閆曉彤，羅小娟，潘潔茹，葉海梅，林 侃，李長(zhǎng)城，方 婷,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福州市疾病控制預(yù)防中心，福建 福州 350004）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）作為一種新興的致病菌是在動(dòng)物與人腸道中寄生的一種無(wú)芽孢、兼性厭氧、有鞭毛的桿狀革蘭氏陰性菌[1]。C.sakazakii來(lái)源廣泛，在多種食品中均有分離檢出，包括嬰兒食品[2]、生鮮食品[3]、加工食品[4]、草本植物[5]等。同時(shí)，C.sakazakii也是一種具有嚴(yán)重危害性的食源性致病菌，可能導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎和壞死性腸炎等[6-7]，導(dǎo)致可能危及生命的慢性后遺癥[8]，主要發(fā)生在早產(chǎn)兒和免疫功能低下的嬰兒中。但是盡管新生兒感染的問題很突出，C.sakazakii感染也會(huì)發(fā)生在成年人群中，尤其是患有嚴(yán)重潛在疾病或惡性腫瘤的人群[9]。

許多菌細(xì)胞在生長(zhǎng)繁殖過程中能夠合成一種具有擴(kuò)散性的小分子化學(xué)物質(zhì)并滲透到細(xì)胞外，隨細(xì)菌密度的不斷增大，小分子化學(xué)物質(zhì)的濃度達(dá)到臨界閾值，此時(shí)細(xì)菌通過一種稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[10-11]的調(diào)控機(jī)制感應(yīng)小分子化學(xué)物質(zhì)，并啟動(dòng)一系列靶基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)交流過程。細(xì)菌分泌毒力因子、產(chǎn)生抗菌素或生物被膜等行為在細(xì)菌的生存過程中起著至關(guān)重要的作用[12-14]，這些行為都與QS現(xiàn)象密切相關(guān)。QS是一種依賴于密度的機(jī)制，在繁殖過程中產(chǎn)生的小分子化學(xué)物質(zhì)稱為自體誘導(dǎo)物（autoinducer，AI）[15-16]。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，N-acyl-HSL，也寫作AHLs）是革蘭氏陰性菌QS中最常見的AI[17]，但通常情況下細(xì)菌所產(chǎn)生的N-acyl-HSL物質(zhì)含量極低，對(duì)該物質(zhì)的檢測(cè)存在一定困難，UPLC-MS/MS技術(shù)就是一種檢測(cè)AHLs類AI的一種有效手段[18]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測(cè)液體AHLs信號(hào)分子最快速并可靠的方法[19]。目前，已有研究通過信號(hào)分子探討AHLs與其生物被膜形成的關(guān)系[20]，根據(jù)菌QS信號(hào)分子的產(chǎn)生探討其對(duì)食品腐敗的影響[21]。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌產(chǎn)生的信號(hào)分子等物質(zhì)與遺傳、環(huán)境因素一起參與了細(xì)菌生物膜的形成[22]，而細(xì)菌的生物膜對(duì)于抗菌藥物和宿主防御體系具有天然的抵抗力[23]，如紫外線、滲透壓力、高溫、抗生素、吞噬細(xì)胞和噬菌體等[24]。因此，本研究通過對(duì)不同時(shí)間段C.sakazakii所合成的C14-HSL信號(hào)分子實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合預(yù)測(cè)微生物模型，追蹤C(jī).sakazakii生長(zhǎng)周期中AI的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，為進(jìn)一步闡述該菌的生長(zhǎng)機(jī)制提供新的思路。預(yù)測(cè)微生物學(xué)屬于應(yīng)用食品科學(xué)領(lǐng)域，該學(xué)科應(yīng)用數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)食品在加工、運(yùn)輸、分配以及貯藏過程中經(jīng)歷復(fù)雜的物理、化學(xué)以及生物變化后微生物的生長(zhǎng)與存活情況[25]。預(yù)測(cè)模型可以用來(lái)評(píng)估食品加工的風(fēng)險(xiǎn)，通過預(yù)測(cè)致病菌與腐敗菌的行為從而實(shí)施控制措施以保證食品的安全性。作為一個(gè)新興領(lǐng)域，預(yù)測(cè)微生物學(xué)已成為預(yù)測(cè)食品保質(zhì)期、質(zhì)量控制以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的有用工具[26]。目前已開發(fā)出多種用于描述細(xì)菌生長(zhǎng)的不同類別的預(yù)測(cè)微生物模型，IPMP（Integrated Pathogen Modeling Program）多應(yīng)用于病原菌的生長(zhǎng)模型，是美國(guó)農(nóng)業(yè)部開發(fā)的預(yù)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)的模型軟件，使用者輸入酸堿度、溫度、水分活度等影響細(xì)菌生長(zhǎng)的因素以及初始菌數(shù)，即可獲得細(xì)菌生長(zhǎng)曲線以及生長(zhǎng)的重要條件和生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。

本研究選用C.sakazakiiCICC21550菌株為研究對(duì)象，通過測(cè)定C.sakazakii生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的C14-HSL信號(hào)分子濃度的變化，將IPMP 2013程序引入C.sakazakii的QS研究中，結(jié)合宏觀生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，探究C.sakazakii的生長(zhǎng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株C.sakazakiiCICC21550購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保存于液氮罐中。Agrobacterium tumefaciensNTL4（pZLR4）是人工誘導(dǎo)的突變菌株，含有pZLR4質(zhì)粒，在培養(yǎng)過程中需添加50 μg/mL的慶大霉素，但在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中不添加。該菌主要用來(lái)初步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)菌株是否能夠合成長(zhǎng)酰基側(cè)鏈的AHLs。A.tumefaciensNTL4 （pAoF64/95trac）自身能夠產(chǎn)生AHLs類信號(hào)分子，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，所以檢測(cè)過程中該菌應(yīng)用于傳感菌A.tumefaciensNTL4（pZLR4）的陽(yáng)性對(duì)照。這2 株根癌農(nóng)桿菌均由Stephen K.Farrand教授（美國(guó)伊利諾伊大學(xué)）饋贈(zèng)。

C.sakazakii的活化與生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)使用Luria-Bertani（LB）肉湯，每升含酵母膏粉5 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、最終pH 7.0±0.2；C.sakazakii單菌落保存于結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）中，每升含氯化鈉5.0 g、3號(hào)膽鹽1.5 g、葡萄糖10.0 g、蛋白胨7.0 g、中性紅0.03 g、酵母提取物3.0 g、結(jié)晶紫0.002 g、瓊脂12 g、最終pH 7.4±0.2 福州市伯樂林生物科技有限公司；1‰的蛋白胨培養(yǎng)基（peptone water，PW） 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。各培養(yǎng)基在使用之前均使用高壓蒸汽滅菌鍋于121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后使用。

C14-HSL、X-Gal、慶大霉素 美國(guó)Sigma公司；乙酸乙酯、氯化氫等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Aquity超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司；SP-2300A2光吸收型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 上海閃譜生物有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；SW-CJ-2D微生物用超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-500W電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；H-1850R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SHP-250低溫生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；QL-866渦旋振蕩器 海門市其林貝儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將菌株C.sakazakiiCICC21550從保種管中取出，劃線于VRBGA上進(jìn)行隔夜活化。將活化后的單菌落利用無(wú)菌接種環(huán)轉(zhuǎn)移至10 mL的新鮮LB肉湯中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)（130 r/min）過夜，使其恢復(fù)生長(zhǎng)。之后，菌懸液在4 ℃條件下利用離心機(jī)使菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分離，其中轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，時(shí)間10 min。用10 mL的PW重懸菌細(xì)胞洗去其表面毒素，再次重復(fù)上述離心過程，棄去上清液。重復(fù)洗菌步驟1 次后，用10 mL的1‰ PW重懸菌細(xì)胞，混勻，用1‰ PW將菌液進(jìn)行梯度稀釋至102～103CFU/mL，備用。

1.3.2 生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)與計(jì)數(shù)

將LB肉湯分裝于各試管中（10 mL/管），于121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻至室溫后使用。將0.1 mL前述所備好的C.sakazakiiCICC21550菌懸液分別接種至各試管中，于37 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按一定時(shí)間間隔取樣測(cè)定C.sakazakii菌數(shù)。每個(gè)條件下細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線至少需要10 個(gè)以上的取樣點(diǎn)。在測(cè)定菌落數(shù)時(shí)，將樣液利用已滅菌的1‰ PW進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尯笸坎加赩RBGA中，每個(gè)平板作2 個(gè)平行。將涂布好的平板37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2 次，每次實(shí)驗(yàn)采用不同批次的C.sakazakii菌懸液。

1.3.3C.sakazakiiAHLs信號(hào)分子的生物鑒定

實(shí)驗(yàn)前一天，使用無(wú)菌接種環(huán)分別挑取固體培養(yǎng)基中C.sakazakiiCICC21550、A.tumefaciensNTL4（pZLR4）、A.tumefaciensNTL4 （pAoF64/95trac）的單菌落至10 mL的LB肉湯中，于28 ℃的恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)速130 r/min。取3 支試管分別編號(hào)1、2、3：

試管1：作為陽(yáng)性對(duì)照，分別添加A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液30 μL、X-Gal（50 mg/mL）的二甲基甲酰胺溶液20 μL、A.tumefaciensNTL4（pAoF64/95trac）菌液30 μL、LB肉湯3 mL；試管2：作為陰性對(duì)照，分別添加A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液30 μL、X-Gal（50 mg/mL）的二甲基甲酰胺溶液20 μL、LB肉湯3 mL；試管3：作為實(shí)驗(yàn)組，分別添加A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液30 μL、X-Gal（50 mg/mL）的二甲基甲酰胺溶液20 μL、C.sakazakiiCICC21550菌液30 μL、LB肉湯3 mL。所有實(shí)驗(yàn)均作2 次平行，各試管于28 ℃的恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化。

1.3.4 不同生長(zhǎng)階段C.sakazakiiAHLs粗提液的制備

C.sakazakiiCICC21550菌株按一定時(shí)間間隔培養(yǎng)不同時(shí)間后，通過離心將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分離，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液。添加適量的NaCl于上清液中，搖勻，用400 mL乙酸乙酯萃取上清液，使AHLs信號(hào)分子充分溶解于乙酸乙酯中，分離兩相并收集有機(jī)相。同樣步驟繼續(xù)萃取2 次，混合2 次萃取的有機(jī)相后添加適量的無(wú)水硫酸鎂除去殘留水相，抽濾分離，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于30 ℃的條件下蒸干溶劑，用甲醇溶解附著于旋蒸瓶?jī)?nèi)壁的AHLs信號(hào)分子粗提物，定容至5 mL，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 不同生長(zhǎng)階段C.sakazakiiAHLs活性的檢測(cè)

利用β-半乳糖苷酶法檢測(cè)不同生長(zhǎng)階段C.sakazakiiAHLs信號(hào)分子的活性。首先，使用無(wú)菌接種環(huán)挑取LB瓊脂培養(yǎng)基中A.tumefaciensNTL4（pZLR4）單菌落至10 mL的LB肉湯中，于28 ℃過夜活化2 次后，將A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液稀釋至OD600nm為0.5備用。分裝上述菌液至高壓滅菌后的離心管中（10 mL），分別將不同生長(zhǎng)階段下C.sakazakiiAHLs粗提液100 μL添加至含A.tumefaciensNTL4（pZLR4）菌液的各離心管中，于28 ℃培養(yǎng)6～8 h至OD600nm為1.0。β-半乳糖苷酶活性根據(jù)Miller等[27]的方法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)生長(zhǎng)階段下C.sakazakiiAHLs活性的檢測(cè)均作3 次平行，結(jié)果以±s表示。

1.3.6 UPLC-MS/MS定量檢測(cè)C.sakazakiiC14-HSL信號(hào)分子

色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫為35 ℃；分析時(shí)間7 min；進(jìn)樣體積為5 μL；流速為200 μL/min；流動(dòng)相：A為甲醇，B為5 mmol/L含有0.1%甲酸的乙酸銨溶液。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)；應(yīng)用正離子掃描模式；離子源溫度為150 ℃；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；載氣為氮?dú)?，其流速?00 L/min；應(yīng)用氬氣為碰撞氣，流速為0.2 mL/min。

1.3.7 數(shù)據(jù)擬合與模型建立

軟件IPMP 2013是一種界面友好型的綜合數(shù)據(jù)分析工具，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部東部地區(qū)研究中心開發(fā)而得。該軟件操作簡(jiǎn)單，不需用戶掌握復(fù)雜的編程知識(shí)，圖1為IPMP 2013軟件的工作界面，分析數(shù)據(jù)時(shí)只需將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入并選擇相應(yīng)模型即可獲得數(shù)據(jù)擬合曲線以及數(shù)據(jù)分析報(bào)告。

本實(shí)驗(yàn)采用Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型分別擬合37 ℃C.sakazakiiCICC21550在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)以及同溫度不同時(shí)間條件下C14-HSL信號(hào)分子的濃度數(shù)據(jù)，建立37 ℃條件下C.sakazakiiCICC21550生長(zhǎng)的一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型及C14-HSL信號(hào)分子的擬合模型。此外，結(jié)合C.sakazakiiCICC21550生長(zhǎng)的一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型及模型擬合參數(shù)，進(jìn)一步從微觀角度（C14-HSL信號(hào)分子的擬合模型）探究C.sakazakii的生長(zhǎng)機(jī)制。

圖1 IPMP 2013的圖形用戶界面Fig.1 Graphical user interface of IPMP 2013

2 結(jié)果與分析

2.1 A.tumefaciens NTL4（pZLR4）檢測(cè)AHLs信號(hào)分子

在提取C.sakazakiiAHLs信號(hào)分子之前，利用A.tumefaciensNTL4（pZLR4）生物傳感菌再次驗(yàn)證C.sakazakiiCICC21550能夠產(chǎn)生AHLs類AI。如圖2所示，在底物X-Gal的存在下，C.sakazakiiCICC21550能使生物傳感菌A.tumefaciensNTL4（pZLR4）產(chǎn)生藍(lán)綠色反應(yīng)。該顏色的產(chǎn)生表明C.sakazakiiCICC21550能夠合成AHLs類AI。

圖2 A.tumefaciens NTL4（pZLR4）對(duì)AHLs信號(hào)分子的生物鑒定Fig.2 Bioassays with A.tumefaciens NTL4 (pZLR4) for detection of AHLs signal molecules

2.2 不同生長(zhǎng)階段C.sakazakii AHLs活性的變化

A.tumefaciensNTL4（pZLR4）含pZLR4質(zhì)粒，在外源?；L(zhǎng)鏈AHLs存在時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，水解X-Gal產(chǎn)生藍(lán)綠色。當(dāng)外源N-?；呓z氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子的濃度越大，A.tumefaciensNTL4（pZLR4）所表達(dá)的β-半乳糖苷酶的活性越強(qiáng)，因此，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中β-半乳糖苷酶的活性變化在一定程度上可間接反映N-?；呓z氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子的含量多少。如圖3所示，C.sakazakiiCICC21550生長(zhǎng)期間AHLs的活性檢測(cè)表明，不同培養(yǎng)時(shí)間下C.sakazakiiCICC21550所合成的AHLs的活性存在差異。此外，AHLs的活性隨細(xì)菌細(xì)胞密度的增大而增大，具有密度依賴性，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)最大值（18 h）時(shí)，C.sakazakiiCICC21550所合成的AHLs的活性達(dá)最大，隨后細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖處于穩(wěn)定期甚至衰亡期，C.sakazakii所合成的AHLs的活性逐漸下降。

圖3 C.sakazakii CICC21550生長(zhǎng)期間AHLs活性與菌落數(shù)的關(guān)系Fig.3 Relationship between AHL activities and bacterial counts during the growth of C.sakazakii CICC21550

2.3 37 ℃條件LB液體培養(yǎng)基中C.sakazakii的生長(zhǎng)擬合曲線

圖4 37 ℃條件下LB中C.sakazakii生長(zhǎng)的一級(jí)擬合曲線Fig.4 Growth curves fitted to different primary models of C.sakazakii in LB medium at 37 ℃

表2 37 ℃條件下LB中C.sakazakii的一級(jí)模型擬合參數(shù)Table 2 Parameters of different primary models for C.sakazakii growth in LB medium at 37 ℃

Huang模型、Baranyi模型以及Gompertz模型的擬合參數(shù)AIC以及RMSE數(shù)值越小表示數(shù)據(jù)在模型中的擬合度越高。結(jié)合模型擬合曲線（圖4）可發(fā)現(xiàn)，Huang模型及Baranyi模型具有較高的擬合度。此外，根據(jù)擬合參數(shù)（表2），Huang模型的AIC以及RMSE數(shù)值均小于Baranyi模型與Gompertz模型。由此可見，Huang模型是37 ℃條件下C.sakazakiiCICC21550在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最佳擬合模型。

2.4 37 ℃條件下C.sakazakii的生長(zhǎng)過程中C14-HSL濃度變化的擬合曲線

圖5 37 ℃條件下C.sakazakiiC14-HSL的一級(jí)模型擬合曲線Fig 5 Curves of C14-HSL secreted by C.sakazakii at 37 ℃ againstbacterial growth time fitted to different primary models

表3 37 ℃條件下C.sakazakiiC14-HSL的一級(jí)模型擬合參數(shù)Table 3Parameters of different primary models for C14-HSL secreted by C.sakazakii at 37 ℃

為進(jìn)一步從微觀角度探究C.sakazakii的生長(zhǎng)機(jī)制，根據(jù)UPLC-MS/MS定量檢測(cè)AHLs的方法，檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間條件下C.sakazakiiCICC21550所合成的C14-HSL信號(hào)分子的濃度，應(yīng)用Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型擬合C14-HSL濃度數(shù)據(jù)，擬合曲線如圖5所示。C14-HSL信號(hào)分子的濃度隨C.sakazakiiCICC21550的生長(zhǎng)具有一定規(guī)律性，呈先上升后下降的趨勢(shì)。根據(jù)模型擬合參數(shù)（表3），Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型對(duì)C14-HSL均具有較好的擬合度，各擬合模型曲線具有明顯的遲滯期。其中，Baranyi模型的RMSE和AIC的值分別為0.268和-16.449；Huang模型的RMSE和AIC的值分別為0.238和-19.356；Gompertz模型的RMSE和AIC的值分別為0.376和-8.345。當(dāng)RMSE和AIC的值越小說明曲線的擬合性越好，所以由以上數(shù)據(jù)可知Baranyi模型可以很好的模擬37 ℃條件下C.sakazakii的生長(zhǎng)過程中C14-HSL濃度變化的曲線。通過Baranyi模型擬合得到的C14-HSL信號(hào)分子的最大濃度Ymax的值為8.535，最大生成速率μmax的值為0.825。

可見，IPMP程序不僅適用于細(xì)菌生長(zhǎng)的模型擬合，對(duì)于微觀角度細(xì)菌QS的AI模型擬合同樣適用。此外，結(jié)合37 ℃ LB液體培養(yǎng)基中C.sakazakii的生長(zhǎng)擬合模型，對(duì)比表2與表3的擬合參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)C14-HSL信號(hào)分子的產(chǎn)生與細(xì)菌的生長(zhǎng)存在正相關(guān)，并且C14-HSL信號(hào)分子產(chǎn)生的遲滯期明顯比C.sakazakiiCICC21550細(xì)菌生長(zhǎng)的遲滯期長(zhǎng)，可見細(xì)菌QS系統(tǒng)的啟動(dòng)要建立在細(xì)菌生長(zhǎng)適應(yīng)環(huán)境之后的基礎(chǔ)上。劉國(guó)榮等[28]在分析菌體密度和細(xì)菌素合成的相關(guān)性時(shí)表明，當(dāng)菌體細(xì)胞達(dá)到活菌數(shù)為7.31（lg（CFU/mL））時(shí)，細(xì)菌素才開始合成。發(fā)酵過程中，菌體密度與細(xì)菌素的合成呈現(xiàn)正相關(guān)性。朱軍莉等[29]研究表明，大黃魚在4 ℃貯藏初期表現(xiàn)出AI-2信號(hào)分子活性，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌的增殖，AI-2信號(hào)分子強(qiáng)度也逐漸增加。李燦等[30]對(duì)凡納濱對(duì)蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的QS信號(hào)分子測(cè)定表明，AHLs活性與菌體生長(zhǎng)密度呈正相關(guān)，AI-2產(chǎn)生量在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期累積，在菌體生長(zhǎng)24 h后活性迅速減弱。這些研究都進(jìn)一步表明，調(diào)節(jié)細(xì)菌QS現(xiàn)象的信號(hào)分子與細(xì)菌的密度存在正相關(guān)關(guān)系，QS現(xiàn)象發(fā)生在細(xì)菌密度達(dá)到一定數(shù)值的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步驗(yàn)證，細(xì)菌QS系統(tǒng)的啟動(dòng)可能要建立在細(xì)菌生長(zhǎng)適應(yīng)環(huán)境之后的基礎(chǔ)上。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要探究C.sakazakii生長(zhǎng)過程中C14-HSL信號(hào)分子的合成規(guī)律，利用IPMP程序建立了阪崎腸桿菌數(shù)量、C14-HSL信號(hào)分子與時(shí)間的關(guān)系，追蹤C(jī).sakazakii生長(zhǎng)周期中AI的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，結(jié)合細(xì)菌生長(zhǎng)的宏觀模型，為進(jìn)一步闡述該菌的生長(zhǎng)機(jī)制提供新的思路。結(jié)果表明：1）C.sakazakiiCICC21550在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期就有檢出C14-HSL信號(hào)分子，在細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期達(dá)最大值，隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，具有明顯的密度依賴性。通過Baranyi模型擬合得到的C14-HSL信號(hào)分子的最大濃度Ymax的值為8.535，最大生成速率μmax的值為0.825。2）IPMP程序不僅適用于細(xì)菌生長(zhǎng)的模型擬合，對(duì)于微觀角度細(xì)菌QS的AI模型擬合同樣適用。Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型等一級(jí)模型對(duì)C14-HSL均具有較好的擬合度，各擬合模型曲線具有明顯的遲滯期，且遲滯期明顯比細(xì)菌生長(zhǎng)的長(zhǎng)。