高紅琴，武鵬慧

（山西康寶生物制品股份有限公司，山西長治 046000）

磷酸三丁酯殘留量測定法為氣相色譜法，參照《中國藥典》2015年版通則3205和相關(guān)文獻對人凝血因子Ⅷ中磷酸三丁酯殘留量測定方法進行了方法學(xué)研究。

1 儀器與試劑

儀器：GC-2010Pplus 氣相色譜儀（日本島津）；酸改性聚乙二醇毛細管柱（安捷倫）；AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。試劑：磷酸三丁酯（sigma chemistry，批號：BCBP2237V）；磷酸三丙酯（sigma chemistry，批號：38196TJ）；正己烷（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20171031）；高氯酸（aladdin chemistry，批號：H1617042）；樣品批號：20180901、20181002、20181003（山西康寶生物制品股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 人凝血因子Ⅷ磷酸三丁酯殘留量測定方法

2.1.1 儀器條件

柱溫140℃，氣化室溫度190℃，火焰離子化檢測器，檢測器溫度210℃，載氣（氮氣）流速為60mL/min。

2.1.2 測定方法

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取磷酸三丙酯適量，用正己烷溶解并定量稀釋制成每lmL 中約含400μg 的溶液。

對照品溶液的制備：取磷酸三丁酯對照品適量，精密稱定，加正己烷溶解并定量稀釋制成每lmL 中約含600μg 的溶液。

測定法：精密量取供試品3mL，置具塞玻璃離心管中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液50μl 與1.5mol/L 高氯酸溶液0.75mL，振蕩1分鐘；置37℃水浴保溫10min 后，再加正己烷4mL，振蕩2分鐘；以20000r/min 轉(zhuǎn)離心20min，小心吸取上層正己烷，用氮氣將其濃縮至約0.2mL（不能加熱），取1.0μl 注入氣相色譜儀。精密量取對照品溶液10μ1、20μ1、40μl、60μ1、80μ1，分別置已精密加水3mL 的具塞玻璃離心管中，再向各對照品管精密加內(nèi)標(biāo)溶液 50μ1，自“振蕩1min”起，同法操作。以各磷酸三丁酯對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比，對磷酸三丁酯對照品溶液濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，計算出供試品中磷酸三丁酯含量（μg/m1）。

2.2 方法學(xué)研究

（1）專屬性：取磷酸三丁酯、磷酸三丙酯對照品溶液和溶劑正己烷各1.0μl，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。磷酸三丁酯峰保留時間為8.256、磷酸三丙酯峰保留時間為3.367、溶劑正己烷峰保留時間為0.746。

（2）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：精密量取磷酸三丁酯對照品溶液10μ1，置已精密加水3mL 的具塞玻璃離心管中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液50μ1，自“振蕩1min”起，依法操作，記錄色譜圖。理論板數(shù)按磷酸三丁酯峰計為11 080，磷酸三丁酯峰與磷酸三丙酯峰的分離度為21.358，磷酸三丁酯對照品溶液連續(xù)進樣5次，所得磷酸三丁酯峰與磷酸三丙酯峰面積之比（f）分別為：1.245、1.245、1.247、1.248、1.248，相對標(biāo)準偏差（RSD）為0.11%。

（3）檢測限與定量限：按儀器噪音的3倍響應(yīng)值測定檢測限，10倍響應(yīng)值測定定量限。

分別取磷酸三丁酯對照品適量，精密稱定，加正己烷溶解并逐級稀釋，精密量取該溶液10μL，置已精密加水3mL 的具塞玻璃離心管中，再向各對照品管精密加內(nèi)標(biāo)溶液 50μL，自“振蕩1min”起，照測定法操作。響應(yīng)值為儀器噪音的3倍時的濃度為檢測限，響應(yīng)值為儀器噪音的10倍時的濃度為定量限，所以檢測限為0.2μg/mL，定量限為0.5μg/mL。

（4）線性關(guān)系及線性范圍考察：取磷酸三丁酯對照品適量，精密稱定，加正己烷溶解并定量稀釋制成每lmL 中約含600μg 的溶液，精密量取該溶液0μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL，分別置已精密加水3mL 的具塞玻璃離心管中，再向各對照品管精密加內(nèi)標(biāo)溶液 50μL，自“振蕩1min”起，照測定法操作。以各磷酸三丁酯對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比，對磷酸三丁酯對照品溶液濃度作直線回歸，求得直線回歸方程。直線回歸相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.990。

磷酸三丁酯回歸方程：y=0.159x+0.036 3，R2=0.997。式中：y為磷酸三丁酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f，x為磷酸三丁酯濃度，單位為μg/mL。磷酸三丁酯濃度對f值的線性關(guān)系結(jié)果見表3。結(jié)果表明：磷酸三丁酯含量在2～16μg/mL 線性關(guān)系良好。

表1 磷酸三丁酯濃度對f值線性關(guān)系結(jié)果

（5）重復(fù)性試驗：取供試品（批號：20180901），按測定方法測定6次磷酸三丁酯殘留量，計算RSD。磷酸三丁酯殘留量分別為0.6、0.6、0.7、0.6、0.5、0.6，RSD 值為9.6%，符合測定要求，表明實驗方法精密度良好。

（6）中間精密度試驗：取三批供試品（批號：20180901、20181002、20181003），由不同人員在不同日期進行磷酸三丁酯殘留量測定，中間精密度試驗結(jié)果見表2，說明該方法重復(fù)性較好。

表2 中間精密度試驗結(jié)果

（7）耐用性：測定方法規(guī)定柱溫140℃，氣化室溫度190℃，檢測器溫度210℃，載氣（氮氣）流速為60mL/min。為了考察檢測條件對測定的影響，取三批供試品（批號：20180901、20181002、20181003）分別在不同條件下，測定磷酸三丁酯殘留量結(jié)果見表3。

表3 耐用性試驗結(jié)果

（8）回收率試驗：精密量取供試品（批號：20180901）3mL，置具塞玻璃離心管中，分別精密加入對照品溶液10μL、20μL、40μL，再加入內(nèi)標(biāo)溶液50μL 與1.5mol/L 高氯酸溶液0.75mL，制成低、中、高三個濃度回收率溶液。

分別取高、中、低三個濃度回收率溶液各三份、供試品溶液及對照品溶液，自“振蕩1min”起，依法操作，記錄色譜圖。進樣1.0μL，計算磷酸三丁酯回收率?；厥章史秶鷳?yīng)為80%～115%。

表4 回收率測定結(jié)果

樣品回收率測定結(jié)果顯示，磷酸三丁酯含量平均回收率91%，RSD 為5.1%（見表4）。結(jié)果表明：該方法具有良好的回收率。

3 結(jié)語

該氣相色譜法檢測限度0.2μg/mL，靈敏度高，操作過程簡便、快速，并且該方法準確度好，精密度高，完全能夠滿足人凝血因子Ⅷ中磷酸三丁酯殘留量的測定。