劉怡萱，許國(guó)琪，曹鵬熙，金彥龍，李小燕，劉 星,,

（1.西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏 拉薩 850000；2.西藏大學(xué)生態(tài)學(xué)研究中心，極端環(huán)境生物資源與適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000；3.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢大學(xué)-西藏大學(xué)生態(tài)與保護(hù)聯(lián)合研究中心，湖北 武漢 430072）

牦牛在青藏高原的馴化起始于一萬(wàn)年前，是極端環(huán)境條件下生存繁衍的優(yōu)勢(shì)畜種，牦牛奶是藏民族賴以生存的奶源和重要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一[1-3]。除直接飲用外，經(jīng)過(guò)加工產(chǎn)生的多種牦牛乳制品包括酸奶、曲拉、酥油、奶酪、乳清、奶茶等也是高原人民生產(chǎn)生活中不可或缺的食物，其中牦牛酸奶更是藏族人民最常食用的乳制品之一[4]。在西藏強(qiáng)紫外線、低壓缺氧、晝夜溫差大的極端環(huán)境下，對(duì)于發(fā)酵溫度及時(shí)間沒(méi)有精準(zhǔn)控制的自然發(fā)酵牦牛酸奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越來(lái)越受到關(guān)注，其中特殊的微生物資源也逐漸成為研究的熱點(diǎn)[5]。傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶具有獨(dú)特的風(fēng)味和口感，參與發(fā)酵的各種微生物進(jìn)入人體消化系統(tǒng)，部分菌群在人體的腸道菌群的建成中起重要作用，對(duì)人類健康產(chǎn)生影響[6-7]。

對(duì)發(fā)酵乳制品中微生物組成的研究始于19世紀(jì)末，早期研究中，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法對(duì)其參與發(fā)酵微生物組成有了初步的認(rèn)識(shí)[8-10]。然而自然界中可培養(yǎng)研究的微生物還不到整個(gè)微生物種群的20%，在各種環(huán)境樣品中僅有小于1%的微生物能通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)獲得純培養(yǎng)，大部分微生物還屬于不可培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物[11-12]。此外，傳統(tǒng)的免培養(yǎng)技術(shù)，如變性梯度凝膠電泳[13-14]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[15]、熒光原位雜交[16]等所能鑒定到的微生物種類有限[6]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序已成為檢測(cè)微生物多樣性的重要手段，其讀長(zhǎng)高、精度高、通量高、無(wú)偏性的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用到微生物群落多樣性的研究中，不僅可以檢測(cè)到難培養(yǎng)和低豐度的物種以及曾經(jīng)存活或是難以分離的部分微生物，還可以排除挑選菌株時(shí)所產(chǎn)生的偏見(jiàn)性，更能代表整體的微生物組成[5-6]。

極端環(huán)境下的微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇，具備相對(duì)特殊的結(jié)構(gòu)、機(jī)能以及遺傳特性，以應(yīng)答相應(yīng)的脅迫因子[5]。目前，對(duì)于青藏高原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶已有相關(guān)報(bào)道涉及加工工藝優(yōu)化[17]、營(yíng)養(yǎng)成分分析[18]、乳酸菌和酵母菌分離與鑒定[19]、乳酸菌益生作用[5]、揮發(fā)性風(fēng)味成分分析[20]、微生物組成及其多樣性分析[4,21-22]等，但進(jìn)一步對(duì)西藏農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶中微生物差異及其原因的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用高通量測(cè)序方法對(duì)西藏不同生產(chǎn)方式下傳統(tǒng)發(fā)酵的牦牛酸奶細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，并結(jié)合環(huán)境因子分析農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶間微生物多樣性差異，以期為牦牛酸奶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共采集西藏牧民以傳統(tǒng)方式發(fā)酵的牦牛酸奶樣本19 個(gè)，包括在日喀則（RK）、拉薩（LA）等農(nóng)區(qū)采集的樣本5 個(gè)及在阿里（AL）、那曲（NQ）等牧區(qū)采集的樣本14 個(gè)，樣品信息見(jiàn)表1。樣品收集在15 mL無(wú)菌離心管中，用-20 ℃車(chē)載冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，保存于-80 ℃冰箱備用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（plymerase chain reaction，PCR）Master Mix（M7505） 美國(guó)Promega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Axygen公司；DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C12S車(chē)載冰箱 美國(guó)Mobicool公司；DW86L-158超低溫冰箱 中國(guó)江蘇勝藍(lán)公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；5417R冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；Veriti PCR儀 美國(guó)ABI公司；HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌群DNA提取和PCR擴(kuò)增測(cè)序

牦牛酸奶中菌群總DNA的提取參照Yu Jie等[23-24]方法。用提取的總DNA作為模板，以338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）、806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為引物，對(duì)細(xì)菌的16S rRNA V3-V4可變區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，4×dNTP混合物5 μL，MgCl23 μL，引物各2.6 μL，模板2 μL，Taq酶0.4 μL，加ddH2O補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min后，進(jìn)行25 次循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸5 min。在超微量紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)PCR產(chǎn)物純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，基于Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序，PCR擴(kuò)增及測(cè)序工作由廣東仁秀測(cè)序公司完成。

基于上海美吉生物I-Sanger云平臺(tái)（https://www.i-sanger.com/）、R軟件（version 3.5.1）以及ITOL（https://itol.embl.de/）等軟件平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 環(huán)境因子的獲取

利用長(zhǎng)天HOLUX M-241無(wú)線GPS記錄器對(duì)19 個(gè)酸奶樣本進(jìn)行定位并獲取海拔等信息，利用CHELSA高精度數(shù)據(jù)庫(kù)（Climatologies at high resolution for the earth’s land surface areas，http://chelsa-climate.org/）以及R軟件geosphere軟件包分別調(diào)取所在地年平均氣溫、地理距離信息。

1.3.3 菌群多樣性分析

對(duì)測(cè)序得到各樣本序列進(jìn)行質(zhì)量控制后，利用Usearch（vsesion 7.0）軟件，按97%相似度的分類水平劃分可操作分類單元（operation taxonomic units，OTU），并按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平，利用mothur（version v.1.30.1）計(jì)算α多樣性指數(shù)，構(gòu)建稀釋曲線。

利用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME，version 1.17）計(jì)算β多樣性距離矩陣?；赽ray_curtis距離進(jìn)行相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM），基于unweighted UniFrac距離對(duì)農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）。

進(jìn)一步對(duì)菌群組成進(jìn)行多級(jí)物種差異判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe），再根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本按照不同分類水平進(jìn)行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA，閾值為2），找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的菌群。進(jìn)一步利用組間顯著性差異檢驗(yàn)，對(duì)不同區(qū)域之間的菌群進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，評(píng)估菌群豐度差異的顯著性水平。

此外，基于地理距離、海拔差異以及年平均氣溫等環(huán)境因子數(shù)據(jù)，分析樣本間差異原因。一方面，利用R軟件geosphere程序包計(jì)算得到各樣點(diǎn)間的地理距離矩陣，綜合β多樣性距離矩陣，對(duì)兩者進(jìn)行回歸分析。另一方面，結(jié)合基于距離的冗余分析（distance-based redundancy analysis，db-RDA）研究海拔高度以及年平均氣溫與樣本差異的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶菌群多樣性分析

2.1.1α多樣性分析

對(duì)19 個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序共得到204 345 條有效序列，基于97%相似度的分類水平，共注釋到48 個(gè)OTU，測(cè)序覆蓋率大于99.97%。各樣本群落豐富度Sobs指數(shù)稀釋曲線和群落多樣性Shannon指數(shù)稀釋曲線趨于平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣本中絕大多數(shù)的菌群多樣性信息（圖1）。

α多樣性分析表明（表2），Chao指數(shù)在農(nóng)區(qū)樣本和牧區(qū)樣本間具有顯著差異（P=0.009 2），農(nóng)區(qū)樣本群落豐富度大于牧區(qū)樣本。Shannon指數(shù)（P=0.250 7）、Simpson指數(shù)（P=0.917 9）在農(nóng)區(qū)樣本與牧區(qū)樣本間無(wú)顯著差異，表明兩組樣本中菌群多樣性類似。

表2 基于T檢驗(yàn)的α多樣性指數(shù)差異Table 2 Difference in α diversity index based on Student’s T test

2.1.2β多樣性分析

ANOSIM（圖2A）顯示，農(nóng)、牧區(qū)組間菌群結(jié)構(gòu)差異顯著大于組內(nèi)差異（R=0.673 8，P=0.003），分組具有意義。PCoA（圖2B）表明，來(lái)自農(nóng)區(qū)和牧區(qū)的樣本分別聚集在一起，其中，LA03樣本介于兩組之間，第1主成分對(duì)樣本菌群結(jié)構(gòu)差異的貢獻(xiàn)率為42.08%，第2主成分為20.02%。β多樣性綜合分析顯示，農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶樣本中菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

圖2 β多樣性分析Fig.2 β-Diversity analysis

2.2 農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶菌群組成及差異分析

在所有樣本中鑒定得到的48 個(gè)OTU，分屬于4 個(gè)門(mén)，18 個(gè)屬，在門(mén)水平上（圖3A），厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶菌群中均占主要優(yōu)勢(shì)（96.589 5%、99.796 1%），而放線菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）在農(nóng)區(qū)樣本中的占比均高于牧區(qū)樣本。從屬分類水平看（圖3B），農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶中乳桿菌屬（Lactobacillus）（34.504 9%、70.379 9%）、乳球菌屬（Lactococcus）（55.687 6%、0.116 9%）和鏈球菌屬（Streptococcus）（3.548 1%、29.289 4%）為主要優(yōu)勢(shì)屬，其他菌屬相對(duì)豐度均小于1%。

圖3 西藏農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶中菌群組成Fig.3 Bacterial composition of yak yogurt samples collected from agricultural and pastoral areas of Tibet

圖4 西藏農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶中菌群差異分析Fig.4 Analysis of bacterial composition differences between yak yogurt samples collected from agricultural and pastoral areas of Tibet

LEfSe多級(jí)物種層級(jí)分析（圖4A）顯示，擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)在農(nóng)區(qū)顯著富集，而在牧區(qū)大量富集厚壁菌門(mén)；從屬水平來(lái)看，乳球菌屬等8 個(gè)菌屬在農(nóng)區(qū)顯著富集，牧區(qū)僅有鏈球菌屬、乳桿菌屬顯著富集。LDA（LDA閾值＞2.0）（圖4B）與組間差異顯著性檢驗(yàn)（圖5）共同表明，對(duì)農(nóng)、牧區(qū)樣本菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響的菌屬包括乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬等10 個(gè)菌屬（P＜0.05）。

圖5 西藏農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶中菌群組間差異的顯著性檢驗(yàn)Fig.5 Significant test of the differences in bacterial composition of yak yogurt samples between agricultural and pastoral areas of Tibet

2.3 環(huán)境因子對(duì)農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶菌群結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)地理距離矩陣和β多樣性距離矩陣擬合得到方程為：Y=0.067 4lnx＋0.305 59（R2=0.028，P=0.028）（圖6A），結(jié)果表明地理距離對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的差異解釋度較低?；趗nweighted UniFrac距離算法的db-RDA顯示（圖6B），海拔高度與年平均氣溫對(duì)農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶細(xì)菌組成均有顯著性影響，且呈負(fù)相關(guān)，海拔高度（R2=0.730 1，P=0.001）對(duì)樣本間差異的解釋度大于年平均氣溫（R2=0.482 6，P=0.007）。

圖6 環(huán)境因子對(duì)農(nóng)、牧區(qū)牦牛酸奶菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of environmental factors on the bacterial structures of yak yogurt samples collected from Tibetan agricultural and pastoral areas

3 討 論

農(nóng)區(qū)和牧區(qū)是西藏主要的兩種傳統(tǒng)生產(chǎn)生活方式，農(nóng)區(qū)主要位于拉薩、山南、日喀則，集中分布在藏南河谷及河谷盆地中，以種植青稞、油菜等作物為主；牧區(qū)主要集中在阿里、那曲，天然草地面積位居全國(guó)第一[25]。牦牛作為西藏畜牧業(yè)的支柱，養(yǎng)殖主要集中在牧區(qū)，占據(jù)十分重要的地位[26]，農(nóng)區(qū)由于地理環(huán)境原因，牦牛養(yǎng)殖量遠(yuǎn)小于牧區(qū)，養(yǎng)殖方式與牧區(qū)也有較大區(qū)別，人工添加飼料比重遠(yuǎn)大于牧區(qū)。然而，無(wú)論在農(nóng)區(qū)還是牧區(qū)，傳統(tǒng)發(fā)酵的牦牛酸奶都是農(nóng)牧民發(fā)展經(jīng)濟(jì)、增加收入不可或缺的重要產(chǎn)品之一[27]。對(duì)自然發(fā)酵牦牛酸奶中菌群多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)中乳桿菌屬和乳球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群[4,28]。本研究來(lái)自西藏的樣品，菌群組成與之前研究結(jié)果基本一致，農(nóng)區(qū)樣本中菌群豐富度及多樣性略高于牧區(qū)樣本。

發(fā)酵食品中菌群多樣性差異與地理環(huán)境密切相關(guān)[25,29-32]，酸奶中菌群種類在氣候相對(duì)溫和的地域比在相對(duì)寒冷和海拔較高的環(huán)境中更為豐富[5]，自然發(fā)酵酸奶中菌群的組成及數(shù)量還受發(fā)酵時(shí)間和制作方法等其他因素影響[22]。本研究除氣候及海拔的因素外，還考慮了農(nóng)區(qū)和牧區(qū)養(yǎng)殖方式的不同，農(nóng)區(qū)由于受地理環(huán)境的限制，牦牛喂養(yǎng)過(guò)程中人工添加飼料比重大于牧區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，地理距離對(duì)酸奶中菌群結(jié)構(gòu)影響較小，海拔影響大于溫度影響。在海拔相對(duì)較低的農(nóng)區(qū)牦牛酸奶中乳球菌屬和乳桿菌屬占優(yōu)勢(shì)，且乳球菌屬含量高于鏈球菌屬和乳桿菌屬；而在海拔相對(duì)較高的牧區(qū)牦牛酸奶中乳桿菌屬和鏈球菌屬占優(yōu)勢(shì)，且乳桿菌屬占比顯著高于乳球菌屬和鏈球菌屬。乳桿菌屬對(duì)酸的耐受力一直被認(rèn)為高于鏈球菌屬和乳球菌屬，在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行微弱的水解作用，有助于維持較高的發(fā)酵活性[33]。在西藏牦牛酸奶的傳統(tǒng)發(fā)酵方式中，對(duì)于溫度及發(fā)酵時(shí)間沒(méi)有精確的控制，由于牧區(qū)平均海拔高于農(nóng)區(qū)，年平均氣溫相對(duì)較低，酸奶在牧區(qū)發(fā)酵時(shí)間略長(zhǎng)于農(nóng)區(qū)，因此導(dǎo)致牧區(qū)酸奶中耐酸并能提高發(fā)酵活性的乳桿菌含量高于農(nóng)區(qū)酸奶。

生活在青藏高原的藏族人群，傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣以糌粑及肉類為主，果蔬類及其他蛋白質(zhì)攝入量較少，飲食結(jié)構(gòu)較為單一，牦牛酸奶作為其最常食用的乳制品之一[4]，對(duì)調(diào)節(jié)膽固醇含量、維持機(jī)體健康起到了重要作用[5,31-33]。由于青藏高原海拔差異較大，不同地域環(huán)境下的藏族人群飲食習(xí)慣也存在很大差異。人類飲食對(duì)腸道菌群有直接影響，而腸道菌群對(duì)人的健康更是發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[34]。已有研究表明，藏族人群腸道菌群多樣性在不同海拔[35]、不同生存環(huán)境[36]下有一定差異。西藏牦牛酸奶及其他發(fā)酵食品中的菌群對(duì)藏族人群腸道菌群及其對(duì)健康的影響機(jī)制尚不明確。因此，對(duì)青藏高原傳統(tǒng)食品中菌群的進(jìn)一步分析將有助于揭示自然環(huán)境與傳統(tǒng)食品中菌群的關(guān)系以及環(huán)境、食品與不同生活方式下藏族人群腸道菌群三者之間的適應(yīng)性關(guān)系。