國立東，張文文，劉 艷，黃夢(mèng)玲，門 悅，張燕麗，王麗群

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品往往因獨(dú)特的風(fēng)味、口感甚至特有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而在人類食品中占有重要地位，既包括奶酪、酸奶、開菲爾以及發(fā)酵香腸等動(dòng)物性發(fā)酵食品，也包括酸菜、泡菜等植物性發(fā)酵食品。東北酸菜是我國東北地區(qū)人們以貯藏秋菜而在漫長(zhǎng)冬季仍能攝取蔬菜為目的的產(chǎn)物之一，并已成為東北地區(qū)重要的一種特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品，可生熟兩吃。傳統(tǒng)東北酸菜主要以白菜為原料進(jìn)行自然發(fā)酵，以口感酸爽、脆嫩，風(fēng)味獨(dú)特，富含多種氨基酸等特點(diǎn)于一身而聞名[1]，這與酸菜在自然發(fā)酵制備過程中微生物的組成及作用息息相關(guān)。酸菜的菌相組成主要源于附著在蔬菜表面的天然本土微生物，其與地域環(huán)境有關(guān)，因此東北地區(qū)的氣候及環(huán)境條件賦予了東北酸菜特有的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜的微生物菌群涵蓋了細(xì)菌和真菌兩大類，且以細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而細(xì)菌中又以乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌，主要包括乳桿菌屬、明串珠菌屬等。乳酸菌作為益生菌的重要來源而備受關(guān)注，并成為研究熱點(diǎn)。大量動(dòng)物及人體臨床研究表明，乳酸菌具有諸多明確的益生功能，如可降膽固醇[2]、抗糖尿病[3]、抗肥胖[4]、抗抑郁[5]、抗氧化[6]、可降解草酸鹽防治腎臟疾病[7]等，這些益生特性具有菌種和菌株特異性[8]。因此，從傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜中分離篩選性狀優(yōu)良的具有潛在應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌具有重要意義。本研究從東北酸菜中分離篩選到1 株乳酸菌，通過形態(tài)學(xué)及基因序列比對(duì)分析對(duì)其種屬進(jìn)行鑒定，并探究其益生特性，旨在為益生菌產(chǎn)品的開發(fā)及工業(yè)潛在發(fā)酵劑菌種篩選提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

酸菜來源于黑龍江哈爾濱地區(qū)家庭，均采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵制作。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS（mMRS）培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[9]的方法配制。胰蛋白胨酵母膏葡萄糖（tryptone yeast glucose，TYG）液體培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[10]方法配制。

1.1.3 試劑

膽固醇 美國Amresco公司；牛膽粉 德國Merck公司；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）美國Sigma公司；L-谷氨酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；三乙胺、正己烷、乙腈均為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 高效液相色譜儀 安捷倫（中國）科技有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DM2500顯微鏡 上海徠卡顯微鏡有限公司；SPX-200-II生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BXM-30R全自動(dòng)高壓滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；TGL-16離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

使用無菌鑷子及勺取酸菜及汁液樣品于無菌離心管中，并放入冰盒立即帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱短暫保存，待分離乳酸菌。

1.3.2 乳酸菌的分離

當(dāng)天采集的酸菜樣品用無菌生理鹽水重懸，適當(dāng)梯度稀釋后涂布于含0.75% CaCO3的mMRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取周圍形成透明圈的菌落進(jìn)行純化，革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株初步確定為疑似乳酸菌。

1.3.3 菌株的鑒定

記錄疑似乳酸菌分離株的菌落及菌體細(xì)胞特征，參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行16S rDNA基因的擴(kuò)增、測(cè)序，并通過MEGA5.1軟件與乳桿菌屬內(nèi)模式菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合pheS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行種間與種內(nèi)的鑒定，pheS基因擴(kuò)增引物及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件參照文獻(xiàn)[11]。

1.3.4 酸與膽汁耐受性測(cè)定

通過pH 2.0、2.5和pH 3.0酸性環(huán)境，或0.3 g/100 mL和0.5 g/100 mL牛膽汁脅迫環(huán)境下菌株的存活情況分別評(píng)價(jià)菌株的酸和膽汁耐受性。傳代3 次活化的菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后離心獲取菌泥，分別用與發(fā)酵液等體積不同脅迫環(huán)境條件的mMRS液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用平板菌落計(jì)數(shù)法分別檢測(cè)0、1、2、3 h的活菌數(shù)，從而確定其對(duì)酸或膽汁的耐受能力。

1.3.5 自動(dòng)聚集能力測(cè)定

菌株自動(dòng)聚集能力評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)[12]方法，以自動(dòng)聚集百分比表示。菌株在mMRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)物旋渦振蕩2 min，取1 mL檢測(cè)細(xì)菌懸浮液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A0），隨后室溫靜置，分別于振蕩后30、60、90、120、150 min取1 mL上層清液測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處吸光度，記為At。不同時(shí)間點(diǎn)菌株自動(dòng)聚集百分比計(jì)算如式（1）所示：

1.3.6 體外降膽固醇特性的檢測(cè)

菌株經(jīng)mMRS液體培養(yǎng)基活化后，按1%接種至含0.3 g/100 mL牛膽汁和100 μg/mL膽固醇的mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后離心獲取上清液，采用鄰苯二甲醛法[13]分別檢測(cè)接種前后培養(yǎng)基中膽固醇含量，并按式（2）計(jì)算菌株的膽固醇去除率[14]：

式中：C0為未接種乳酸菌培養(yǎng)上清液膽固醇質(zhì)量濃度；C1為接種乳酸菌培養(yǎng)上清液膽固醇質(zhì)量濃度。

1.3.7 發(fā)酵液中GABA的測(cè)定

菌株在mMRS液體培養(yǎng)基中傳代3 次活化后，按1%接種至含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供GABA檢測(cè)分析。GABA檢測(cè)采用異硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液相色譜法，衍生化處理及色譜條件參照文獻(xiàn)[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌株的分離

采集的傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜樣品經(jīng)mMRS選擇性培養(yǎng)基分離篩選，共分離到可在含0.75% CaCO3的mMRS固體培養(yǎng)基上形成透明圈菌落、革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的疑似乳酸菌9 株，分離結(jié)果如圖1所示。生長(zhǎng)速度是篩選工業(yè)發(fā)酵劑菌種的重要指標(biāo)之一，故選取了其中1 株在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最快的菌株HUCM115進(jìn)行深入研究。

圖1 酸菜樣品中乳酸菌的分離Fig.1 Flow chart of isolation of lactic acid bacteria from traditional pickled Chinese cabbage

2.1.2 形態(tài)學(xué)特征

菌株HUCM115在mMRS固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基分別于37 ℃培養(yǎng)24 h，其生長(zhǎng)情況及革蘭氏染色觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)特征如圖2所示。菌株HUCM115在mMRS瓊脂培養(yǎng)基上形成為圓形，表面光滑有光澤，邊緣完整，低凸，質(zhì)地黏稠，乳白色，菌落不透明；菌體細(xì)胞為短桿，兩端鈍圓，單在、成對(duì)排列，偶見成鏈；液體培養(yǎng)24 h呈混濁生長(zhǎng)，但上層較澄清，底部有厚層沉淀，上下層界限明顯。

2.1.3 16 S rDNA序列比對(duì)分析

菌株HUCM115的16S rDNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、純化并測(cè)序，其16S rDNA基因序列經(jīng)BLAST后發(fā)現(xiàn)與乳桿菌屬內(nèi)菌種的同源性最高。利用MEGA5.1軟件，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的乳桿菌屬內(nèi)模式菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行序列比較，并以非同屬的Escherchia coli模式菌株為外標(biāo)，繪制出系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株HUCM115與Lactobacillus plantarum和L.pentosus模式株的親緣關(guān)系最近，序列相似性均大于98%，故通過16S rDNA基因序列比對(duì)分析尚無法確定菌株HUCM115的具體種。因此，選擇pheS基因序列進(jìn)一步比對(duì)分析。

2.1.4pheS基因序列比對(duì)分析

為了進(jìn)一步確定菌株HUCM115種的歸屬，其pheS基因被進(jìn)一步擴(kuò)增及測(cè)序，經(jīng)BLAST后發(fā)現(xiàn)其pheS基因序列同樣與乳桿菌屬內(nèi)菌種的同源性最高。同樣利用MEGA5.1軟件，以非同屬的Hellcobacter pylori模式菌株為外標(biāo)，與已知的乳桿菌屬內(nèi)模式菌株的pheS基因序列進(jìn)行比較分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于pheS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on pheS gene sequences

基于pheS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株HUCM115與L.plantarum模式株的親緣關(guān)系最近，且序列相似性為100%。

因此，鑒于形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA和pheS基因序列比對(duì)分析結(jié)果，可確定HUCM115菌株為植物乳桿菌。

2.2 菌株HUCM115的酸耐受性

圖5 植物乳桿菌HUCM115在酸性環(huán)境下的存活情況Fig.5 Viability of L.plantarum HUCM115 under acidic conditions

菌株HUCM1115分別在pH 2.0、2.5和pH 3.0環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)3 h，不同培養(yǎng)時(shí)間活菌數(shù)變化情況如圖5所示。在pH 3.0和pH 2.5酸性環(huán)境下保持3 h前后活菌數(shù)無顯著變化（P＞0.05），仍維持在109CFU/mL水平；pH 2.0酸性環(huán)境對(duì)菌株HUCM115的存活影響較大，培養(yǎng)1 h后活菌數(shù)從1.9×109CFU/mL降為8.4×107CFU/mL，而培養(yǎng)2 h后則無活菌檢出。

2.3 菌株HUCM115的膽汁耐受性

圖6 膽汁對(duì)植物乳桿菌HUCM115存活力的影響Fig.6 Effect of bile on the viability of L.plantarum HUCM115

如圖6所示，不論在0.3 g/100 mL還是0.5 g/100 mL膽汁環(huán)境下，菌株HUCM115培養(yǎng)1、2、3 h后活菌數(shù)與0 h相比均無顯著差異（P＞0.05），這說明菌株HUCM115處于膽汁質(zhì)量濃度低于0.5 g/100 mL環(huán)境時(shí)，其菌種活力不會(huì)受到任何影響。

2.4 菌株HUCM115的自動(dòng)聚集能力

圖7 植物乳桿菌HUCM115的自動(dòng)聚集能力Fig.7 Auto-aggregation capacity of L.plantarum HUCM115

由圖7可知，植物乳桿菌HUCM115培養(yǎng)物經(jīng)振蕩后發(fā)生了迅速沉降，室溫靜置30 min自動(dòng)聚集百分比為15.4%，而靜置60 min則達(dá)到近70%，此時(shí)細(xì)菌懸浮液上層溶液呈澄清狀態(tài)，之后自動(dòng)聚集百分比則趨于平穩(wěn)無顯著變化，到第150分鐘時(shí)自動(dòng)聚集百分比為72.4%。

2.5 菌株HUCM115體外去除膽固醇作用

未接種與接種植物乳桿菌HUCM115的含膽固醇培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h后，分別測(cè)定培養(yǎng)上清液的膽固醇含量，結(jié)果如表1所示。植物乳桿菌HUCM115培養(yǎng)在含膽固醇培養(yǎng)基中24 h后，培養(yǎng)基中20.6%膽固醇被去除，說明該菌株具有潛在的降膽固醇特性。

表1 植物乳桿菌HUCM115的膽固醇去除能力Table 1Cholesterol-removal ability of L.plantarum HUCM115

2.6 菌株HUCM115產(chǎn)GABA的能力

在富含谷氨酸的培養(yǎng)基中，接種菌株HUCM115培養(yǎng)48 h后，用高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中GABA含量，色譜如圖8所示。利用外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行定量可知，植物乳桿菌HUCM115于37 ℃培養(yǎng)在含1%谷氨酸的TYG培養(yǎng)基中，孵育48 h后發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度可達(dá)（101.3±0.8） μg/mL。

圖8 植物乳桿菌HUCM115發(fā)酵液（A）及GABA標(biāo)準(zhǔn)品（B）的高效液相色譜圖Fig.8 HPLC profiles of fermented broth of L.plantarum HUCM115 (A)and GABA standard (B)

3 討 論

東北酸菜是一種賦有地域特色的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，具有悠久的食用歷史，集獨(dú)特的風(fēng)味、口感、營(yíng)養(yǎng)于一身，這與其富含的優(yōu)勢(shì)菌群密切相關(guān)，從采集的傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜中分離篩選到1 株具有絕對(duì)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的植物乳桿菌，并對(duì)其益生特性進(jìn)行研究。乳酸菌體內(nèi)發(fā)揮益生功能的前提是能耐受胃液和膽汁脅迫，并以相當(dāng)數(shù)量活菌黏附定植到腸道。人體空腹時(shí)胃液酸度通常為pH 1.0～2.0，攝食后則會(huì)上升至pH 5.0以上，食物在胃內(nèi)消化時(shí)間大約為2～4 h[16]，故選取pH 2.0、2.5和pH 3.0三種酸性環(huán)境處理3 h評(píng)價(jià)植物乳桿菌HUCM115的酸耐受能力，其在pH 3.0酸性環(huán)境維持3 h活菌數(shù)無變化，而pH 2.0和pH 2.5環(huán)境下活菌數(shù)出現(xiàn)不同程度降低，尤以pH 2.0影響最大，故該菌株及其制劑適宜餐后攝入。膽汁可使細(xì)菌細(xì)胞膜溶出從而起到抗菌作用[17]，其腸道內(nèi)生理含量通常為0.5%[18]，而植物乳桿菌HUCM115對(duì)其展現(xiàn)出了明顯抗性。乳酸菌的自動(dòng)聚集能力與其黏附性正相關(guān)，可作為益生菌黏附能力篩選指標(biāo)之一[12,19]，菌株HUCM115的自動(dòng)聚集能力強(qiáng)于商業(yè)化菌株鼠李糖乳桿菌GG和嗜酸乳桿菌NCFM[12]。由此說明，植物乳桿菌HUCM115具備耐受胃液和膽汁脅迫并黏附到腸道的潛能。

人體血清膽固醇水平過高是引發(fā)心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，動(dòng)物及人體臨床研究已證實(shí)乳酸菌具有降膽固醇作用[20-21]，通常情況下體外可去除膽固醇的乳酸菌在體內(nèi)也會(huì)表現(xiàn)出良好的降膽固醇作用[22-23]，因此體外篩選降膽固醇乳酸菌具有重要意義。乳酸菌對(duì)膽汁的耐受性與其膽酸鹽水解酶（bile salts hydrolase，BSH）活性有關(guān)[24-25]，并可通過BSH活性機(jī)制實(shí)現(xiàn)體外/體內(nèi)降膽固醇作用[2,26]，故推測(cè)高膽汁抗性的菌株HUCM115可能具有BSH活性進(jìn)而降膽固醇，結(jié)果顯示植物乳桿菌HUCM115可將培養(yǎng)基中1/5的膽固醇去除，其膽固醇去除能力與Li Yang等[22]報(bào)道的植物乳桿菌相當(dāng)，但其體外去除膽固醇的確切機(jī)理仍需進(jìn)一步研究確定。

GABA的產(chǎn)生有利于維持微生物細(xì)胞內(nèi)pH值的穩(wěn)態(tài)平衡，從而使其可耐受酸脅迫環(huán)境[27]，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有谷氨酸脫羧酶活性可催化L-谷氨酸脫羧生成GABA[28]，故對(duì)可耐酸的HUCM115菌株產(chǎn)GABA能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。GABA是一種在自然界分布廣泛的非蛋白質(zhì)氨基酸，為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可抑制血壓升高、減少抑郁的發(fā)生等[29-30]，這表明可產(chǎn)GABA的植物乳桿菌HUCM115在降血壓及緩解抑郁等方面可能具有一定的潛在價(jià)值。總之，植物乳桿菌HUCM115可作為候選益生菌株用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究以深入探究其益生功能及機(jī)制。

4 結(jié) 論

從東北酸菜中分離到1 株植物乳桿菌HUCM115，具有良好的酸和膽汁耐受性及自動(dòng)聚集能力，37 ℃發(fā)酵24 h后培養(yǎng)基中膽固醇去除率可達(dá)20.6%，發(fā)酵48 h后GABA質(zhì)量濃度可積累至101.3 μg/mL，展現(xiàn)出了優(yōu)良的益生特性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。