宋統(tǒng)球,高艷榮,王素華,白宇超,賈玉巧

包頭醫(yī)學院毒理教研室(公共衛(wèi)生學院),內(nèi)蒙古 包頭 014060

塵肺病呈進行性加重且不可逆轉(zhuǎn)，不僅造成職業(yè)病病人健康損害，又給國家?guī)砭薮蟮尼t(yī)療經(jīng)濟負擔。長期吸入稀土粉塵可引起肺的纖維性變，稱為稀土塵肺[1]。Th1/Th2 型細胞因子反應失衡是肺纖維化的研究熱點之一[2]。研究中發(fā)現(xiàn)[3]：Th2 型細胞因子在肺纖維化中起主要作用，可促進成纖維細胞活化、增生，使膠原蛋白合成增加，并抑制其降解，最終導致基質(zhì)蛋白沉積和纖維組織生成；Th1 型細胞因子可以抑制成纖維細胞的增殖和纖維組織的生成，并能抑制Th2 型細胞因子的釋放，減少纖維化。DNA 甲基化可以調(diào)節(jié)細胞因子基因活性，影響Th1、Th2 型細胞因子的轉(zhuǎn)錄，導致Th1/Th2 細胞因子間失衡，IFN-γ基因啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化時會導致其分泌減少甚至不分泌[4]，IL-10啟動子區(qū)存在CpG 位點，且啟動子區(qū)甲基化與IL-10 的表達呈明顯負相關(guān)[5]，因此，本研究擬通過測定塵肺工人外周血釹含量和Th1 型細胞因子IFN-γ及Th2 型細胞因子IL-10 的表達，并檢測它們啟動子區(qū)的甲基化水平，了解塵肺工人暴露水平及機體免疫狀況，從分子水平探討釹粉塵致塵肺機理。

1 對象與方法

1.1 對象

收集某稀土廠釹作業(yè)塵肺病患者22 例作為塵肺組，均符合《GBZ70-2015 塵肺診斷標準》中塵肺病診斷標準，選取年齡、工齡相匹配的無粉塵暴露的行政管理人員22 例作為對照組。所選研究對象均為男性，排除吸煙、肺結(jié)核、肺炎及其他纖維化及結(jié)締組織疾病，并進行健康體檢。該研究經(jīng)包頭醫(yī)學院倫理委員會論證通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 問卷調(diào)查 采用統(tǒng)一設(shè)計的調(diào)查表，按照統(tǒng)一的方法及標準，由經(jīng)培訓的調(diào)查員對調(diào)查對象進行問卷調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括年齡、工齡、職業(yè)史、既往史、吸煙情況等。

1.2.2 血液樣品的采集 經(jīng)知情同意，采用專用的抗凝采血管采集清晨空腹全血樣5.0 mL，另采集5.0 mL 全血自然凝固后取血清。所有標本皆-80 ℃冷凍保存。

1.2.3 全血釹濃度測定 全血采用混合酸溫控濕式消解法[6]預處理血樣，用釹標準液（1000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料測試中心）配制標準系列工作曲線溶液，濃度為5、10，20，30，40，50，100μg/L。采用iCAP Q 等離子質(zhì)譜儀(Thermofisher，美國)測定釹的含量，以響應值（Y）為縱坐標，相應質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，繪制標準溶液工作曲線。通過標準曲線方程計算得相應的元素含量。

1.2.4 血清中IL-10 和IFN-γ含量檢測 將血清樣本至于溫室復融，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書（南京建成，中國）操作，加入顯色劑后用全波長酶標儀（BIO-TEK，美國）測波長450 nm 的光密度值，根據(jù)標準曲線計算血清中的含量。

1.2.5 IFN-γ和IL-10 啟動子甲基化檢測 在NCBI 上截取基因轉(zhuǎn)錄起始位點的上游5000 bp 至下游1000 bp 序列，利用CpG 島在線預測網(wǎng)站http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/預測序列潛在的CpG 島，沒有發(fā)現(xiàn)潛在CpG 島。根據(jù)Mikeska 等[7]提出的引物設(shè)計的一般規(guī)則和建議，用sequenom?EpiDesigner 程序?qū)π蛄羞M行引物方案設(shè)計，設(shè)計引物序列（由北京博淼生物公司合成）。使用血液基因組DNA 提取試劑盒（DP318，北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。NanoDrop 1000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific，USA）檢測提取的DNA 純度、濃度。純度要求A260/A280在1.7～2.0 之間，DNA 濃度大于30 ng/μL；樣本體積大于50μL。并用1%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察電泳條帶有無明顯降解。采用美國Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒對DNA樣品進行轉(zhuǎn)化。回收的DNA 按表1 所列引物和反應條件進行擴增，擴增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測，見圖1。

表1 IL-10、IFN-γ甲基化引物序列和反應條件Table 1 IL-10、IFN-γ methylation primer sequences and reaction conditions

圖1 啟動子甲基化電泳圖（部分）Fig.1 Promoter methylation electrophoresis(part)

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布資料，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。不符合正態(tài)分布時以中位數(shù)和四分位間距M（Q）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗，相關(guān)性采用多重線性回歸分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究對象一般情況

塵肺組與對照組兩組人員年齡、工齡經(jīng)兩獨立樣本t檢驗，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。體檢異常項目經(jīng)x2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），因此兩組資料具有可比性（見表2）。

表2 塵肺組與對照組一般資料比較Table 2 Comparison of general data between pneumoconiosis group and control group

2.2 血液中釹及血清細胞因子含量比較

塵肺組全血釹含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，塵肺組血清IL-10 含量及IL-10 與IFN-γ的比值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，塵肺組血清IFN-γ含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（表3）。

表3 血液中釹及血清細胞因子含量比較Table 3 Comparison of neodymium and serum cytokines in blood

2.3 IFN-γ和IL-10 啟動子甲基化狀態(tài)

根據(jù)MassARRY EpiTYPER 質(zhì)譜儀分析提供的圖譜數(shù)據(jù)，精確定位到基因片段每個CpG 單位的甲基化狀態(tài)，用甲基化率量化每個CpG 單位。本實驗檢測IFN-γ基因啟動子區(qū)CpG 位點總數(shù)7 個，全部檢出。IL-10 基因啟動子區(qū)CpG 位點總數(shù)16 個，其中的CpG5 和CpG6 因為酶切之后產(chǎn)生的片段分子量大小一樣，因而產(chǎn)物峰落在同一位置而被合并檢出，最終顯示的結(jié)果為上5、6 點的平均甲基化程度，CpG10 未檢出，CpG_11 超過30%未檢出，故剔除[8]。利用聚類分析法分析IFN-γ和IL-10基因啟動子區(qū)CpG 位點甲基化率在兩樣本中的分布趨勢，采用Cluster 3.0 軟件、TreeView 軟件進行分層聚類分析，發(fā)現(xiàn)塵肺組IFN-γ啟動子區(qū)甲基化率要高于對照組，IL-10 啟動子區(qū)甲基化率要低于對照組，（見圖2，3）。

圖2 塵肺組和對照組IFN-γ基因啟動子區(qū)各CpG 位點甲基化率聚類分析Fig.2 Cluster analysis of methylation rate of CpG loci in IFN—γ promoter region of pneumoconiosis group and control group

圖3 塵肺組和對照組IL-10 基因啟動子區(qū)各CpG 位點甲基化率聚類分析Fig.3 Cluster analysis of methylation rate of CpG loci in IL-10 promoter region in pneumoconiosis group and control group

經(jīng)正態(tài)性檢驗發(fā)現(xiàn)IFN-γ和IL-10 甲基化的數(shù)據(jù)非正態(tài)，采用Mann-Whitney U 檢驗比較甲基化的差異。IFN-γ啟動子7 個CpG 位點中：CpG1、CpG4、CpG7 的甲基化水平高于對照組（P<0.05），而其它的CpG 單位CpG2，CpG3，CpG5，CpG6 則沒有顯著差異性（P>0.05）。IL-10 啟動子13 個CpG 位點中：CpG1、CpG5.6、CpG9、CpG15 的甲基化水平明顯低于正常對照組（P<0.05），而其它的CpG 單位CCpG2、CpG3、CpG4、CpG7、CpG8、CpG12、CpG13、CpG14 和CpG16 則沒有顯著差異性（P>0.05）（見表4、5）。

表4 IFN-γ基因甲基化檢測結(jié)果M（Q）Table 4 IFN-γ gene methylation test results M(Q)

表5 IL-10 基因甲基化檢測結(jié)果M（Q）Table 5 IL-10 gene methylation test results M(Q)

2.4 多重線性回歸分析

以IFN-γ和IL-10 基因啟動子區(qū)有差異的CpG 位點作為因變量，以工齡、年齡、血液中釹含量、血清細胞因子含量及IL-10 與IFN-γ的比值作為自變量，多重線性回歸分析采用逐步法，結(jié)果顯示：IFN-γ的CpG1、CpG7 和IL-10/IFN-γ的比值存在線性相關(guān)，IL-10 中的CpG1、CpG5.6 和IL-10/IFN-γ的比值存在線性相，CpG15 和IL-10、IL-10/IFN-γ的比值存在線性相關(guān)（見表6、7、8）。

表6 IFN-γ基因啟動子區(qū)有差異的CpG 位點與各因素多重線性回歸分析結(jié)果Table 6 Multiple linear regression analysis of different CpG loci and factors in IFN-γ gene promoter region

表7 IL-10 基因啟動子區(qū)有差異的CpG 位點與各因素多重線性回歸分析結(jié)果Table 7 Multiple linear regression analysis of different CpG loci and factors in IL-10 gene promoter region

表8 IL-10 基因啟動子區(qū)CpG15 位點與各因素多重線性回歸分析結(jié)果Table 8 Multiple linear regression analysis of CpG15 loci and factors in IL-10 gene promoter region

3 討論

氧化釹粒徑小于0.2μm，研究表明，粒徑小于25μm 的顆粒物，能夠進入肺泡沉積在肺部，是導致塵肺病的主要元兇[9]。由于粉塵無法排出體外，肺組織會不斷吞噬和釋放粉塵，塵肺患者雖脫離粉塵環(huán)境，病變?nèi)詴粩噙M展，通過肺灌洗可以從塵肺患者肺中洗出大量粉塵[10]。本研究顯示，塵肺組工人血中釹水平明顯高于對照組，表明塵肺患者肺組織中存在大量氧化釹粉塵，是稀土釹作業(yè)工人患塵肺病的主要致病因素。

研究表明，塵肺患者體內(nèi)存在Th1 和Th2 免疫失衡[11]，Annacker 等[12]證實Th2 型細胞因子IL-10可以抑制Th1 型細胞因子IFN-γ的產(chǎn)生，王海椒等[13]發(fā)現(xiàn)塵肺患者肺部存在明顯的Th2 免疫優(yōu)勢表達，同時患者血清中IL-10 的含量高于正常人群；楊霞[14]在對二氧化硅致大鼠肺纖維化中發(fā)現(xiàn)，隨著染毒時間延長，IFN-γ處于平穩(wěn)降低狀態(tài)；暴磊等[15]研究顯示，在大鼠矽肺形成后期，IFN-γ表達減弱，IL-10 表達顯著增強。本研究顯示塵肺組IL-10 含量大于與對照組，IFN-γ含量低于對照組，IL-10/IFN-γ在塵肺組中占優(yōu)勢，這表明塵肺患者IL-10 優(yōu)勢表達，IFN-γ受抑制。已有研究證實：IL-10可下調(diào)IFN-γ產(chǎn)生，促進肺部纖維化反應，同時誘導Th0 細胞向Th2 細胞分化[16]，INF-γ可以抑制Th2細胞因子的釋放，對肺纖維化具有抑制作用[17]。

DNA 甲基化可以在不改變序列的情況下改變DNA 分子的活性，它可以調(diào)節(jié)基因活性并影響許多關(guān)鍵過程。研究發(fā)現(xiàn)[18]：基因啟動子可通過高甲基化進行基因沉默，使其喪失轉(zhuǎn)錄活性，同樣可通過去甲基化促進基因的表達，本研究發(fā)現(xiàn)，塵肺患者IFN-γ基因啟動子甲基化率高于正常人群，而IL-10 基因啟動子甲基化率低于正常人群，表明，IFN-γ基因表達受抑制，IL-10 基因表達異常增強。研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化時會導致其分泌減少甚至不分泌[19]，Gonsky 等[20]在對炎性腸炎的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ啟動子DNA 每降低5%甲基化百分比，IFN-γ基因表達水平升高將近3 倍，宋陽等[21]發(fā)現(xiàn)：大鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-10 降低與其啟動子區(qū)域高甲基化密切相關(guān)，付麗紅[22]用5-氮雜胞苷處理單個核細胞，可以逆轉(zhuǎn)IL-10 啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)并使其表達升高。本研究血清中IFN-γ、IL-10 的水平與其基因啟動區(qū)甲基化率具有一致性，與上述相符。

多重線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的CpG1、CpG7 甲基化水平和IL-10/IFN-γ的比值呈正相關(guān)（P<0.05），IL-10 中的CpG1、CpG5.6 水平和IL-10/IFN-γ的比值呈負相關(guān)（P<0.05），CpG15 和IL-10、IL-10/IFN-γ的比值呈負相關(guān)（P<0.05），提示細胞因子失衡，對甲基化具有反向作用。這可能與CD4輔助T 細胞極化有關(guān)，高濃度的IL-10 誘導CD4 輔助T 細胞向Th2 方向極化，同時抑制其向Th1方向極化，向Th2 方向極化時IFN-γ啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化，并可遺傳給子代細胞[19]。

4 結(jié)論

綜上所述，IL-10 與IFN-γ失衡及其基因啟動子區(qū)的甲基化水平在釹塵肺的病情進展中有重要的作用。