張晨芳，司賀龍，陳 來，梁小菊，張金林

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北省唐山市豐南區(qū)豐南鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站， 河北 唐山 063300）

煙嘧磺隆作為我國(guó)玉米田除草劑的主導(dǎo)品種，隨著其多年來大量使用和不規(guī)范濫用，對(duì)環(huán)境生態(tài)及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了巨大影響［1-5］。目前人們對(duì)煙嘧磺隆污染的關(guān)注度很高，解決環(huán)境中煙嘧磺隆的殘留問題愈發(fā)迫切。因此，采用高效合理的方法將其對(duì)環(huán)境所產(chǎn)生的負(fù)面影響降到最低，已成為目前亟待解決的問題。相關(guān)研究表明，微生物修復(fù)因其安全、高效、成本低、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，已成為目前解決磺酰脲類除草劑在環(huán)境中殘留的重要手段之一［6-13］，而微生物對(duì)農(nóng)藥的降解作用主要是由其分泌的降解酶來完成的［14,15］。但是，目前對(duì)于降解酶方面的研究則屈指可數(shù)［14,16-18］。

降解酶作為一種具有生物活性的物質(zhì)，本身具有催化劑的性質(zhì)。直接采用酶來降解農(nóng)藥比降解菌本身更具有優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)為降解酶在環(huán)境適應(yīng)性和相容性、對(duì)底物濃度耐受性及降解率等方面均優(yōu)于降解菌。因此，酶的分離純化是酶學(xué)研究過程中的重要組成部分，也是對(duì)酶進(jìn)行深入研究的必備條件。已知絕大多數(shù)的酶屬于蛋白質(zhì)，因此酶的分離純化也經(jīng)常按照蛋白的分離純化方法進(jìn)行［19］。蛋白質(zhì)分離純化的方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)之間的的特性差異進(jìn)行的，主要包括溶解度、分子量的大小、所帶電荷、酸堿度、吸附性質(zhì)及對(duì)配體的生物學(xué)親和力。分離純化所用到的方法主要有離子交換層析、親和色譜、毛細(xì)管電泳、SDS-PAGE、PAGE 電泳、疏水層析、超濾、鹽析、凝膠過濾層析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等。

本試驗(yàn)以貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CF57 作為研究對(duì)象，通過降解酶定域試驗(yàn)及分離純化，從而獲取對(duì)煙嘧磺隆具有良好降解活性的降解酶。本研究對(duì)于豐富煙嘧磺隆降解酶資源及后續(xù)深入研究降解酶的分子生物學(xué)、酶學(xué)特性、生物信息學(xué)、降解機(jī)理等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus vele- zensis）CF57（保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室）。

1.1.2 主要供試試劑和儀器 煙嘧磺隆原藥（純度：97.5%，保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院）；丙酮（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；DEAE-FF 陰離子交換柱（5 mL 預(yù)裝柱，北京博爾西生物科技有限公司）；蛋白純化儀（AKTA，GE）；高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國(guó)安捷倫公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（Scientiz-IID，寧波新芝生物科技有限公司）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 參照Lu［13］具體培養(yǎng)基配方。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙嘧磺隆降解酶的定域試驗(yàn) 挑取貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CF57 單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)96 h。取出培養(yǎng)好的菌液于6 000 r/min 離心10 min 后，分別收集上清和沉淀。按照丙酮沉淀法［13］將上清液用于提取胞外酶；沉淀重懸于K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH=8.0）中，根據(jù)滲透休克法提取周質(zhì)酶［20］；剩余沉淀重懸于50 mmol/L Tris-Cl 緩沖液（pH=8.0）中，短暫超聲破碎后，離心收集上清液即為胞內(nèi)酶。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 按照Bradford 法［21］測(cè)定各蛋白組分的含量。

1.2.3 酶活力測(cè)定 ①水解圈法。在含有2 000 mg/L 煙嘧磺隆的水瓊脂平板上打孔，取20 μL 降解酶液滴加至孔洞中，并設(shè)溶解該降解酶的等量緩沖液作為空白對(duì)照。于35 ℃反應(yīng)30 min 后，通過比較不同酶液“透明圈”直徑，直觀反應(yīng)各酶液對(duì)煙嘧磺隆的降解活性。

②酶液反應(yīng)體系法。將降解酶添加至煙嘧磺隆終濃度為10 mg/L 的Tris-Cl 緩沖液（pH=7.0）中，于35 ℃反應(yīng)30 min。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，并以失活酶作為空白對(duì)照。利用HPLC 檢測(cè)［22］各處理組中煙嘧磺隆殘留量，每個(gè)處理重復(fù)3 次。1 個(gè)酶的活力單位（U）被定義為每min 催化1 μmoL 煙嘧磺隆所需要的酶量［16］。

1.2.4 胞外酶分離純化 ①胞外酶提取方法優(yōu)化。將培養(yǎng)96 h 的貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）CF57發(fā)酵液于6 000 r/min 離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜。在冰浴中，按照菌液∶丙酮=1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5（v∶v）的比例緩慢加入預(yù)冷丙酮，充分混勻后，4 ℃靜置過夜。于9 000 r/min 離心30 min，收集沉淀，并用Tris-Cl 緩沖液（pH=8.0）清洗3 遍后重懸。按照1.2.3 計(jì)算不同比例丙酮提取的胞外酶酶活力，并利用SDS-PAGE 檢測(cè)不同比例丙酮所提取胞外酶中的蛋白種類。

②DEAE-FF 陰離子交換層析柱法。 利用K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH=7.5）（Buffer A）充分 平衡陰離子交換層析柱(1 cm×5 cm)后，將胞外粗酶液加載到層析柱中。以1.5 mL/min 流速，利用 Buffer A 洗脫基線至平衡后，用含有0 ～1 mol/L NaCl 的K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH=7.5）（Buffer B）對(duì)結(jié)合物進(jìn)行梯度洗脫。收集各峰在280 nm 波長(zhǎng)下光密度值高的部分，利用水解圈法初步判定各峰所收集蛋白組分是否具有煙嘧磺隆降解活性。

③Native-PAGE 法。利用Native-PAGE 法對(duì)具有降解活性的蛋白組分進(jìn)一步分離。具體電泳條件為：10%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為20 μL。電泳結(jié)束后，切膠回收各分離條帶，并采用水解圈法和酶液反應(yīng)體系法對(duì)各分離組分的降解活性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 純化酶的質(zhì)譜鑒定 選取活性較高的3 個(gè)蛋白，送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。將氨基酸序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，以確定所分離蛋白種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙嘧磺隆降解酶定域試驗(yàn)

由圖1 可知，胞外酶對(duì)煙嘧磺隆的降解活性最高，為0.005 9 μmoL/（min·mg），其次為周質(zhì)酶，胞內(nèi)酶對(duì)煙嘧磺隆的催化降解作用最小。由此可知，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CF57 對(duì)煙嘧磺隆具有降解作用的降解酶主要來源于胞外酶。

圖1 煙嘧磺隆降解酶定域試驗(yàn)Fig.1 Localization of degradation enzyme in nicosulfuron

2.2 胞外酶提取

由表1 可知，以V菌液∶V丙酮=1∶1 比例提取的胞外酶與V菌液∶V丙酮=1∶2 ～1∶5 比例提取的胞外酶之間的酶比活存在顯著性差異，而V菌液∶V丙酮=1∶2 ～1∶5 提取的胞外酶之間無顯著性差異。

表1 不同比例丙酮提取的胞外酶活性測(cè)定Table 1 Determination of extracellular enzyme activity in different proportions of acetone extraction

進(jìn)一步對(duì)不同比例丙酮提取的胞外酶進(jìn)行SDSPAGE 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（如圖2 所示），不同比例提取的胞外粗酶中蛋白種類不存在明顯差異。

綜上，鑒于不同比例丙酮提取的胞外酶活力及所含蛋白種類，最終選擇V菌液∶V丙酮=1∶2 作為提取胞外酶的最適比例。

圖2 SDS-PAGE 檢測(cè)不同丙酮比例提取的胞外酶Fig.2 SDS-PAGE detection of extracellular enzymes extracted with different acetone ratios

2.3 胞外酶的分離

2.3.1 DEAE-FF 瓊脂糖陰離子交換層析柱分離 胞外酶經(jīng)DEAE-FF 陰離子交換層析柱分離后，共得到5 個(gè)峰，分別命名為P1、P2、P3、P4 和P5（如圖3 所示）。采用水解圈法對(duì)收集到的各峰進(jìn)行定性活性檢測(cè)。由圖4 可知，從P2、P3 和P4 3 個(gè)峰收集到的蛋白質(zhì)對(duì)煙嘧磺隆具有降解作用，而P1 和P5 收集到的蛋白質(zhì)則無明顯水解作用。因此，選擇P2、P3 和P4 分離組分繼續(xù)進(jìn)行分離純化。

圖3 DEAE-FF 胞外酶分離色譜圖Fig.3 DEAE-FF extracellular enzyme separation chromatogram

圖4 DEAE-FF 分離組分活性驗(yàn)證Fig.4 Activity verification of separated components

2.3.2 Native-PAGE 分離 根據(jù)2.3.1 所得結(jié)果，采用Native-PAGE 對(duì)P2、P3 和P4 繼續(xù)進(jìn)行分離純化。由圖5 可知，P2 混合樣品中共分離得到2 個(gè)蛋白組分，分別命名為P2-1 和P2-2；P3 混合樣品中共分離得到4 個(gè)蛋白組分，分別命名為P3-1、P3-2、P3-3 和P3-4；P4 混合樣品中共分離得到4 個(gè)蛋白組分，分別命名為P4-1、P4-2、P4-3 和P4-4。

圖5 Native-PAGE 法分離蛋白Fig.5 Protein isolation by Native PAGE

2.3.3 分離組分的活性檢測(cè) 首先采用水解圈法對(duì)分離得到的10 個(gè)蛋白組分進(jìn)行定性活性驗(yàn)證。由圖6 可知，所得10 個(gè)分離組分在相同點(diǎn)樣量的情況下均對(duì)煙嘧磺隆具有降解作用。

圖6 水解圈法定性檢測(cè)分離組分活性Fig.6 Activity detection of isolated components by hydrolysis circle method

結(jié)合水解圈法活性檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步利用酶液反應(yīng)體系法對(duì)分離組分進(jìn)行定量活性檢測(cè)。由圖7 可知，P3-4、P4-2 和P4-4 3 種酶對(duì)煙嘧磺隆的降解活性最高，分別為0.041 8、0.036 8 和0.038 2 μmoL/（min·mg）。因此，選擇這3 個(gè)降解酶進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

圖7 酶液反應(yīng)體系法檢測(cè)各分離組分活性Fig.7 Activity detection of isolated components by enzyme reaction system

2.4 降解酶質(zhì)譜鑒定

P3-4、P4-2 和P4-4 經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，將所得氨基酸序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)。通過BLAST 在線序列比對(duì)得知，這3 種降解酶分別為糖磷酸異構(gòu)酶（P3-4）、亮氨酸氨基肽酶（P4-2）和精氨酸酶（P4-4）。

3 結(jié)論與討論

本研究以貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）CF57作為研究對(duì)象，經(jīng)降解酶定域試驗(yàn)明確菌株CF57對(duì)煙嘧磺隆其降解作用的主要部位為胞外，屬于胞外酶。該項(xiàng)結(jié)果與趙衛(wèi)松［23］、康占海［14］等所得的菌株ZWS11 和YB1 對(duì)煙嘧磺隆具有降解作用的酶主要為胞外酶的結(jié)論相一致。在胞外酶粗分離過程中，采用了丙酮沉淀法。已有研究表明，相比較于硫酸銨沉淀法，采用丙酮沉淀法提取得到的胞外酶不僅蛋白濃度高，而且對(duì)煙嘧磺隆的降解活性也相對(duì)較高［23］。通過進(jìn)一步對(duì)丙酮沉淀法進(jìn)行優(yōu)化，得到發(fā)酵液與丙酮最適體積比為1∶2。

在此基礎(chǔ)上，利用DEAE-FF 陰離子交換層析和PAGE 法進(jìn)一步對(duì)胞外酶進(jìn)行分離純化，共得到10種蛋白質(zhì)組分。經(jīng)活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所得10 種蛋白質(zhì)組分均對(duì)煙嘧磺隆具有降解活性。選擇其中活性較高的3 種降解酶進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，得到這3 種降解酶分別為糖磷酸異構(gòu)酶、亮氨酸氨基肽酶和精氨酸酶。該研究是這3 種酶在除草劑修復(fù)方面的首次報(bào)道，不僅豐富了煙嘧磺隆降解酶資源，而且證明了這3種酶均具有催化混亂性［24］。

由于自然菌株存在產(chǎn)酶量少、不穩(wěn)定、不易存儲(chǔ)等缺陷［25］，因此在后續(xù)工作中，將進(jìn)一步借助基因工程及酶工程實(shí)現(xiàn)酶的異源表達(dá)，提高酶的表達(dá)量并拓寬其作用底物。酶的分離純化是后續(xù)深入研究酶的各種性質(zhì)的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步深入探究酶結(jié)構(gòu)與功能、降解機(jī)理及活性優(yōu)化等奠定了理論基礎(chǔ)。