張 玉，程 壯，甄 曼，王玖瑞，劉孟軍

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，河北 保定 071001； 3.北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100000）

核糖核酸酶（Ribonucleases）是一類核酸水解酶，廣泛存在于動植物體內(nèi)。它可以降解非保護環(huán)境下的RNA 分子，其主要生理功能是控制生物體細胞內(nèi)RNA 的種類與數(shù)量分布，在核糖核酸轉(zhuǎn)錄后的剪切、修飾和降解以及RNA 的轉(zhuǎn)運等過程中起作用，通常被簡寫為RNases。RNases 不僅與植物的抗逆、衰老、雄性不育和自交不親和有密切關(guān)系，還與動物器官發(fā)生、宿主的防御、控制腫瘤血管生成、殺滅腫瘤細胞及抑制病毒的復制等過程有關(guān)［1-2］。Sato和Egami 于1957 年從真菌米曲霉菌中發(fā)現(xiàn)了該家族中的重要成員核糖核酸酶T2 基因［3］。RNases T2家族屬于酸性內(nèi)切酶類，在真核生物的進化過程中，此類酶絕對保守，可能有著重要的生物學功能［4］。近幾年，關(guān)于植物RNases T2 家族成員的研究取得了很大進展，揭示出其在植物生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)等過程發(fā)揮重要作用［5］。

棗（Ziziphus jujuba Mill.）屬鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus），由酸棗馴化而來，是重要的干果樹種且可以藥食兩用。棗果實營養(yǎng)價值豐富，但棗結(jié)實率不高，百花結(jié)一果［6］。棗樹抗逆性強，適應(yīng)干旱、鹽堿等惡劣條件，是改善生態(tài)的先鋒樹種。隨著棗全基因組測序工作的完成［7］，棗生長發(fā)育和抗性等相關(guān)的功能基因的挖掘正深入展開，已經(jīng)涉及棗MADS-box 家族［8］、TCP 家族［9］和bHLH［10］等家族基因，但未見RNase T2 家族Class I 基因的報道。本研究基于已經(jīng)報道的擬南芥RNase T2 家族中Class I 的RNS1 基因［11］，克隆獲得了棗同源ZjRNase1 基因，并對其進行了理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守域結(jié)構(gòu)和不同組織器官的表達量分析，在此基礎(chǔ)上還進行了農(nóng)桿菌介導的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化試驗，以探究該基因的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在河北農(nóng)業(yè)大學棗中心棗資源圃，選取‘冬棗’葉片作為ZRNase1 基因的克隆材料，根、莖、葉、花和幼果作為ZjRNase1 基因不同組織表達量的分析材料。試驗材料在田間采集后包裹進錫箔紙中，迅速保存在液氮里，帶回室內(nèi)后存于-80 ℃，用作后續(xù)RNA 提取。每個樣品均采自3 棵樹，然后進行混樣，采樣植株具有相同的生長年齡、栽培條件和管理水平。

1.2 試驗方法

1.2.1 棗ZjRNase1 基因的克隆 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫Blastp 查找擬南芥RNS1 在棗中的同源序列，利用Primer5.0 軟件設(shè)計所需的特異引物（F： ATGAGATACAGAAGCTCAATCTTGA / R： CTAAAATTTAGCAAATTGAACTTGA）進行目的基因擴增。以‘冬棗’葉片反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板，進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系為：引物F/R 各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 為12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 10 min， 94 ℃ 40 s，56.6 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min?；厥諗U增獲得的目的片段產(chǎn)物，并克隆測序。

1.2.2 生物信息學分析 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫進 行Blastp 比對分析氨基酸序列的相似性，查找同源蛋白序列；通過CD Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行序列的結(jié) 構(gòu)域分析；利用NCBI 開放閱讀框在線預測軟件 ORF Finder（http：//www.ncb i.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對獲得的基因序列進行預測；利用DNAMAN 進行序列比對和拼接；利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進行基因結(jié)構(gòu)分析；利用ExPASy（https：//www.expasy.org/）計 算 蛋 白 質(zhì) 相對分子量和理論等電點；通過SOPMA 在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預測進行預測；利用SignaIP-5.0 Serve（rhttp：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測該基因的信號肽；利用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線網(wǎng)站進行細胞定位預測；用MEME（http：//meme-suite.org/）進行氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析。1.2.3 基因的表達分析 取用‘冬棗’不同組織器官cDNA 進行Real-time PCR 擴增。采用天根公司多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒 DP441 提取棗材料總RNA，使用全式金公司Trans Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix AT301 反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA。設(shè)計棗ZjRNase1 實時定量基 因 引 物（2F：GCTGTCCAAGTAGCAACGGA / 2R：CCCTGTTGCAGTCAATCCCT）， 進行 表 達 量 的 分 析， 棗Actin 內(nèi) 參 基 因 為（F：5′-GCGAGCTTCCCTGTAGGTA-3′，R：5′-CG- AACCCAGCCTTCACCATAC-3′［12］）。PCR 反應(yīng) 程序為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s， 59.2 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共40 個循環(huán)，于72 ℃，55 s 處收集熒光信號?；蛳鄬Ρ磉_計算采用2-ΔΔCT方法。

1.2.4 過表達載體的構(gòu)建PCR 獲得基因片段 根據(jù)NCBI 登錄的基因序列，并含有SmaΙ 酶切位點，設(shè)計引物如下（3F：CTCTAGGATCCCCATGAGAT ACAGAAGCTCAATCTTGA / 3R：AGGGACTG AC CACCCCTAAAATTTAGCAAATTGAACTTGA） 所示，以已有全長菌液為模板進行PCR 擴增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性40 s， 58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物克隆pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞測序。

載體的構(gòu)建及鑒定：將上述重組質(zhì)粒及過表達載體pBI121 用SmaΙ 酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳回收DNA 片段。平末端連接酶50 ℃連接30 min后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用Kan 篩選陽性克隆，測序鑒定為相應(yīng)片段，提取質(zhì)粒。

農(nóng)桿菌菌株的制備及鑒定：參考梁芳等人［13］的具體制備及鑒定方法。

1.2.5 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因鑒定 利用農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗，將構(gòu)建好的過表達載體采用浸染花序的方式轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)化方法參考李業(yè)等人［14］。將侵染后收獲的T0代轉(zhuǎn)基因植株和野生型種子使用相同的方法種植和移栽。T0代擬南芥種子播于含有潮霉素抗性的1/2MS 培養(yǎng)基上，春化2 d 后放置培養(yǎng)室培養(yǎng)。非轉(zhuǎn)入目的基因的擬南芥不具有抗性而被抗生素殺死，正常生長的擬南芥初步預測為轉(zhuǎn)基因植株，待其長到4 片子葉時移栽，正常放置培養(yǎng)室內(nèi)生長，觀察生長狀態(tài)。

2 結(jié)果和分析

2.1 棗ZjRNase1 基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析

將擬南芥RNS1 氨基酸序列在棗數(shù)據(jù)庫中進行Blastp 比對，搜索得到了一個同源蛋白，序列同源性為63.35%， 將其命名為ZjRNase1（LOC107429010）。以冬棗葉片RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，經(jīng)特異引物PCR 擴增所得產(chǎn)物，與預期基因片段大小吻合（圖1）。將該片段進行切膠回收并克隆測序后，將測序結(jié)果通過 DNAMAN 進行序列比對，得到681 bp 的完整ORF 區(qū)序列。利用在線網(wǎng)站GSDS 分析（圖2）發(fā)現(xiàn)該基因含有2個內(nèi)含子和3 個外顯子。

圖 1 ZjRNase1 基因的克隆Fig. 1 Cloning of ZjRNase1 gene

圖 2 棗ZjRnase1 基因結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Gene structure of ZjRnase1 gene in Chinese jujube

2.2 棗ZjRNase1 基因的理化性質(zhì)分析及亞細胞 定位

棗ZjRNase1 基因編碼226 個氨基酸，蛋白分子量為25.78 kD，理論分子式C2090H3501N681O882S132，該蛋白GRAVY（即總平均親水性）值為0.707，表明其為疏水性蛋白。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.66，其值大于40，說明該蛋白是一個不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的氨基酸中由75 個α-螺旋結(jié)構(gòu)（33.19%）、30 個擴展鏈（13.27%）、113 個無規(guī)則卷曲氨基酸殘基（50.00%）、8 個β-轉(zhuǎn)角（3.54%）組成，它們交替散布于整個蛋白質(zhì)中。RNase1 蛋白在第1 ～6 氨基酸處位于膜內(nèi)，在7 ～26 氨基酸處存在跨膜現(xiàn)象，第27 ～226 氨基酸處則位于膜外；經(jīng)SignalP-5.0 Server 在線網(wǎng)站分析（圖3）。該蛋白含有信號肽，屬于分泌蛋白。經(jīng)Plant-mPLoc 在線網(wǎng)站分析，基因定位在細胞質(zhì)基質(zhì)。

圖 3 ZjRNase1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽預測Fig. 3 Prediction of transmembrane structure and signal peptides

2.3 棗ZjRNase1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

從基因結(jié)構(gòu)來看，基因ZjRnase1 內(nèi)含子沒有超過4 個，不屬于Class II 類基因，故將該基因的蛋白與Class III 基因（即S-RNase）蛋白及Class I 蛋白進行結(jié)構(gòu)域分析。與其他十個物種的S 蛋白進行保守域比較，發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他物種Class III 基因蛋白僅具有部分大體一致的保守結(jié)構(gòu)（圖4），但與屬于Class I 的擬南芥中的RNS1、RNS3、番茄中的RNaseLE、RNaseLX 以及水稻OsRNS4蛋白［17］保守域結(jié)構(gòu)具有高度相似性，因此，獲得的棗Rnase1基因應(yīng)屬于RNase T2家族中Class I 基因。

圖 4 棗ZjRnase1 與其他物種同源蛋白的保守域分析Fig.4 Analysis of the conserved domain of ZjRnase1 among Chinese jujube and other species

2.4 棗ZjRNase1 基因的組織特異性分析

經(jīng)組織器官特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，棗ZjRNase1基因在莖、葉、花中表達量遠遠高于果實和根，具有明顯的特異性表達（圖5），符合RNase T2 家族中Class I 基因編碼蛋白具有很強組織特異性的特征［17］。

圖 5 棗不同組織器官中ZjRNase1 基因的表達Fig. 5 Expression of ZjRNase1 gene in different organs of Chinese jujube

2.5 棗ZjRNase1 基因的遺傳轉(zhuǎn)化分析

2.5.1 重組載體的構(gòu)建 重組質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化之后，在相應(yīng)抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長出單菌落并對其進行特異性擴增，保菌送測序，并留菌保存用于后續(xù)將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，進行擬南芥的侵染。使用引物3F/3R 對構(gòu)建的過表達載體及轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后擴繁好的載體進行特異性擴增，電泳檢測結(jié)果如圖6 所示，與目的基因大小一致。

圖6 目的片段的PCR 檢測Fig. 6 PCR detection of target fragments

2.5.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型特征 經(jīng)潮霉素抗性篩選，從T0代擬南芥種子獲得了T1代抗性植株，可在含潮霉素的培養(yǎng)基上生根生長。移栽后繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型（WT）相比T1代抗性植株（MT）葉片發(fā)生明顯扭曲現(xiàn)象。因此，外源ZjRnase1 基因轉(zhuǎn)入導致擬南芥葉片發(fā)育異常，說明ZjRnase1 基因可能參與了葉片發(fā)育過程（圖7）。

圖 7 棗ZjRnase1 基因轉(zhuǎn)化擬南芥Fig. 7 Transformation of Arabidopsis with Chinese jujube ZjRNase1 gene

3 討論與結(jié)論

植物RNase T2 家族分為S-RNases 和S-like RNases 兩類［1,15］，也可以依據(jù)系統(tǒng)進化樹分析分為三大類。 第一類和第二類為S-like RNases 基因，S-RNases 則為第三類，不同類別含有的內(nèi)含子的拷貝數(shù)量和位置存在差異［16］。第一類含有來自許多高等植物的非S-RNase 基因，其中一些酶由于保守活性區(qū)域發(fā)生突變而失去核酸酶活性。這類酶具有多重復制子，其基因組中一般不超過4 個內(nèi)含子，且具有很強的組織特異性，可能會因為環(huán)境脅迫而被誘導。第二類基因普遍存在于大多數(shù)植物中，內(nèi)含子多于4 個，典型的Class II 成員有7 個或8 個內(nèi)含子。其酶在N 末端有獨特的一個保守的二硫化物結(jié)構(gòu)，多在植物中組成性表達，具有明顯的保守遺傳特征。第三類基因內(nèi)含子數(shù)目一般為1 ～2 個。該類基因存在于存在于玄參科、茄科、薔薇科等植物的花中，可以降解轉(zhuǎn)運花粉管中的RNA（tRNA），在植物配子體不親和性中起作用［17］。本研究中獲得的ZjRnase1 基因具有2 個內(nèi)含子，其表達具有器官組織特異性，其蛋白與擬南芥等物種中屬于RNase T2 家族Class I 基因編碼的蛋白具有高度相似的保守結(jié)構(gòu)，因此，棗ZjRnase1 屬于為RNase T2 家族的Class I 基因［16-17］。

擬南芥中的RNS1、RNS3，番茄中的RNaseLE和RNaseLX，以及水稻中的OsRNS4 屬于RNase T2家族的Class I 基因［16-17］，這些基因參與了生長發(fā)育與抗逆反應(yīng)。番茄RNaseLX 基因可以木質(zhì)部分化過程［18］或磷酸鹽缺失［19］的情況下表達；反義抑制RNaseLX 可以延緩葉片脫落［20］；離體葉片在黑暗脅迫［21］下可以誘導番茄中的RNaseLE 和RNaseLX基因表達；損傷后RNaseLE 轉(zhuǎn)錄物優(yōu)先在莖段的韌皮部和形成層細胞中積累，在傷口愈合中發(fā)揮作 用［18］。此外，Theierl K 等人研究提出了擬南芥中的RNS1 基因會在機械傷口下被快速誘導表達［11,22］。水稻中的OsRNS4 基因會在蟲害或傷口損壞及病原菌侵染植株時被誘導，而且過表達OsRNS4 基因會增加植株的耐鹽性，且正調(diào)控ABA 反應(yīng)［23］。因此，該類基因在葉片發(fā)育和寄主的防衛(wèi)反應(yīng)過程起到了重要作用，但是具體反應(yīng)機制以及RNase 活性是否為非生物脅迫抵抗不良環(huán)境所必須的，還有待考 證［24］。本研究將棗ZjRNase1 基因轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片發(fā)生明顯卷曲現(xiàn)象。因此，初步明確了該基因參與葉片發(fā)育過程，但具體作用機制仍需進一步研究。