魏 貞，韓彩靜，高云娜，樊占青，王亞南，王哲人，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

北京棒桿菌天冬氨酸激酶（Corynebacterium pekinenseaspartate kinase，CpAK）是一種新型的單體別構(gòu)酶[1]，受蘇氨酸（Thr）和賴氨酸（Lys）的協(xié)同反饋抑制[2]，致使天冬氨酸族氨基酸難以大量積累。與北京棒桿菌不同的是，AK在其他生物體內(nèi)有不同的存在形式和抑制機制，擬南芥（Arabidopsis thaliana）含有3 種單功能AK（AKI、AKII和AKIII）和2 種雙功能AKHSDH（I和II）[3-4]，其中AKI受Lys和甲硫氨酸（Met）的抑制[5-7]；大腸桿菌中含有1 種單功能AKIII和2 種雙功能AK-HSDHI、AK-HSDHII[8-9]，AK-HSDHI受Thr抑制[10]，AK-HSDHII受L型Met阻遏，而AKIII受Lys抑制[11]。谷氨酸棒桿菌AKII以協(xié)同方式被Lys和Thr抑制[12]。

由于AK在代謝途徑中受協(xié)同反饋調(diào)節(jié)，因此通過解除反饋抑制提高下游代謝產(chǎn)物產(chǎn)量成為研究熱點。目前對AK的改造主要通過質(zhì)粒重組[13-14]、基因敲除[15]、定點突變[16-19]等方式進行，其中定點突變技術(shù)應(yīng)用較普遍。Chen Zhen等[16]分析了谷氨酸棒桿菌AK調(diào)節(jié)域中的關(guān)鍵性殘基位點，利用定點突變技術(shù)對酶定向改造，從而削弱了Thr和Lys的協(xié)同反饋抑制作用。也有研究篩選出谷氨酸棒桿菌AK中抑制劑結(jié)合位點和底物結(jié)合位點周圍的關(guān)鍵殘基，獲得了解除Lys和Thr反饋抑制且酶活力提高的突變株R169Y、R169P、T379L和A380I，為優(yōu)化AK代謝途徑和構(gòu)建多突變體優(yōu)良菌株提供參考和依據(jù)[1,17-18]。

目前對CpAK的改造主要集中在抑制劑位點[18-23]，對其底物結(jié)合位點和ATP結(jié)合位點的改造鮮有文獻報道。AK催化反應(yīng)機理是將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物使底物磷酸化，因此ATP對酶活性具有重要作用[24]。Li Changcheng等[25]報道在銅綠假單胞菌AK中對ATP結(jié)合位點進行雙突變，D182/R184A酶活力降低到60%，證明ATP結(jié)合口袋對酶活力有重要影響。本研究選取ATP周圍的關(guān)鍵位點Tyr198和Asp201，對其進行定點飽和突變，采用高通量篩選獲得酶活力提高并解除反饋抑制的突變株，以期為解除AK反饋抑制提供可參考的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組大腸桿菌（pET-28a-AK/BL21）由吉林農(nóng)業(yè)大學發(fā)酵工程實驗室提供；大腸桿菌BL21（DE3） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

質(zhì)粒抽提試劑盒、Taq酶、核酸電泳Marker、DpnI酶大連TaKaRa公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；非變性鎳柱及柱料 美國GE公司；引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母浸粉，溶解于去離子水后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至中性，121 ℃滅菌20 min；LB固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)加1.8%瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司； Spectra Max 190酶標儀美國Molecular Devices公司；超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Z36HK低溫高速離心機 德國Hermle公司；蛋白印記轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司；SE260蛋白電泳儀、瓊脂糖凝膠成像儀 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計及定點飽和突變

利用Primer 5.0軟件對位點進行設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，雙突變體上游引物F-y198n/d201m：5’-CGGCATAGCGGTATTCACACCGT CAACG-3’；下游引物R-y198n/d201m：5’-CGTTGACG GTGTGAATACCGCTATGCCGC-3’。按照說明書提取質(zhì)粒pET-28a-AK，以pET-28a-AK為模板對其進行全質(zhì)粒擴增，反應(yīng)條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，18 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.2 擴增產(chǎn)物消化及轉(zhuǎn)化

1.3.1 節(jié)中PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖核酸電泳驗證成功后用DpnI酶消化，反應(yīng)體系為PCR產(chǎn)物2 μL、10×T Buffer 2 μL、DpnI酶0.3 μL、ddH2O 15.7 μL，37 ℃水浴2 h。

取1～2 μL消化產(chǎn)物加入BL21感受態(tài)細胞，冰浴30 min，42 ℃熱激42 s，再冰浴5 min后加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，6 000 r/min離心5 min，棄700 μL上清液，將剩余上清液與菌體吹打混勻后涂布LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.3.3 突變株高通量篩選及AK基因驗證

挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中擴大培養(yǎng)，加入終濃度為1 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導表達后進行高通量篩選，方法見文獻[20]，選取酶活力提高較高的突變株于5 mL LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。以菌液為模板，用克隆引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系及條件見文獻[26]，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖核酸電泳驗證，驗證成功的菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 AK誘導表達及蛋白純化

菌株活化后以2%接種量轉(zhuǎn)入100 mL LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，加入誘導劑IPTG（終濃度1 mmol/L）誘導8 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄去上清液收集菌體。粗酶液制備方法及純化方法參照文獻[23]，粗酶液和純化液經(jīng)SDS-PAGE和Western blot進行驗證，實驗步驟參考文獻[1]。

1.3.5 AK活力測定及動力學分析

反應(yīng)速率V定義為1 min內(nèi)1 mg酶的催化能力，單位為U/（mg·min），其中1 mL酶活力測定反應(yīng)體系參考文獻[18]，在反應(yīng)體系其他條件不變的情況下，改變底物濃度（分別為0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L）于540 nm波長處測其吸光度，并計算AK比活力，通過Origin 8.5軟件中的Hill方程V=VmaxSn/（Kn＋Sn）進行非線性擬合。

1.3.6 AK酶學性質(zhì)分析

1.3.6.1 最適溫度

反應(yīng)體系不變的情況下，在不同溫度（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50 ℃）反應(yīng)30 min，每組樣品3 次平行，最高酶活力定義為100%。

1.3.6.2 最適pH值

反應(yīng)體系不變的情況下，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中Tris-HCl緩沖液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），每組樣品3 次平行，最高酶活力定義為100%。

1.3.6.3 穩(wěn)定性

在最適溫度和最適pH值下，將AK純化酶液加入反應(yīng)體系中反應(yīng)30 min后測定酶活力，此時酶活力定義為100%，以后每隔1 h檢測酶活力，每組樣品3 次平行。

1.3.6.4 底物抑制劑對AK活力的影響

在反應(yīng)體系中加入不同底物抑制劑Lys、Thr、Met、Lys＋Thr、Lys＋Met、Thr＋Met、Lys＋Thr＋Met（終濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L），以檢測抑制劑對AK活力的影響，每組樣品3 次平行，不添加底物抑制劑的對照組相對酶活力定義為100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 ATP結(jié)合位點的篩選

采用Clustal X 1.81進行同源序列比對，比對結(jié)果用軟件ESPript 3.0進行修飾，并利用PyMOL軟件對AK模型進行分析，Tyr198位點和Asp201位點均為保守位點且位于ATP周圍，如圖1A、B所示。在前期研究基礎(chǔ)中，對CpAK突變體A380I利用Gromacs軟件進行動力學模擬（53A6力場描述蛋白質(zhì)和配體，配體參數(shù)由PRODRG2.5服務(wù)器提供），通過分子動力學模擬，發(fā)現(xiàn)殘基Tyr198與ATP之間的氫鍵占有率增加，其中ATP∶N5與Tyr198∶O之間氫鍵占有率由42.48%增加到54.35%，Tyr198∶CD1與ATP∶C10之間氫鍵占有率由0%增加到31.97%，從而與ATP交互作用增強，因此推測Tyr198位點是ATP周圍的關(guān)鍵位點[1]。通過模型空間結(jié)構(gòu)比對（圖1C），CpAK Asp201位點對應(yīng)于甲烷球菌AK（Methanococcus jannaschiiAK，MjAK）（PDB：2hmf）Asp239位點，而MjAK Asp239位點參與催化反應(yīng)。設(shè)想Asp201位點對于酶活力提高有重要作用[27]。因此在本研究中選取Tyr198和Asp201位點作為定點飽和突變位點。

圖1 ATP結(jié)合位點的篩選Fig.1 Selection of ATP binding sites

2.2 突變體構(gòu)建

以質(zhì)粒pET-28a-AK為模板，在Y198N/D201M的引物作用下進行定點飽和突變PCR擴增，如圖2A所示，在7 000 bp附近有條帶，初步證明突變成功。PCR產(chǎn)物經(jīng)消化酶DpnI處理后導入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過高通量篩選獲得高AK活力菌株，對菌液進行PCR驗證，在1 000～2 000 bp之間有單一明顯條帶，其與目的基因CpAK長度1 266 bp相符，表明目的基因AK實現(xiàn)了大量復制（圖2B）。測序結(jié)果如圖2C所示，AK氨基酸序列中198位點由Tyr突變成Asn，201位點由Asp突變成Met，即表明雙突變體Y198N/D201M構(gòu)建成功。

圖2 突變體Y198N/D201M的構(gòu)建Fig.2 Construction of mutant Y198N/D201M

2.3 SDS-PAGE和Western blot驗證

圖3 SDS-PAGE（A）及Western blot（B）結(jié)果Fig.3 Results of SDS-PAGE (A) and Western blot (B)

對WT和突變體菌株分別進行誘導表達及非變性鎳柱純化，將獲得的AK粗酶液和AK純化液進行SDS-PAGE及Western blot電泳驗證，結(jié)果如圖3所示。在48 kDa左右處均有明亮單一條帶，表明AK蛋白在誘導劑IPTG的作用下成功表達。

2.4 反應(yīng)動力學分析

圖4 WT和Y198N/D201M的動力學分析Fig.4 Kinetic analysis of WT and mutant Y198N/D201M

表1 WT AK及Y198N/D201M動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of WT AK and mutant Y198N/D201M

單體AK的反應(yīng)動力學符合Hill方程V=VmaxSn/（Kn＋Sn），是典型的別構(gòu)酶。Km值表示酶促反應(yīng)的初速率為最大速率Vmax一半時的底物濃度，單位一般為mmol/L或者μmol/L，Km只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。Vmax表示在一定酶量下的最大反應(yīng)速率，即酶完全被底物飽和時的反應(yīng)速度，與酶濃度呈正比[28]。n值表示希爾系數(shù)，代表協(xié)同性，其中n＜1表示負協(xié)同反應(yīng)：一旦一個配體分子結(jié)合到酶上，酶對其他配體的親和力就會減?。籲=1表示非協(xié)同反應(yīng)：酶對于一個配體分子的親和力并不取決于是否有配體分子已結(jié)合到其上；n＞1表示正協(xié)同反應(yīng)：一旦一個配體分子結(jié)合到酶上，酶對其他配體的親和力就會增大[29]。

對WT和突變體AK純化液分別進行酶促反應(yīng)動力學分析，結(jié)果如圖4和表1所示。WT AKn值為1.91，表明AK呈正協(xié)同性，突變體Y198N/D201M AK的n值為1.58，n值降低，表明突變后AK的正協(xié)同性降低；突變后AK的Km值由3.58 mmol/L降至2.37 mmol/L，表明突變使得AK與底物親和力增強；Y198N/D201M AK的Vmax為65.19 U/（mg·min），較WT AKVmax（3.57 U/（mg·min））提高到18.26 倍。

2.5 酶學性質(zhì)表征

2.5.1 溫度對AK活力的影響

由圖5A可知，WT AK最適溫度為25 ℃，突變體Y198N/D201M AK最適溫度為28 ℃，突變后最適溫度提高3 ℃，說明突變有效改善了AK的最適溫度。WT AK溫度敏感性高，可適溫度區(qū)間較小，當溫度高于35 ℃時，AK活力急劇下降，而突變體Y198N/D201M AK在15～45 ℃溫度范圍內(nèi)，相對酶活力仍保持在55%以上，說明突變后酶耐高溫性能增強。

圖5 WT和Y198N/D201M的酶學性質(zhì)表征Fig.5 Enzymatic properties of WT and mutant Y198N/D201M

2.5.2 pH值對AK活力的影響

由圖5B可知，WT AK最適pH值為8.0，突變后AK最適pH值由8.0降低至7.5，同時，耐受pH值區(qū)間也變廣，在pH 6.5～8.5范圍內(nèi)相對酶活力保持在70%以上，這將有利于菌株氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)。

2.5.3 AK穩(wěn)定性

在最適溫度和最適pH值的基礎(chǔ)上，測定酶的穩(wěn)定性，如圖5C所示。WT AK的半衰期為4.66 h，而Y198N/D201M AK的半衰期為5.32 h，較WT AK延長了0.66 h。在6 h時，突變體保持40%酶活力，直到10 h酶活力仍保持在20%以上，顯著高于WT AK（6 h時約保持20%酶活力，10 h時酶活力不到10%），表明突變體AK穩(wěn)定性更好。

2.5.4 底物抑制劑對AK活力的影響

表2 不同底物抑制劑條件下WT和Y198N/D201M的相對酶活力Table 2 Relative activity of WT and mutant Y198N/D201M in the presence of different substrate inhibitors%

從表2可知，WT AK受Lys和Thr反饋抑制，隨抑制劑Lys或Thr濃度的增加抑制作用逐漸增強，當抑制劑Lys或Thr濃度為10 mmol/L時，WT AK的相對酶活力分別為40.60%和44.47%，抑制率分別約為60%和55%。當Met單獨存在時，對酶的抑制作用較弱，抑制率為20%～30%。當2 種抑制劑同時存在時，Lys＋Thr抑制率最強達到約72%，Lys＋Met或Thr＋Met最大抑制率約為48%和40%，說明AK主要受Lys和Thr的抑制，這與文獻報道一致[30]。當3 種抑制劑同時存在時，最大抑制率約為62%。突變后，在不同濃度抑制劑存在下，突變體Y198N/D201M AK均被明顯激活，特別是在10 mmol/L的Lys＋Met、Thr＋Met、Lys＋Thr＋Met存在時，Y198N/D201M AK相對酶活力分別為117.67%、113.80%和115.66%，除5 mmol/L的底物抑制劑Lys＋Thr＋Met外，AK激活作用隨著抑制劑濃度增大而增強，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。這與動力學數(shù)據(jù)結(jié)果（Km和n值減小，Vmax增大）一致，亦說明本研究選取的Tyr198和Asp201為影響酶活力的關(guān)鍵位點。

3 討 論

張芷睿等[22]對CpAK抑制劑結(jié)合位點Gln316位點進行突變，突變體Q316P較WT提高8.53 倍，并通過軟件分析發(fā)現(xiàn)突變后抑制劑對AK抑制作用減弱，但未對突變株酶活力提高機制進行探討。Min Weihong等[17]對CpAK通過虛擬篩選得出R169是一個抑制劑結(jié)合、底物結(jié)合和催化反應(yīng)的重要位點，因此通過定點飽和突變對其進行改造，其中R169Y酶活力提高4.71 倍，亦未對突變株酶活力提高機制進行探討。Han Caijing等[1]對抑制劑結(jié)合位點A380進行突變，獲得了酶活力提高11.32 倍的突變株A380I，用分子動力學模擬探討突變株酶活力提高機制：對抑制劑結(jié)合位點突變后能通過別構(gòu)調(diào)控調(diào)節(jié)酶與ATP親和力，其中Tyr198與ATP之間的氫鍵占有率增加，親和力增強。本實驗在Han Caijing等[1]研究基礎(chǔ)上，對ATP結(jié)合關(guān)鍵殘基位點Tyr198及催化位點Asp201進行定點飽和突變成功篩選獲得酶活力提高到18.26 倍的雙突變株，較對抑制劑結(jié)合位點的突變，酶活力顯著提高。對抑制劑結(jié)合位點突變后，AK通過別構(gòu)調(diào)控影響酶與ATP親和力，從而調(diào)節(jié)酶活力，說明ATP結(jié)合位點對酶活力提高具有重要作用，因此本研究對ATP結(jié)合位點進行突變，通過實驗驗證其酶活力提高較大，進一步說明ATP結(jié)合位點的重要性，與Han Caijing[1]和Li Changcheng[25]等報道一致。

圖6 突變前后ATP與Asp之間的變化Fig.6 The change between ATP and Asp before and after the mutation

文獻報道對抑制劑結(jié)合位點進行突變，能有效減弱抑制劑的抑制[17-23]，而在本研究中對ATP結(jié)合位點突變后對抑制劑有不同程度減弱甚至在高濃度下有激活作用。這可能是由于對ATP結(jié)合位點突變后引起了ATP結(jié)合口袋重排，致使底物Asp與ATP連接更緊密，由弱的范德華力轉(zhuǎn)變成更強的作用力（圖6A、B），穩(wěn)定了底物Asp的結(jié)合，從而與AK相互作用增強，動力學結(jié)果表明Km由WT的3.58 mmol/L減少到2.37 mmol/L，與上述結(jié)論相符。抑制劑Lys是底物Asp的競爭性抑制劑[19]，當?shù)孜顰sp與AK相互作用增強時，抑制劑Lys不足以與底物Asp競爭，從而減弱了抑制劑的抑制，所以由Lys參與的抑制劑組合下激活作用較明顯，這與表1數(shù)據(jù)相符。AK作為一個別構(gòu)酶，對ATP結(jié)合位點的突變?nèi)绾握{(diào)控抑制劑Lys的結(jié)合，從而減弱反饋抑制，仍需要進一步研究。

推測突變體Y198N/D201M酶活力提高的原因可能是：1）Y198位點由環(huán)狀氨基酸突變后不含環(huán)，可能消除了Tyr與ATP之間雜環(huán)的排斥作用，突變后兩者之間的作用力變強（圖6C、D）；2）D201位點由酸性氨基酸（D）突變成非極性氨基酸（M），側(cè)鏈殘基變長，與ATP接觸面積增大能更好地催化ATP（圖6C、D）；3）突變后致使底物Asp與ATP的連接更緊密，易于催化反應(yīng)的進行。

4 結(jié) 論

本研究對北京棒桿菌中AK基因Tyr198和Asp201位點進行定點飽和突變，并通過高通量篩選成功獲得酶活力顯著提高的AK雙突變體Y198N/D201M。酶動力學結(jié)果顯示：突變體Y198N/D201M AK的Vmax較WT AK提高到18.26 倍，且增強了其與底物Asp的親和力。酶學性質(zhì)研究表明：Y198N和D201M突變使得AK最適反應(yīng)溫度由25 ℃增至28 ℃，最適pH值由8.0降至7.5，半衰期由4.66 h延長至5.32 h，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性；同時，解除底物抑制劑Lys＋Met、Thr＋Met、Lys＋Thr＋Met對AK活力的反饋抑制作用，為優(yōu)化AK在棒桿菌代謝途徑中的作用提供參考和依據(jù)。