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        基于ERK和NF-κB途徑探討洋金花醉茄內(nèi)酯Daturataturin A抑制HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的作用

        2020-09-18 07:30:18魏政蘇慧琳匡海學(xué)
        中醫(yī)藥信息 2020年4期
        關(guān)鍵詞:內(nèi)酯銀屑病克隆

        魏政,蘇慧琳,匡海學(xué)*

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

        洋金花是白花曼陀羅屬一年生草本植物,具有止咳平喘、止痛鎮(zhèn)靜的作用,可用于治療銀屑病,療效確切[1]。近年來的研究表明,醉茄內(nèi)酯具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]和免疫抑制[5]效應(yīng)。筆者推測(cè)洋金花中某些醉茄內(nèi)酯,尤其是Daturataturin A(DTA)可能對(duì)表皮細(xì)胞生物學(xué)具有重要影響。醉茄內(nèi)酯是一系列28C原子的甾體衍生物,在側(cè)鏈C20位置上有一個(gè)δ內(nèi)酯[6]。近年來,醉茄內(nèi)酯類化合物的抗炎和對(duì)細(xì)胞毒性的影響已有報(bào)道,NF-κB信號(hào)通路是主要的藥理靶標(biāo),可以調(diào)節(jié)各種生理過程,如細(xì)胞增殖、發(fā)展、免疫、細(xì)胞凋亡、炎癥和代謝[6]。

        銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚炎癥,其主要病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖。表皮細(xì)胞NF-κB和ERK等異常激活,導(dǎo)致過度增殖、遷移、炎癥等生物學(xué)進(jìn)程。因此,本研究基于ERK和NF-κB途徑,對(duì)洋金花醉茄內(nèi)酯Daturataturin A(DTA)誘導(dǎo)HaCaT增殖、遷移、炎癥及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究,從而探討其治療銀屑病的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        抗體NF-кB、抗體ERK、抗體p-ERK、抗體PCNA、HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);IL-6、IL-8和 TNF-α ELISA試劑盒、CCk-8試劑(南京恩晶生物科技有限公司)。

        1.2 洋金花的提取分離和Daturataturin A的精制

        取干燥洋金花,用40倍量70%乙醇回流提取3次,每次2.5 h,合并提取液,冷卻至室溫,靜置,濾過。濾液回收溶劑至濃縮液無醇味后,用0.1%的鹽酸溶液5倍于濃縮液體積浸提6~8次,濾過。將此濾液進(jìn)行732型陽(yáng)離子交換樹脂柱色譜,流速3 BV/h,流出液繼續(xù)進(jìn)行AB-8型大孔吸附樹脂柱色譜,流速2.5 BV/h,吸附完全后用純水將樹脂洗至流出液還原糖反應(yīng)陰性,用50%乙醇4 BV洗脫,最后用95%乙醇洗脫回收溶劑。結(jié)合前期藥理學(xué)及化學(xué)成分研究,其中水洗脫部分主要含有水溶性雜質(zhì),95%乙醇洗脫部分主要含有脂溶性色素。50%乙醇洗脫組分中主要含有黃酮類化合物和甾體類化合物,是治療銀屑病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),即經(jīng)大孔樹脂得洋金花50%乙醇洗脫組分。

        對(duì)50% EtOH洗脫部分以葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜進(jìn)一步分離,依次用水、MeOH進(jìn)行洗脫,得到水洗脫組分(醉茄內(nèi)酯類化合物)和甲醇洗脫組分(黃酮類化合物)。采用反相柱色譜和HPLC等現(xiàn)代方法對(duì)水洗脫組分進(jìn)行分離,得到精制的Daturataturin A。

        1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

        HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),以2.5%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細(xì)胞;48 h更換新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

        1.4 增殖、遷移、抗炎實(shí)驗(yàn)

        采用CCK-8法檢測(cè)并分析藥物的量-效關(guān)系和時(shí)-效關(guān)系;WST-1、中性紅、結(jié)晶紫聯(lián)合測(cè)試藥物對(duì)細(xì)胞不同細(xì)胞器靶點(diǎn)的影響;HaCaT細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)試DTA的抗增殖效應(yīng);細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞劃痕法和transwell法;ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α 的表達(dá)情況。

        1.5 免疫蛋白印跡法檢測(cè)ERK、NF-κB、PCNA的表達(dá)

        將細(xì)胞消化后,制成單個(gè)細(xì)胞懸液,均勻的分裝至25 cm2培養(yǎng)瓶,使用相應(yīng)完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。至細(xì)胞鋪滿80%,加入相應(yīng)劑量的含藥物的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h或48 h,收獲細(xì)胞。細(xì)胞裂解在4 ℃進(jìn)行,所有試劑均預(yù)冷。首先,以PBS(pH值7.4)洗細(xì)胞,孵育在新鮮添加1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(含Na3VO4100 mmol/L,PMSF 1 mmol/L)30 min,每瓶600 μL。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,4 ℃,13 000×g離心20 min,取上清液。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。加入4×負(fù)載緩沖液后,煮沸5 min,將15 μg蛋白裝入聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(SDS-PAGE)。利用圖像分析軟件(Analytik Jena, Jena,德國(guó))對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析,確定目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值。核蛋白的提取按照制造商的說明書(solarbio,北京)進(jìn)行。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行,對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若P>0.05,則方差具有齊性,多組比較釆用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-ttest ;若P<0.05,則方差不齊,采用單因素方差分析,并使用Brown-Forsythe或Welch校正,兩兩比較采用Durmett’s T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P≤0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并應(yīng)用Prism 5顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的直方圖。

        2 結(jié)果

        2.1 DTA抑制HaCaT增殖呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系

        首先,應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定DTA(化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1f所示)對(duì)HaCaT抑制活性的量-效和時(shí)-效作用,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,單次實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,每隔6 h設(shè)為測(cè)試的時(shí)間點(diǎn),并應(yīng)用Prism 5利用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差擬合量-效曲線。DTA 30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L對(duì)HaCaT呈量效依賴的抑制作用(圖1a、圖1c和表1、表2)。 24 h和48 h的IC50分別為32.74 μmol/L和26.07 μmol/L(圖1b、圖1d)。30 μmol/L DTA對(duì)HaCaT的抑制活性隨時(shí)間遞增,大約在24 h起到明顯抑制增殖作用(圖1e和表3)。

        注:a.24 h CCK-8實(shí)驗(yàn);b.24 h量效曲線;c.48 h CCK-8實(shí)驗(yàn);b.48 h量效曲線;e.30 μmol/L DTA的時(shí)效曲線;f.Daturataturin A化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖1 DTA抑制HaCaT活性的初步研究

        表1 DTA作用于HaCaT細(xì)胞24 h的增殖抑制率

        表2 DTA作用于HaCaT細(xì)胞48 h的增殖抑制率

        表3 DTA在不同時(shí)間點(diǎn)作用于HaCaT細(xì)胞的增殖抑制率

        克隆形成實(shí)驗(yàn)是比較敏感的測(cè)定細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)方法。利用多功能成像儀 (Analytik Jena,Jena,德國(guó))及其配套的圖像分析軟件拍攝并計(jì)算克隆形成率。細(xì)胞以單個(gè)分散的形式接種在6孔板內(nèi),數(shù)日后,單個(gè)細(xì)胞不斷復(fù)制形成克隆,計(jì)算克隆形成率,可以直觀的反應(yīng)細(xì)胞的增殖能力。腫瘤細(xì)胞大多具有克隆生長(zhǎng)的能力,HaCaT細(xì)胞是永生化的表皮細(xì)胞,也具有較弱的克隆能力。在克隆形成實(shí)驗(yàn),7.5 μmol/L DTA能夠明顯抑制HaCaT增殖(P<0.05),然而30 μmol/L DTA幾乎完全抑制克隆形成(圖2a、圖2b和表4)。

        圖2 DTA抑制HaCaT細(xì)胞克隆形成

        表4 DTA影響HaCaT細(xì)胞克隆形成率

        2.2 DTA抑制IL-17誘導(dǎo)的HaCaT過度增殖

        以IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞作為銀屑病模型,研究DTA的抗增殖作用。在同一個(gè)96孔板樣本中,采用WST1、中性紅、結(jié)晶紫三聯(lián)測(cè),分別顯示DTA對(duì)線粒體、溶酶體、細(xì)胞膜三個(gè)細(xì)胞器靶點(diǎn)的作用。我們發(fā)現(xiàn)IL-17 50 ng/mL可誘導(dǎo)HaCaT過度增殖(P<0.05);DTA 7.5 μmol/L (P<0.05), 15 μmol/L (P<0.05) 和30 μmol/L (P<0.01)可劑量依賴的逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)(圖3a、圖3b、圖3c和表5、6、7)。三個(gè)不同的細(xì)胞器靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)顯示,DTA 7.5 μmol/L對(duì)溶酶體的抑制并無顯著意義,提示溶酶體中可能存在其他細(xì)胞保護(hù)作用的生物學(xué)進(jìn)程(圖3b和表6)。

        注:a. WST-1;b.中性紅;c.結(jié)晶紫依次在一個(gè)樣本中的連續(xù)測(cè)試;IL-17(50 ng/mL)添加到除空白組之外的各實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,單次實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。圖3 WST-1、中性紅、結(jié)晶紫三聯(lián)測(cè)試DTA抑制過度活化的HaCaT

        表5 WST-1測(cè)試DTA抑制HaCaT細(xì)胞的過度增殖

        表6 中性紅測(cè)試DTA抑制HaCaT細(xì)胞的過度增殖

        表7 結(jié)晶紫測(cè)試DTA抑制HaCaT細(xì)胞的過度增殖

        2.3 DTA抑制HaCaT的遷移能力

        細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示DTA抑制HaCaT劃痕愈合能力(圖4a、圖4b和表8)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示了DTA可抑制HaCaT單細(xì)胞遷移(圖4c、圖4d和表9)。Transwell實(shí)驗(yàn)拍攝照片后,用33%乙酸抽提樣本,酶標(biāo)儀測(cè)520 nm波長(zhǎng)吸光度,OD值代表遷移細(xì)胞的相對(duì)含量,結(jié)果顯示與鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法相似(圖4e和表10)。

        檢測(cè)到30 μmol/L DTA可抑制總ERK的表達(dá)(P<0.05),磷酸化的ERK可劑量依賴式的被DTA抑制(7.5 μmol/L;15 μmol/L,P<0.05;30 μmol/L,P<0.01)(圖5a、圖5b和表11)。

        注:a和b為24 h細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);c、d、e為12 h Transwell實(shí)驗(yàn);與Control比較, *P<0.05,**P<0.01。圖4 DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移

        注:與Control比較,*P<0.05,**P<0.01。圖5 DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移的始動(dòng)因子ERK

        表8 DTA抑制HaCaT細(xì)胞劃痕愈合

        表9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移計(jì)數(shù)

        表10 Transwell實(shí)驗(yàn)聯(lián)合結(jié)晶紫抽提檢測(cè)DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移的相對(duì)計(jì)數(shù)

        表11 免疫印跡檢測(cè)DTA抑制HaCaT細(xì)胞遷移的始動(dòng)因子ERK和p-ERK與內(nèi)參的比值

        2.4 DTA抑制持續(xù)活化的NF-κB

        作為炎癥信號(hào)分子,NF-κB在多種腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá),同時(shí),抑制NF-κB會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖活性減弱。Cyclin D1是NF-κB的下游信號(hào),表明炎癥信號(hào)和增殖信號(hào)之間的關(guān)系[7]。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,激活轉(zhuǎn)錄因子,隨后對(duì)細(xì)胞的增殖,存活和炎癥反應(yīng)有一系列的影響。筆者發(fā)現(xiàn)HaCaT細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)NF-κB,免疫熒光顯示強(qiáng)烈的NF-κB細(xì)胞核染色信號(hào),這可能與HaCaT細(xì)胞永生化的特性有關(guān)。隨著DTA(15 μmol/L,30 μmol/L,P<0.05)用量增加,在24 h,NF-κB免疫染色平均光密度顯著降低,30 μmol/L DTA組NF-κB信號(hào)幾乎完全消失(圖6a、圖6b和表12)。DTA(7.5 μmol/L, 15 μmol/L,P<0.05;30 μmol/L,P<0.01)可顯著降低核內(nèi)NF-κB/p65的表達(dá)(圖6d和表12)。此外,PCNA在S期DNA合成是必需的,DTA(15 μmol/L,30 μmol/L,P<0.05)降低PCNA免疫染色平均光密度(圖6a、圖6c和表12);DTA(7.5 μmol/L, 15 μmol/L,P<0.05;30 μmol/L,P<0.01)可顯著降低核內(nèi)PCNA的表達(dá)(圖6e和表12)。

        炎癥因子分泌的ELISA測(cè)定,顯示30 μmol/L DTA可顯著降低IL-6、IL-8、TNF-α的分泌(圖7a、圖7b、圖7c和表13),其抗炎作用與抗銀屑病藥物Tretinoin (1 μmol/L)(P<0.05)相似。

        表12 免疫印跡和免疫熒光檢測(cè)DTA抑制HaCaT細(xì)胞NF-κB和PCNA的表達(dá)

        注:與Control比較,*P<0.05,**P<0.01。圖6 DTA 抑制持續(xù)活化的 NF-κB和下游的增殖信號(hào)

        注:與Control比較,*P<0.05,**P<0.01。圖7 DTA抑制分泌性的炎癥因子

        表13 ELISA 檢測(cè)DTA作用下的HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-8和TNF-α 的分泌

        3 討論

        銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚炎癥,其主要病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖。銀屑病的臨床表型有尋常型銀屑病、斑點(diǎn)狀銀屑病、反向銀屑病、紅皮病型牛皮癬和膿皰性銀屑病[8]?,F(xiàn)已經(jīng)提出許多假說來推測(cè)銀屑病可能的病理模型。銀屑病的臨床表現(xiàn)為厚鱗屑,并伴有組織病理學(xué)改變,是以表皮角化為主要特征的一種疾病。然而,銀屑病病理生理學(xué)的發(fā)現(xiàn)揭示了這種紊亂機(jī)制,角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖是銀屑病的重要機(jī)制之一。

        近年來提出了一種涉及IL-23/Th17免疫軸的銀屑病致病模型[9]。在與這個(gè)軸相關(guān)的分子中,IL-17是影響銀屑病的關(guān)鍵因子,并已開發(fā)出針對(duì)其的相應(yīng)生物制劑[10-11]。IL-17激活核factor-kappa B (NF-κB)信號(hào)通路,并引起下游一系列細(xì)胞增殖和炎癥進(jìn)程。本研究顯示DTA可抑制IL-17誘導(dǎo)的HaCaT過度增殖,可能是治療銀屑病的機(jī)制之一。

        表皮角質(zhì)形成細(xì)胞作為原駐的天然免疫細(xì)胞,可防御外來的有害物質(zhì)侵襲,充當(dāng)免疫衛(wèi)兵的作用。激活的 NF-κB是一個(gè)含有p65和p50亞基二聚體的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB經(jīng)IκB激酶誘導(dǎo)后與IκB分離,進(jìn)入到細(xì)胞核而影響特殊靶基因序列。多種刺激可以激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,包括TNF-α、IL-1、IL-17、病毒和脂多糖。銀屑病患者皮損處相比于健康者 NF-κB表達(dá)上調(diào)[12]。作為炎癥關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素,NF-κB可以調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和酶的轉(zhuǎn)錄。也影響炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,如TNF-α,IL-1,IL-6和IL-8。此外,NF-κB激活能影響角質(zhì)細(xì)胞在銀屑病皮損中的分化和增殖[13]。NF-κB是天然免疫的主要信號(hào)途徑,銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞的產(chǎn)生與反應(yīng)異常的炎性細(xì)胞因子有關(guān),包括TNF-α, IL-6和IL-8[9],本研究顯示了DTA可抑制持續(xù)活化的NF-κB及其下游的炎癥因子。

        蛋白激酶是信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,可以使細(xì)胞作為有機(jī)體的一個(gè)組成部分發(fā)揮作用。胞外信號(hào)激酶ERK(Extracellular signaling kinase, ERK),磷酸化并轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi),參與了細(xì)胞增殖[14]和遷移[15]的多種進(jìn)程。ERK和NF-κB存在著交互作用,本研究顯示DTA抑制ERK的磷酸化水平,進(jìn)而抑制HaCaT增殖、遷移和炎癥進(jìn)程。

        醉茄內(nèi)酯是一類廣泛存在于茄科植物中的有活性的化合物。隨著分子結(jié)構(gòu)和藥理研究的進(jìn)展,其具有良好的抗癌作用的報(bào)道越來越多。茄科植物分布廣泛,為其天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和藥理研究提供了大量資源。筆者研究結(jié)果揭示了洋金花醉茄內(nèi)酯DTA可有效抑制HaCaT增殖和遷移,其機(jī)制可能是通過抑制炎癥信號(hào)分子NF-κB和ERK進(jìn)行的。這可能是洋金花制劑治療銀屑病的作用機(jī)制之一。

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