熊香元，張立釗，陳力力，龔慧可，周 玥，任佑華

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

我國南部傳統(tǒng)米粉主要分為發(fā)酵法和非發(fā)酵法2 種方式生產(chǎn)，其中發(fā)酵法是在發(fā)酵池中加入適量的“續(xù)渣液”（前次浸泡大米的浸泡水）和自來水，將整粒秈稻米浸泡2～5 d，使其在自然狀態(tài)下進行大米浸泡發(fā)酵后，再經(jīng)清洗、磨漿、蒸擠、保濕、成型、蒸粉、切斷和包裝等工序制成米粉。發(fā)酵米粉較非發(fā)酵米粉口感爽滑、勁道感十足，從而提高了米粉的食用品質(zhì)[1-2]。人們采用微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，對發(fā)酵米粉中的微生物進行研究，認為在大米浸泡發(fā)酵過程中起主要作用的是不同種類的乳酸菌和少量的酵母菌[3-4]，然而自然發(fā)酵過程復(fù)雜，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不僅耗時耗力，還有大量難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物無法分離且不能對分離物進行精確鑒定，無法全面評價米粉發(fā)酵液中微生物群落多樣性。

高通量測序技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高準確性和低運行成本的特點[5-6]，該測序技術(shù)已被應(yīng)用于各個領(lǐng)域中[7-9]。因此，本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析米粉發(fā)酵過程中發(fā)酵液乳酸菌多樣性菌群結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律和基因功能預(yù)測，旨在全面揭示米粉發(fā)酵過程中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，為進一步開展自然發(fā)酵過程中主要微生物乳酸菌及其發(fā)酵作用機制的研究，改良傳統(tǒng)發(fā)酵米粉的生產(chǎn)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從湖南一鮮濕米粉生產(chǎn)廠采集發(fā)酵0～4 d的大米發(fā)酵液樣品5 組各3 份，分別裝入滅菌的100 mL玻璃瓶中，并且編號0d1、0d2、0d3、1d1、1d2、1d3……4d3，帶回實驗室后置于4 ℃冰箱保存，20 h內(nèi)檢測處理。

細菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；FE28-PH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司；ABI GeneAmp9700型PCR儀 愛普拜斯公司；紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Quanti Fluor TM-ST藍色熒光定量系統(tǒng) Promega公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品細菌DNA提取

每個樣品取5 mL采用Bacteria Genomic DNA kit試劑盒方法進行發(fā)酵液中細菌基因組總DNA提取，隨后取各樣品總DNA用Tris-HCl緩沖溶液進行適當?shù)南♂?，用分光光度計測定OD260/280nm值下DNA的濃度，取樣品DNA 2 μL加樣1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.3.2 細菌16S rDNA序列擴增和Illumina MiSeq測序

選擇質(zhì)量合格的DNA作為模板，根據(jù)Illumina MiSeq測序區(qū)域（V3-V4）要求，采用合成帶有barcode的特異引物Primer 338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）及Primer 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）進行細菌16S rDNA PCR擴增，PCR擴增為20 μL反應(yīng)體系。將PCR擴增達到純化要求的產(chǎn)物割膠回收，送往上海美吉生物工程有限公司采用MiSeq平臺測序。

1.3.3 Illumina Miseq測序數(shù)據(jù)分析

將測得原始數(shù)據(jù)通過barcode分配樣品reads，得到每個樣本的有效序列，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，采用flash軟件將成對的reads拼接成一條序列，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，根據(jù)barcode區(qū)分樣品后進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和物種分類學分析。基于OTU聚類分析結(jié)果，采用mothur軟件及菌群豐度指數(shù)計算法對OTU進行群落的物種豐度和多樣性指數(shù)分析，用于指數(shù)評估的OTU相似水平97%；基于分類學信息，在不同水平上對各樣品進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。使用PICRUSt軟件對各組樣品中微生物的基因功能進行預(yù)測[10]，并依照COG數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫進行功能注釋[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列分析及取樣深度驗證分析

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA samples

各樣品細菌基因組DNA的OD260/280nm均屬正常范圍，基因組DNA及PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，電泳目的條帶清晰，其濃度和大小均符合下一步檢測要求。Illumina MiSeq測序15 個樣品共獲469 955 條有效序列，平均每個樣本（31 330±462） 條（表1）。在OTU相似水平97%下，最終序列平均長度420～430 bp，且測序長度上下浮動不大，說明得到的序列可以用于后續(xù)分析。圖2以樣本中隨機抽取一定數(shù)量的序列與它們所代表的物種數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，其稀釋曲線逐漸趨于平坦，說明數(shù)據(jù)量越多對于發(fā)現(xiàn)新OTU邊際會越小，可以進行下一步的數(shù)據(jù)分析。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves

2.2 OTU統(tǒng)計及多樣性指數(shù)分析

2.2.1 OTU統(tǒng)計分析

基于相似性大于97%的原則，將獲得的有效序列進行聚類，共獲得278 個OTU，各樣品OTU數(shù)目為10～31 個不等，隨著時間延長逐漸減少（表1）。Venn圖可用于統(tǒng)計多個樣本中所共有和獨有的物種數(shù)目（如OTU），可以比較直觀地表現(xiàn)樣本的物種數(shù)目組成相似性及重疊情況。由圖3可知，15 個樣品有10 個共有OTU，分別占各樣品OTU數(shù)目的32.26%～100%，重疊度較高，說明各個階段發(fā)酵液的乳酸菌種類具有較大的相似性。5 組樣品中僅0 d樣品有4 個獨有OTU，這可能是大米在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵初期由于環(huán)境、原料和人員等因素造成發(fā)酵液中微生物菌群復(fù)雜。發(fā)酵0 d樣品與發(fā)酵1～4 d樣品共有OTU個數(shù)分別為26、23、20、12，這說明了隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的微生物菌群逐漸變得穩(wěn)定，某些微生物由于不適應(yīng)發(fā)酵液環(huán)境生長受到抑制。

圖3 OTU維恩圖Fig.3 Venn diagram of OTUs

2.2.2 多樣性指數(shù)分析

在生態(tài)學中Chao指數(shù)和ACE指數(shù)常用來估計物種總數(shù)和群落中OTU數(shù)目，指數(shù)越大菌群豐度越高[12-13]。由表1可知，0 d樣品菌群豐度高于1～4 d樣品。Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)常用于反映樣品中物種均勻度。Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明群落多樣性越高。由表1可知，群落多樣性排序為：0 d＞1 d＞2 d＞4 d＞3 d，并且從OTU數(shù)目可知，隨著發(fā)酵時間延長，物種種類減少。

表1 樣本信息表和α多樣性指數(shù)Table 1 Information about the samples and analysis of alpha diversity estimator

結(jié)合樣本的OTU的種類及其相對豐度，計算樣本間加權(quán)遺傳距離矩陣，利用距離矩陣繪制主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）聚類圖，分析所有樣品間的相似性。由圖4可知，第1主成分的貢獻率為51.54%，第2主成分的貢獻率為22.76%。15 個樣品中，D3聚類效果最好，3 個樣品相互聚類到一起，而其他組別均出現(xiàn)差異。整體來看，組間樣品有明顯差別，但組內(nèi)樣品的相似性大于其差異性。

圖4 PCoA聚類分析Fig.4 Cluster analysis by principal coordinate analysis

2.3 門、目、屬水平群落結(jié)構(gòu)分析

本研究共注釋得到5 個門，分別為藍細菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），發(fā)酵初期（1 d）涵蓋了所有的5 個門，而發(fā)酵結(jié)束時，僅存在厚壁菌門；另外，0～4 d所有樣品中，厚壁菌門（Firmicutes）豐度均在99%以上（99.69%～100%）。在目分類水平上，發(fā)酵初期（0 d和1 d）包含了16 個目，發(fā)酵結(jié)束時，僅存在3 個目；而且各樣品均以乳桿菌目（Lactobacillales）豐度最大（99.9%±0.34%）。門、目水平群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與OTU一致，隨著發(fā)酵時間延長物種種群逐漸減少。

按照Berry細菌學手冊中的生化分類法，乳酸菌可分為乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬共5 個屬。從表2可知，雖然樣品在屬分類水平上包含了27 個屬，但主要是乳酸菌，尤其是乳桿菌屬（Lactobacillus）占主導地位，整個發(fā)酵期間相對豐度均在99%以上。另外有豐度較小的乳球菌屬，明串珠菌屬保留，其他菌屬隨著發(fā)酵時間延長消失。

表2 屬水平物種組成Table 2 Microbial community analysis at the genus level%

2.4 種水平群落結(jié)構(gòu)分析

如圖5所示，15 個發(fā)酵液樣品中共鑒定出37 種乳酸菌，相對豐度大于1%的為未分類的乳酸菌（unclassifiedLactobacillus，67.75%）、能動乳桿菌（L.agilis，11.34%）、唾液乳桿菌（L.salivarius，10.54%）、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum，10.12%）。在所有發(fā)酵液樣品中除了未分類的乳酸菌占優(yōu)勢均在60%以上之外，0 d樣品中優(yōu)勢乳酸菌為發(fā)酵乳桿菌（20.20%），1 d樣品中為發(fā)酵乳桿菌（15.00%）和能動乳桿菌（11.69%），2 d樣品中為唾液乳桿菌（13.94%）和能動乳桿菌（10.00%），3 d樣品中為能動乳桿菌（9.96%）和唾液乳桿菌（9.86%），4 d樣品中為能動乳桿菌（14.28%）和唾液乳桿菌（11.71%）。根據(jù)上述結(jié)果顯示，米粉發(fā)酵液發(fā)酵過程中主要的優(yōu)勢菌為能動乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和唾液乳桿菌，隨著發(fā)酵時間的延長，其他種類菌逐漸消失，只剩下乳酸菌作為優(yōu)勢菌。

圖5 種水平群落熱圖Fig.5 Heatmap of microbial community at the species level

2.5 乳酸菌種群差異分析

圖6 樣品差異檢驗柱形圖Fig.6 Histogram of difference test among samples

根據(jù)所有樣品在種水平下物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前15的種，進行組間差異顯著性檢驗并繪制差異檢驗柱形圖（圖6）。圖中顯示在發(fā)酵過程中發(fā)酵液的物種相似，相對豐度最大的為未分類乳桿菌（unclassifiedLactobacillus）、發(fā)酵乳桿菌、能動乳桿菌和唾液乳桿菌。其中發(fā)酵乳桿菌相對豐度差異明顯，樣品在第0天時發(fā)酵乳桿菌與其他時期相對豐度最高，發(fā)酵液樣品在第0天時棒狀乳桿菌扭曲亞種（L.coryniformissubsp.torquens）相對豐度差異顯著，第0天時相對豐度最低；第4天時羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）相對豐度差異顯著，第4天時相對豐度最高。

2.6 樣品乳酸菌基因PICRUSt功能預(yù)測分析

2.6.1 COG功能預(yù)測

利用軟件PICRUSt進行功能基因的同源蛋白簇預(yù)測（相對豐度＞0.1%），可以通過16S測序獲得物種構(gòu)成，推測樣本中功能基因的構(gòu)成，根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫的信息，從eggNOG數(shù)據(jù)庫中解析到各個COG的描述信息及其功能信息，從而得到功能預(yù)測豐度譜，繪制COG功能分類統(tǒng)計圖（圖7）。結(jié)果顯示不同發(fā)酵時期樣品得到的COG功能預(yù)測信息組成具有很大的相似性，獲得的預(yù)測功能基因中主要是氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運和代謝、能源產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換等與代謝相關(guān)的基因。此外還有與翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和起源，轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和修復(fù)，細胞壁/膜/包膜起源，無機離子運輸和代謝以及信號轉(zhuǎn)導機制等相關(guān)的功能基因。

圖7 COG功能分類統(tǒng)計圖Fig.7 Statistical chart of COG functional classification

2.6.2 KEGG代謝通路功能預(yù)測

KEGG是將基因、基因組信息以及更高層次的功能信息結(jié)合對基因的功能進行全面分析的數(shù)據(jù)庫。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中得到的代謝通路Level 2豐度分析結(jié)果，15 個樣品中共有39 種代謝通路，根據(jù)Level 1可以分為7 類，其中細胞生理過程3 種、環(huán)境信息處理3 種、遺傳信息處理4 種、人類疾病6 種、組織系統(tǒng)7 種、未分類4 種和新陳代謝12 種。新陳代謝通路是微生物獲得營養(yǎng)進行生長繁殖的主要代謝途徑，同時也是增加發(fā)酵食品品質(zhì)和風味的主要途徑。由Level 2水平上新陳代謝通路的代謝途徑和豐度值（表3）可知，碳水化合物代謝途徑占新陳代謝通路豐度比值分別為0 d，23.78%；1 d，24.19%；2 d，24.51%；3 d，24.79%；4 d，25.05%，各時期豐度值無顯著差異，但都呈逐漸增加趨勢。三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、磷酸戊糖和糖酵解途徑等是碳水化合物的主要代謝途徑，這些代謝會產(chǎn)生大量的檸檬酸、乙酸、丁酸等有機酸使米粉發(fā)酵液的pH值逐漸降低，從而抑制其他雜菌生長[14]，發(fā)酵液的酸性環(huán)境能增加大米淀粉的相對結(jié)晶度和溶解度，環(huán)境pH值的變化，有利于酶催化進行生物化學反應(yīng)，改變米粉的化學組成。而與食品風味物質(zhì)形成相關(guān)的代謝途徑[15]（糖代謝、氨基酸代謝、脂代謝、核酸代謝）各個時期占新陳代謝通路豐度比值分別為59.01%、59.17%、59.26%、59.37%、59.47%，在不同發(fā)酵時期稍有變化。乳酸菌在糖代謝過程中除了正型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸外，還會異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乙醛、丙酮、乙偶姻、雙乙酰等多種揮發(fā)性芳香化合物，能促進米粉香味的形成；在脂代謝過程中，乳酸菌產(chǎn)生的酯酶使大米中的脂肪形成游離脂肪酸，有研究表明，脂肪酸對大米的食味品質(zhì)有顯著影響[16]。KEGG數(shù)據(jù)庫分析15 個樣品有1 400余種酶，按照國際系統(tǒng)分類法得到6大類酶，其中氧化還原酶類占12.31%、轉(zhuǎn)移酶類占41.07%、水解酶類占22.71%、裂合酶類占5.62%、異構(gòu)酶類占6.63%、合成酶類占11.67%。本實驗中列出了豐度值前30的酶類，如表4所示，氧化還原酶類中的L-乳酸脫氫酶能催化微生物代謝產(chǎn)生的乳酸，變成丙酮酸，進而參與微生物的糖代謝、脂代謝等。轉(zhuǎn)移酶類中豐度值最高的酶類是易錯DNA聚合酶，平均占比達到34.43%，易錯DNA聚合酶具有跨損傷合成DNA的能力，增強細胞對DNA損傷的耐受性，但是當它們作用于正常的DNA模板時，易產(chǎn)生突變，不具有校正功能[17]，這為以后微生物育種技術(shù)在發(fā)酵米粉工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。水解酶類是一種能將大分子底物水解成小分子物質(zhì)的酶，在水解酶中除生物體自身生長遺傳有關(guān)的酶外，金屬肽酶豐度值相對較高。金屬肽酶是一種能催化肽類和蛋白質(zhì)中肽鍵水解的一類酶，能降解大米中的蛋白質(zhì)，改變大米的化學組成，從而提升米粉品質(zhì)。異構(gòu)酶中的磷酸甘油酸變位酶是一種參與糖代謝過程中的關(guān)鍵酶[18]，這與KEGG代謝通路中的結(jié)果一致。

表3 KEGG 數(shù)據(jù)庫新陳代謝通路豐度值Table 3 Abundances of metabolic pathways in KEGG database

表4 KEGG數(shù)據(jù)庫主要酶豐度值Table 4 Abundances of main enzymes in KEGG database

3 討 論

不同發(fā)酵時期米粉發(fā)酵液乳酸菌多樣性分析結(jié)果表明，乳桿菌屬為各個發(fā)酵時期米粉發(fā)酵液中絕對優(yōu)勢菌群，相對豐度均在99%以上。這與前人報道結(jié)果相似，Yi Cuiping等[19]利用高通量測序技術(shù)，分析米粉發(fā)酵液的微生物組成，發(fā)現(xiàn)微生物主要屬是乳酸桿菌屬、乳球菌和明串珠菌。整個發(fā)酵過程中乳桿菌屬占絕對優(yōu)勢，可能是與米粉自然發(fā)酵開始前向浸泡水中添加的“續(xù)渣液”有關(guān)，這說明“續(xù)渣液”中主要微生物是乳桿菌屬。近年來，乳酸菌作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品及藥品領(lǐng)域中，含有大量乳酸菌的食品是營養(yǎng)與保健功能兼?zhèn)涞默F(xiàn)代人的理想食品之一[20]。國內(nèi)外學者利用乳酸菌強化發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后米粉的直鏈淀粉、γ-氨基丁酸等含量上升，蛋白質(zhì)、脂肪含量等下降，并認為是發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生的酸和酶等對大米淀粉起到了純化作用[21-23]。米粉在發(fā)酵過程中主要的乳酸菌是乳桿菌屬，但也存在一些乳球菌和明串珠菌屬，乳球菌屬和乳桿菌屬均有較強的耐酸能力[24]，大部分乳球菌和乳桿菌在缺氧環(huán)境下能夠生長繁殖，這與米粉自然發(fā)酵環(huán)境和發(fā)酵液中pH值變化、霉菌等數(shù)量變化結(jié)果一致。乳球菌通常具有提高食品營養(yǎng)和品質(zhì)的作用，明串珠菌能夠代謝產(chǎn)生適量的CO2氣體及多種風味化合物[25]，這一定程度上說明了發(fā)酵米粉品質(zhì)優(yōu)良可能是多種乳酸菌共同作用的結(jié)果。史國英等[26]對廣西傳統(tǒng)發(fā)酵米粉中的乳酸菌進行分離篩選，得到了4 株乳酸菌屬于戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），2 株植物乳桿菌（L.plantarum）。馬霞等[27]對大米發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌株分離純化，得到1 株優(yōu)勢菌株乳酸乳球菌（L.lactis)。本研究結(jié)果與之有些不同，這與樣品的取樣地區(qū)不同有關(guān)，另外本研究存在大量未分類乳桿菌。

乳酸菌種群差異分析發(fā)現(xiàn)，雖然在整個發(fā)酵過程中乳酸菌組成相似，但是0 d樣品棒狀乳桿菌扭曲亞種，1 d樣品發(fā)酵乳桿菌，4 d樣品羅伊氏乳桿菌與其他時期相對豐度差異顯著。因為隨著發(fā)酵時間延長其他乳桿菌數(shù)量顯著增加，發(fā)酵乳桿菌生長速率相對放緩。發(fā)酵乳桿菌為異型發(fā)酵乳酸桿菌,能夠代謝乳糖、半乳糖等多種糖類產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇等代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵米粉中對米粉品質(zhì)有重要的影響，發(fā)酵乳桿菌在發(fā)酵米粉中對米粉品質(zhì)的影響需要進一步研究。

本研究進一步使用PICRUSt軟件對發(fā)酵液中的乳酸菌的基因功能進行了預(yù)測，PICRUSt能通過微生物群落的豐富度與數(shù)據(jù)庫對比，從而在不可觀測的情況下推測出生物群落的功能信息[28]。其中預(yù)測功能基因中主要是氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運和代謝、能源產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換等與代謝相關(guān)的基因。COG功能分類統(tǒng)計圖顯示，發(fā)酵各個時期樣品的相同功能顏色有細微差別，這說明各樣品具有相同的功能，這與測定樣品OTU的結(jié)果吻合。物質(zhì)代謝通路主要是糖代謝、氨基酸代謝、脂代謝、核酸代謝通路，這說明在米粉發(fā)酵過程中大米中糖的含量、蛋白質(zhì)和脂肪的含量會有變化，這與相關(guān)報道[29-30]結(jié)果一致。乳酸菌主要利用葡萄糖等單糖進行糖代謝[31]，而大米主要成分淀粉是一種多糖，因此通過碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝通路，可以為乳酸菌的生長繁殖提供碳源，同時可以產(chǎn)生乳酸，說明發(fā)酵期間乳酸菌利用碳水化合主要進行自身的生長繁殖。乳酸菌在氨基酸代謝途徑中，通過乳酸菌分泌的轉(zhuǎn)氨酶、裂解酶、脫氫酶等酶的催化作用，可以產(chǎn)生醋酸、丁酸等有機酸，這些有機酸能與醇類反應(yīng)生成脂類，形成風味物質(zhì)；脂肪代謝途徑中，在酯酶的作用下可以最終生成醛類、醇類、酮類等芳香族化合物；另外乳酸菌自身能進行核苷酸代謝產(chǎn)生腺苷、次黃嘌呤等。由此可以推測在大米發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的形成主要與氨基酸代謝途徑有關(guān)。KEGG二級代謝通路分析表明，基因主要富集在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等新陳代謝中，這與本研究COG數(shù)據(jù)庫預(yù)測的碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝結(jié)果一致?；蚬δ茴A(yù)測表明乳酸菌代謝途徑復(fù)雜，酶的種類豐富，若需要具體了解哪些基因功能對大米的理化特性產(chǎn)生特定影響還需要進一步研究。

4 結(jié) 論

以不同時期的米粉發(fā)酵液樣品為研究對象，通過Illumina MiSeq測序分析發(fā)酵液樣品中乳酸菌多樣性，結(jié)果表明發(fā)酵液樣品均具有較高的乳酸菌多樣性，且各個時期的種群組成相似，乳桿菌屬占主導地位，但還存在乳球菌屬和明串珠菌屬。隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌的多樣性降低。通過功能預(yù)測分析表明優(yōu)勢乳酸菌屬對蛋白質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、脂類代謝等具有顯著影響，乳酸菌可能在發(fā)酵過程中對大米理化特性有一定的影響。本研究揭示了米粉發(fā)酵過程中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)演替，為今后進一步研制米粉發(fā)酵劑、改進米粉生產(chǎn)工藝提供一定的研究基礎(chǔ)。