彭磊

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450046)

《2017年中國(guó)痛風(fēng)現(xiàn)狀報(bào)告白皮書》指出:我國(guó)高尿酸血癥患者人數(shù)已達(dá)1.7億，且高尿酸血癥患者每年正以9.7%的年增長(zhǎng)率發(fā)展為痛風(fēng)，是不可忽視的健康警示，但是目前還未引起大家足夠的重視。此外，大量的流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，高尿酸血癥不僅是冠心病[1]、慢性腎病[2]的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，而且還與糖尿病、肥胖[3-4]等有著密切的聯(lián)系。無疑，高尿酸血癥正嚴(yán)重威脅著人類健康。金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb. )的干燥花蕾或帶初開的花，其味甘，性寒，歸肺、胃、心經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的作用，臨床中常用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等癥[5]。課題組前期對(duì)金銀花進(jìn)行了初步的降尿酸藥效研究，同時(shí)結(jié)合高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其有效部位進(jìn)行了化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)金銀花發(fā)揮降尿酸藥效可能與異綠原酸B、異綠原酸A、蘆丁、綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素有關(guān)(結(jié)構(gòu)見圖1)，但是還未得到進(jìn)一步的證實(shí)。因此，本研究通過分子對(duì)接技術(shù)將上述成分與XOD進(jìn)行虛擬篩選，進(jìn)一步優(yōu)化出對(duì)XOD抑制率較高的活性成分，并結(jié)合整體動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行降尿酸藥效驗(yàn)證，通過體內(nèi)外試驗(yàn)相結(jié)合模型，初步闡明金銀花發(fā)揮降尿酸藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為金銀花的深入開發(fā)和高尿酸血癥的防治提供參考和依據(jù)。

圖1 金銀花中篩選的小分子化合物結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 藥材

異綠原酸B(純度>99%，批號(hào)：20180721，四川省維克奇生物科技有限公司)；秦皮甲素(純度>98%，批號(hào)：20180616，成都德思特生物技術(shù)有限公司)；非布司他片(批號(hào)：1903710，江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑

尿酸(UA)試劑盒(批號(hào)：190561，中生北控生物科技股份有限公司)；黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒(批號(hào)：20190629，南京建成生物工程研究所)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號(hào)：20170131，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；D-果糖(批號(hào)：3623C327，英國(guó)AMRESCO公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

Sunrise酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan 公司)；LXJ-Ⅱ恒溫高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)；SHZ88-1型恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；SHIMADZU電子天平(日本島津公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，清潔級(jí)，5周齡，體質(zhì)量(180±10)g，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào):SCXK (豫) 2015-0002。

2 方法

2.1 分子對(duì)接試驗(yàn)

2.1.1 受體處理

XOD由2個(gè)完全對(duì)稱的亞單元組成，每一個(gè)亞單元可單獨(dú)發(fā)揮催化作用，其催化中心包括1個(gè)鉬喋呤(Mo-pt)中心、1個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸( FAD)及2個(gè)鐵硫中心(Fe/SI，Ⅱ)。參考文獻(xiàn)[6]，使用pymol v.1.6.x 軟件刪除B鏈，保留FAD、Mo-pt、Fe/SI，抽取出原配體非布司他，并刪除水分子，將處理好的受體和配體分別保存為PDB 格式備用。

2.1.2 配體處理

使用ChemBio3D繪制異綠原酸B、異綠原酸A、蘆丁、秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素的三維結(jié)構(gòu)，并將其保存為PDB格式備用。

2.1.3 分子對(duì)接

將“2.1.1”中處理好的受體與“2.1.2”中處理好的配體在Vina分子對(duì)接軟件下進(jìn)行分子對(duì)接研究。

2.2 整體動(dòng)物試驗(yàn)

2.2.1 給藥劑量及溶液配備

異綠原酸B、秦皮甲素的給藥劑量均為50 mg/kg，陽性藥非布司他給藥劑量為4.8 mg/kg，上述藥物均采用0.4% CMC-Na溶解，灌胃體積為1.2 mL/100 g。

2.2.2 造模方法

參考文獻(xiàn)[7]采用果糖與水1∶10比例配制。

2.2.3 動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)Wistar大鼠50只，雄性，體質(zhì)量(180±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為正常組、模型組、非布司他組、秦皮甲素組和異綠原酸B組。正常組給予清水，其余各組均給予10%果糖水復(fù)制高尿酸血癥大鼠。非布司他組、秦皮甲素組和異綠原酸B組給藥劑量見“2.2.1”；正常及模型組給予同等體積的0.4% CMC-Na水溶液。實(shí)驗(yàn)室濕度(60±10)%，溫度(25±5)℃，實(shí)驗(yàn)周期為21 d。

2.2.4 血清收集與處理

動(dòng)物取血前12小時(shí)禁食不禁水，并稱量體質(zhì)量，于實(shí)驗(yàn)第7、14、21天剪大鼠尾尖取血，待血液室溫放置至析出血清后在3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測(cè)大鼠血清UA、XOD水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 分子對(duì)接結(jié)果

3.1.1 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

使用chimera軟件將XOD中的原配體非布司他構(gòu)象提取出來，然后利用AutoDock將配體分子對(duì)接回已處理好的受體蛋白結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差RMSD=0.781 ?<2 ?，較好地重復(fù)出了原受-配體結(jié)合的構(gòu)象。同時(shí)，分子對(duì)接預(yù)測(cè)的非布司他對(duì)靶蛋白的結(jié)合常數(shù)Ki為280.94 nmol/L,與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的生物活性處于同一數(shù)量級(jí)，表明分子對(duì)接過程所設(shè)置的參數(shù)較合理。

3.1.2 分子對(duì)接結(jié)果

非布司他與XOD的結(jié)合能為-8.94 kcal/moL，異綠原酸B、異綠原酸A、金銀花酸、綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素與XOD結(jié)合能分別為-12.16、-9.22、-6.41、-10.92、-10.15、-8.12 kcal/moL，其中異綠原酸B、異綠原酸A、綠原酸、秦皮甲素結(jié)合能高于非布司他，表明上述化合物與XOD有較好結(jié)合，對(duì)XOD具有較強(qiáng)的抑制率，可能為金銀花發(fā)揮降尿酸的物質(zhì)基礎(chǔ)(與XOD分子對(duì)接結(jié)果及二維平面圖結(jié)果分別見表1和圖2)。

表1 金銀花小分子化合物及陽性藥與XOD分子對(duì)接結(jié)果

圖2 金銀花小分子化合物及非布司他與XOD相互作用平面圖

3.2 體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果

從分子對(duì)接部分得到異綠原酸B、異綠原酸A、綠原酸、秦皮甲素對(duì)XOD顯示很高的抑制活性，因此，本實(shí)驗(yàn)初步選異綠原酸B、秦皮甲素進(jìn)行體內(nèi)降尿酸藥效驗(yàn)證，以驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果的合理性。

3.2.1 各組大鼠體質(zhì)量情況比較

實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠體質(zhì)量未見顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量情況比較

3.2.2 各組大鼠血清UA水平比較

實(shí)驗(yàn)期間，與正常組相比，模型組大鼠血清UA值在7～21 d均顯著增高(P<0.05)，說明大鼠高尿酸血癥造模持續(xù)成功；與模型組相比，在給藥第7～21天內(nèi)，非布司他組、秦皮甲素組、異綠原酸B組大鼠血清UA均顯著小于模型組(P<0.05)，說明三者均具有較好的降UA藥效，結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清UA變化

3.2.3 各組大鼠血清XOD水平比較

實(shí)驗(yàn)期間，與正常組相比，模型組大鼠血清XOD活性在14～21 d顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，除秦皮甲素組第7天大鼠血清XOD活性無顯著差異外(P>0.05)，其余各給藥組大鼠血清XOD活性均顯著降低(P<0.05)，說明秦皮甲素、異綠原酸B發(fā)揮降尿酸藥效可能與抑制XOD活性有關(guān)，結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清XOD水平比較

4 討論

目前，控制尿酸水平西藥主要分為以下三大類：1)抑制尿酸合成關(guān)鍵酶活性，即通過抑制肝臟XOD的活性來減少尿酸的生成，從而達(dá)到降尿酸藥效，如別嘌醇、非布司他；2)促進(jìn)腎臟對(duì)尿酸的排泄，即通過調(diào)控腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1活性進(jìn)而達(dá)到降尿酸藥效，如臨床中常用的苯溴馬隆[9]；3)促進(jìn)尿酸分解成尿囊素的藥物，如拉布立酶、培格洛酶，但還未在我國(guó)境內(nèi)上市。雖然上述藥物作用靶點(diǎn)清晰且降尿酸藥效明確，但伴隨著上述藥物的廣泛使用，大量流行病學(xué)研究顯示，長(zhǎng)期服用以上藥物存在較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如臨床中常出現(xiàn)超敏、肝損傷、心臟毒[10-12]等報(bào)道。鑒于許多現(xiàn)有藥物適應(yīng)證限制及不良反應(yīng)，導(dǎo)致藥物選擇受限，因此對(duì)高尿酸血癥的藥物治療提出更高的要求，研究安全、有效的降尿酸藥物勢(shì)在必行。

近年來，分子對(duì)接技術(shù)由于其具有節(jié)省研究成本且縮小藥物開發(fā)周期等優(yōu)勢(shì)，已成為大規(guī)模藥物分子虛擬篩選的主要途徑和方法[13]。本次研究分子對(duì)接結(jié)果顯示，金銀花中異綠原酸B、異綠原酸A、綠原酸、秦皮甲素4種化合物對(duì)XOD的結(jié)合能大于非布司他，說明上述成分與陽性藥非布司他相比均顯示顯著的XOD抑制活性。同時(shí)，筆者還使用Pymol軟件及l(fā)igplot軟件分析觀察金銀花小分子化合物與XOD對(duì)接結(jié)果，以異綠原酸B為例，3取代咖啡?；?-OH與Glu802 OE1形成1個(gè)氫鍵，4取代咖啡酰基C3-OH與Ser876 OC和Glu879 OE1各形成1個(gè)氫鍵，奎寧酸與Lys771 NC形成1個(gè)氫鍵，并與Leu648、Pro1076、Phe1013、Phe649、His875、Leu1014、Thr1010、Phe1009、Leu873、Ala1078、Ala1079、Phe914、Phe649之間存在疏水作用，有報(bào)道[14]顯示殘基Glu802在XOD羥基化過程中發(fā)揮重要作用，與本次研究結(jié)果一致。

此外，整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，秦皮甲素與異綠原酸B均具有顯著的降尿酸藥效和抑制XOD活性。向小四[15]采用黃嘌呤+氧嗪酸鉀復(fù)制小鼠高尿酸血癥，連續(xù)7 d給予高劑量(200 mg/kg)、中劑量(100 mg/kg)、低劑量(50 mg/kg)劑量秦皮甲素，結(jié)果顯示三個(gè)劑量均可顯著高尿酸血癥模型小鼠的血清尿酸值，與筆者研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了分子對(duì)接篩選結(jié)果的合理性。本實(shí)驗(yàn)不足之處是未對(duì)綠原酸和異綠原酸A進(jìn)行降尿酸藥效驗(yàn)證，后期課題組將對(duì)上述成分進(jìn)行藥效驗(yàn)證及機(jī)制研究，以豐富金銀花發(fā)揮降尿酸藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。綜上，本研究初步明確了金銀花發(fā)揮降尿酸的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為金銀花的質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇和降尿酸藥物的開發(fā)提供依據(jù)和參考。