鄭生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 儀器

離心機(5430r)(Eppendorf公司，德國)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Advantage)(密理博，美國)；多功能生物樣品均質(zhì)器(precellys24)(Bertin，法國)；超聲波細胞粉碎機(VCX130)(Sonics，美國)；小型垂直電泳槽(Mini-PROTEAN Tetra Cell)(伯樂，美國)；掃描儀(powerlook2100xl)(UMAX,美國)；酶聯(lián)免疫吸附儀(iMark)(伯樂，美國)；SCX強陽離子交換液相色譜柱(菲羅門公司，美國)；Online HPLC(LC-20AD nanoHPLC)、Offline HPLC(C-20AB HPLC)(島津公司，日本)；質(zhì)譜儀(Q EXACTIVE)(賽默飛世，中國)。

2 方法

2.1 心肌組織蛋白質(zhì)提取

2.1.1 樣品前處理

稱量樣品，每個樣品稱取0.1 g進行提取實驗。

2.1.2 蛋白提取

參考文獻[1]進行提取。1)將樣品置于研缽，在液氮條件下研磨成粉末；2)把粉末轉至加有裂解緩沖液Lysis Buffer離心管中，混勻，置于冰上5 min后加入終濃度為10 mmol/L的DTT，冰浴超聲5 min；3)25 000×g4 ℃離心20 min，取上清轉入新的離心管中，加入5倍以上體積冷丙酮沉淀過夜；4)25 000×g4 ℃再次離心20 min，棄上清；重復加入冷丙酮，搗碎沉淀，高速離心后棄上清；5)風干沉淀中殘余丙酮，重復以上實驗步驟后留取上清；6)向蛋白液加入終濃度10 mmol/L的DTT， 56 ℃水浴1 h；7)加入終濃度55 mmol/L的IAM，暗室放置45 min后循環(huán)上述實驗過程，最后25 000×g4 ℃離心15 min，取上清用于定量。

2.1.3 定量信息

2.1.3.1 蛋白質(zhì)濃度測量(Bradford定量法)

參考文獻[2]進行。1)準備BSA標準品的標準曲線，向10管的標準品量(0.2 μg/uL BSA)添加純水，使最終體積為20 μL。管1是不含蛋白的參照，其他管分別含有0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 μg蛋白;2)將樣品稀釋一定倍數(shù)至測量范圍內(nèi)，每個樣品各取20 μL至管中;3)向每管添加180 μL protein assay reagent，混合，室溫培養(yǎng)10 min;4)用酶標儀測量595 nm下的吸光度，依據(jù)標準曲線計算出樣品濃度。

2.1.3.2 定量曲線

Bradford工作液(考馬斯亮藍G-250)和蛋白在酸性條件下結合時，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與在595 nm的吸光值成正線性相關關系[2]。R2=0.991 7,呈線性關系。定量曲線見圖1。

圖1 定量曲線

2.1.3.3 定量數(shù)據(jù)

兩組大鼠心肌組織定量數(shù)據(jù)見表1。

表1 兩組大鼠心肌組織定量數(shù)據(jù)比較

2.1.3.4 SDS電泳蛋白質(zhì)條帶信息

配置12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠。每個樣品分別與4×loading buffer混合，95 ℃加熱5 min。每個樣品上樣量為30 μg，Marker(97 KDa,66 KDa,43 KDa,31 KDa,20 KDa,14 KDa)上樣量10 μg。120 V恒壓電泳120 min。電泳結束后，考染液染色2 h，再用脫色液脫色3～5次，每次30 min[2]。結果提示：條帶數(shù)目繁多。見圖2。

注：M.Marker;1.TMST組；2.CGTA組。圖2 蛋白質(zhì)條帶信息

2.2 iTRAQ分析實驗方法

大鼠心肌組織iTRAQ分析的基本流程見圖3。第一步：取等量蛋白Trypsin酶解每個樣品；第二步：用iTRAQ試劑標記肽段；第三步：對混合后的肽段使用強陽離子交換色譜(Strong Cation ExchangeChoematography，SCX)進行預分離；第四步：進行液相串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀：Q-EXACTIVE (ThermoFisher Scientific,San Jose,CA)分析[2]。

圖3 大鼠心肌組織iTRAQ分析的實驗流程

2.3 蛋白質(zhì)分析方法

1)數(shù)據(jù)庫選擇：uniprot Rattus(36508sequences)；2)Mascot搜索Mascot2.3.02版本；3)蛋白質(zhì)豐度比分布；對每個蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)后作出分布如圖4。表達量上調(diào)的蛋白居于橫坐標0位置的右側，表達量下調(diào)的蛋白居于橫坐標0位置的左側。其中差異倍數(shù)大于1.2的點用紅色和綠色標出(紅色為表達量上調(diào)，綠色為表達量下調(diào))[2]。這些紅色和綠色的點可能是潛在的差異蛋白。

圖4 TMST組/ CGTA組蛋白質(zhì)豐度比較

3 結果

3.1 CGTA組/TMST組心肌標本的差異蛋白Pathway富集分析

CGTA組與 TMST組的差異蛋白Pathway富集分析顯示有3條通路(見表2)。3條通路分別是：補體和凝血級聯(lián)通路(Complement and coagulation cascades)、緊密連接(Tight junction)、TGF-β信號通路(TGF-betasignaling pathway)。

3.2 CGTA組/TMST組心肌標本中差異蛋白的iTRAQ分析

蛋白質(zhì)組學只對兩組共同蛋白作分析，設定富集蛋白比值≥1.2為上調(diào)蛋白(見表3和表4)，富集蛋白比值≤0.83為下調(diào)蛋白。結果顯示：CGTA組與TMST組相比較，其中上調(diào)的蛋白12種，分別為：凝血酶3(Plastin 3)、纖蛋白5 (Fibulin-5)、半乳凝集素 (Lactadherin)、肌球蛋白11(Myosin-11)、S期激酶相關蛋白1(S-phasekinase-associated protein1)、肌球蛋白8(片段)[Myosin-8 (Fragment)]、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Serine/threonine-protein phosphatase 2A)、血管性血友病因子(片段)[Von Willebrand factor (Fragment)]、α2-抗纖溶酶(Protein Serpinf2/alpha-2-antiplasmin、Alpha-2 antiplasmin(α2-AP)) 、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(Myosin regulatory light chain RLC-A)、肝素輔助因子2(Heparin cofactor 2)。

表3 富集Pathway蛋白質(zhì)簡表

表4 富集Pathway蛋白質(zhì)詳表

3.3 差異蛋白之間的相互作用研究

將篩選出來的12個差異蛋白，利用string數(shù)據(jù)庫繪制差異蛋白功能聯(lián)系圖得到蛋白之間的相互作用(見圖5)，其中string可識別的差異蛋白為11個，Myosin-8未能識別。在string繪制的關系網(wǎng)中,肌球蛋白11(myosin-11)與肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A(Myosin regulatory light chain RLC-A)之間關系最為密切。

圖5 差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

4 討論

左室肥厚是高血壓靶器官損害的最重要特征之一，也是心血管事件獨立的危險因素，可顯著增加心源性猝死、急性心肌梗死、心力衰竭、室性心律失常等心血管事件的發(fā)生率和病死率，嚴重影響高血壓病的預后。心肌肥厚是一個多因子、多途徑的作用的結果，單一蛋白的改變可以導致心肌肥厚，但是多個蛋白失衡的交互作用，可能是關鍵性要素，為此本項目在篩選出差異蛋白后，結合蛋白的Pathway通路，從多個蛋白角度出發(fā)，試圖從整體性層面的失衡來解釋左心室肥厚的機制及其藥物干預的機制。

4.1 多個差異蛋白參與左心室肥厚的形成

在CGTA組和TMST組之間差異蛋白分析中得到12種上調(diào)蛋白，說明予以復方鉤藤降壓片治療后12種蛋白表達增加，提示上調(diào)蛋白在左心室肥厚形成過程中發(fā)揮著重要作用。

血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)是3個主要的止血分子之一[3]，主要由內(nèi)皮細胞合成。血管內(nèi)皮細胞主要通過釋放促凝和抗凝蛋白來調(diào)節(jié)凝血之間的平衡。vWF水平升高是內(nèi)皮細胞損傷或激活的標志。內(nèi)皮細胞受損時，貯存在Weibel-Palade小體中的vWF一部分被釋放入血漿中，另一部分則向內(nèi)皮細胞的基底外側部排泌，受壓力和剪切應力的作用，vWF被大量釋放并沉積在血管壁上[4]，改變血管結構成分，導致血管壁增厚，內(nèi)皮依賴的血管舒張功能減弱，血管收縮增強，脈管內(nèi)血液壓力增高[5]。

纖蛋白5(Fibulin-5)是一種細胞外基質(zhì)糖蛋白，具有維持血管穩(wěn)定，抑制活性氧簇表達的作用[6-7]。正常情況下，F(xiàn)ibulin-5表達水平較低，在組織缺氧的情況下，F(xiàn)ibulin-5的表達水平會明顯升高。Fibulin-5的表達與動脈中內(nèi)膜厚度增加呈正相關[8]。動物實驗發(fā)現(xiàn)Fibulin-5廣泛分布于血管等富含彈性蛋白的組織，是彈性纖維合成的關鍵調(diào)控蛋白[9]。Fibulin-5基因缺陷的小鼠動脈的彈性纖維排列會發(fā)生紊亂、斷裂，動脈內(nèi)膜彈性下降、順應性喪失、脈壓增加，造成靶器官損傷[8]。

半乳凝集素3(Gal-3)是一種參與心肌纖維化的循環(huán)標志物，它參與調(diào)節(jié)細胞生長，抗凋亡，參與血管形成及炎癥反應等生物學功能[10]。血清Gal-3水平與心肌纖維化呈顯著正相關，是與心肌重構相關的新興標志物[11]。Gal-3能夠刺激纖維母細胞活化，促進心臟肥大細胞、巨噬細胞的浸潤，導致血管周圍及心肌纖維化，引起心肌肥厚[12]。

磷酸化是蛋白常見的翻譯后修飾之一，大多數(shù)磷酸化修飾都發(fā)生在絲氨酸/蘇氨酸位點上。絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白磷酸酶(PPP2R1)可以被劃分為4 大類，包括 PP1、PP2A、PP2B 和 PP2C[13]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶能夠通過調(diào)節(jié)底物蛋白的磷酸化水平調(diào)節(jié)整個細胞周期，是細胞周期中負向調(diào)節(jié)的酶，在細胞的增殖與分化過程中起著重要的作用，其表達或活性異常均可以引起細胞的生物學行為的改變。因此，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶被認為是調(diào)節(jié)心血管疾病的新靶點[14]。

肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2 (MYL2)是心肌粗肌絲的主要成分，在心臟的發(fā)育與功能方面扮演著重要角色[15]。MYL2主要是通過磷酸化使肌球蛋白與肌動蛋白間的結合力增強，進而調(diào)節(jié)心肌的收縮功能[16]。MYL2磷酸化減弱將會降低Ca2+敏感性，使得肌鈣蛋白無法結合Ca2+被激活，降低了與肌球蛋白結合的幾率，從而導致收縮力下降。因此，MYL2磷酸化降低可影響肌球蛋白的結構和功能，影響心肌的收縮力[15]。國外有報道MYL2基因突變與肥厚型心肌病有關，其突變可影響粗肌絲的結構和功能，誘發(fā)心肌肥厚，進而導致肥厚型心肌病甚至慢性心力衰竭的發(fā)生[17]。

α2-抗纖溶酶(α2-AP)是血漿中主要抗纖溶物質(zhì)。α2-AP抑制以絲氨酸為活性中心的蛋白酶，如活化的凝血因子X，XI，XII，纖溶系統(tǒng)及激肽系統(tǒng)的蛋白酶。肝臟受損時α2-AP合成減少，纖溶酶的活性會增強[18]。α2-AP表達下調(diào)會影響肝纖維化的發(fā)生，而心室肥厚也存在心肌纖維化，因此推斷α2-抗纖溶酶也可能通過抑制表達導致左心室肥厚的發(fā)生[1]。

肝素輔助因子2(HCⅡ)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族之一，屬于生理性抗凝系統(tǒng)的一種新成分。當血管內(nèi)皮發(fā)生損傷時，血漿HCⅡ即可以通過誘導凝血酶與HCⅡ形成復合物，從而使得凝血酶失去了蛋白水解酶的活性。當合并有PC, AT缺乏及凝血因子V等其他危險因素存在時，HCⅡ的缺乏對血栓病的發(fā)生可能起到進一步促進的作用[19]。血栓形成，脈管狹窄，血管內(nèi)壓力增高，促使高血壓的發(fā)生，進而導致心室肌代償性肥厚。

S期激酶相關蛋白1(Skp1)是普遍存在于真核生物中的一種蛋白質(zhì)，在真核生物的細胞周期、轉錄調(diào)控、信號傳導等細胞進程中發(fā)揮關鍵作用[20]。Skpl可與不同種類蛋白形成復合體，作為多種生物功能的交叉點和限速因子，完成對代謝過程的調(diào)控[21]。S期激酶相關蛋白1水平的增高有可能激活萎縮信號通路，降解蛋白質(zhì)，逆轉肥厚心肌的產(chǎn)生。

通過string進行蛋白質(zhì)相互作用分析，共發(fā)現(xiàn)11個節(jié)點(nodes)和6條邊(edges)。

其中肌球蛋白11(myosin-11)與肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A(Myosin regulatory light chain RLC-A)之間關系最為密切。

心肌肌球蛋白是心肌的重要結構蛋白和收縮蛋白，是心肌肌原纖維的主要成分，由重鏈和輕鏈組成，具有ATP酶活性。肌球蛋白11是目前已知的以肌球蛋白為基礎的運動速度最快的順行性肌動蛋白，具有顯著的ATP酶活性高的特點[22]。肌球蛋白11的長C末端呈α-螺旋體，α-螺旋體在ATP水解時會有結構的變化，已有研究表明肌球蛋白11與動脈內(nèi)皮損傷的形成有關。精氨酸是肌球蛋白α-螺旋體的一部分，當MYH-11精氨酸的基因發(fā)生突變時，就會導致C末端螺旋結構的斷裂，引起動脈內(nèi)層結構紊亂變形，血管順應性降低[23]。臨床研究表明動脈結構紊亂發(fā)生動脈夾層的患者可能會導致主動脈瓣關閉不全，心室負荷壓力過大，引起左心室肥厚[24]。肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A與肌球蛋白11都屬于肌球蛋白超級大家族中的蛋白質(zhì)，其功能多樣化，主要是通過催化ATP水解將釋放出來的化學能轉化為推動肌動蛋白移動的機械能，為肌肉收縮提供動力[25]。肌球蛋白11與肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈RLC-A功能失調(diào)在心肌肥厚的發(fā)生過程中起重要作用，其磷酸化水平降低可影響肌球蛋白的結構和功能，影響心肌的收縮力，誘發(fā)心肌肥厚。

4.2 復方鉤藤降壓片通過調(diào)節(jié)通路，干預高血壓左心室肥厚的形成

Pathway分析的結果顯示，補體和凝血級聯(lián)、緊密連接通路以及TGF-β信號通路都存在蛋白富集現(xiàn)象，其中涉及差異蛋白數(shù)量最多的是補體和凝血級聯(lián)、緊密連接通路。復方鉤藤降壓片由鉤藤、麥冬和川芎等組成，具有滋陰潛陽、活血通絡的功效，大量研究表明復方鉤藤降壓片在治療高血壓左心室肥厚療效顯著[26]。主要表現(xiàn)在緩解炎癥反應，減輕過氧化刺激，抗血小板聚集，減慢心肌纖維化進程，降低血壓緩解心室重構等方面。

補體和凝血級聯(lián)通路屬于一種內(nèi)源性代謝級聯(lián)[27]。補體系統(tǒng)是血漿中的蛋白水解級聯(lián)和先天免疫的介質(zhì)，是針對病原體的非特異性防御機制。補體激活的主要后果是病原體的調(diào)理作用，激活后的補體可以調(diào)節(jié)吞噬細胞和免疫細胞并增強炎癥反應[28]。血液凝固是另一系列酶原-絲氨酸蛋白酶轉化，最終形成凝血酶。凝血酶是負責將可溶性纖維蛋白原轉化為不溶性纖維蛋白凝塊的酶，它可以直接作用到凝血過程的最后一步，使血液成凝膠狀，失去流動性，從而形成血栓[29]。自發(fā)性高血壓的患者由于血流生物力學等刺激存在低水平的炎癥反應，慢性炎癥反應與心室重構病理改變密切相關[26]。復方鉤藤降壓片以其降血壓及抗炎作用而具有靶器官保護優(yōu)勢，成為心血管疾病研究領域的熱點[30]。方中鉤藤主要依靠鉤藤堿和異鉤藤堿發(fā)揮藥效，有著抗血小板聚集、降壓、舒張血管、抑制血管平滑肌細胞增殖、保護心肌細胞的作用[5]?，F(xiàn)代藥理學分析發(fā)現(xiàn)，麥冬主要成分為甾體皂苷類。動物實驗研究表明，麥冬可以顯著提高大鼠對缺氧的耐受力，抑制血栓形成，增強心肌收縮力，改善左心室功能[5]。

緊密連接是腸道機械屏障的重要組成部分，在調(diào)節(jié)腸黏膜通透性和維持上皮細胞極性中發(fā)揮著重要作用，與腸上皮細胞共同構成腸道的選擇性屏障[31]。既往研究表明，腸道菌群能將膳食纖維降解成短鏈脂肪酸(SCFAs)，經(jīng)腸道吸收進入血液循環(huán)，作用于心臟等器官，使血壓下降[32]。維持腸道微生態(tài)平衡可能成為高血壓防治的潛在靶點。近年來研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥對腸道緊密連接蛋白具有一定調(diào)控作用，以健脾、理氣及清熱類方藥頻率最高[33]，而本研究中的復方鉤藤降壓片包含菊花、石決明、夏枯草、葛根、桑寄生、女貞子等滋陰清熱的藥，契合了緊密連接通路在腸道系統(tǒng)中發(fā)揮屏障作用的機制。中醫(yī)藥作用于緊密連接通路，為通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)來調(diào)節(jié)血壓提供了新途徑，同時也符合“心與小腸相表里”中醫(yī)理論。

TGF-β信號通路在機體內(nèi)具有調(diào)節(jié)細胞功能，如增殖、凋亡、分化和遷移的作用[34]。TGF-β1是轉化生長因子β超家族的一員，在心臟纖維化形成的過程中扮演著重要的角色。TGF-β1/ Smads通路主要作用于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等不同的細胞，調(diào)控不同的機制，促使細胞進入纖維化進程，轉變?yōu)榧〕衫w維細胞[35]。有學者[36]在實驗研究中以益氣活血的中藥復方治療皮膚纖維化小鼠的成纖維細胞，結果顯示益氣活血湯通過作用于TGF-β1通路能夠有效地減少膠原蛋白的產(chǎn)生，治療纖維化。這在一定程度上提示益氣活血法可通過干預TGF-β1/Smads通路，減輕膠原積聚和心室肥大。復方鉤藤降壓片中的川芎性溫，味辛，具有活血行氣的功效，主要化學成分為揮發(fā)油類物質(zhì)，能舒張血管平滑肌，降低血壓，擴張冠狀動脈，同時川芎素水煎劑具有抑制炎性因子表達從而達到抗炎抗增殖的作用，可改善心肌的血氧供應，降低心肌肥大的程度[37]。

5 結論

眾所周知，替米沙坦是降低血壓，逆轉左心室肥厚較理想的藥物[38]。本實驗以替米沙坦為陽性對照藥物，提取心肌組織作定量分析，通過Pathway富集分析篩選出補體凝血級反應、緊密連接、TGF-β三條與之相關的信號通路以及富集于三條通路中的12個差異蛋白。通過對以上相關通路和變化蛋白質(zhì)生物機制的研判，可認為左心室肥厚發(fā)生涉及心肌細胞增殖增生、血管內(nèi)皮損傷、炎癥刺激、血栓形成等多種生物學過程[1]。同時復方鉤藤降壓片中的藥物成分可通過降低血壓、減輕過氧化刺激和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等方面干預左心室肥厚的產(chǎn)生,這為臨床上治療自發(fā)性高血壓導致的左心室肥厚及未病先防提供了新的思路與方法。