薄曉瑋 楊志萍 綦國(guó)紅

摘要：對(duì)烏梅總有機(jī)酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化并研究其對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜產(chǎn)生的抑制作用。通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)烏梅總有機(jī)酸提取條件進(jìn)行了優(yōu)化及驗(yàn)證，采用結(jié)晶紫染色法對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，烏梅總有機(jī)酸最佳提取條件為乙醇70%（體積分?jǐn)?shù)）、料液比3∶40（g∶mL）、超聲提取時(shí)間1.5 h及超聲提取溫度50 ℃。在該條件下，烏梅總有機(jī)酸提取率為24.50%。提取物濃度為0.5MIC、MIC和2MIC時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制率分別為13.06%、48.24%和74.01%。因此，該提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有抑制作用。

關(guān)鍵詞：烏梅;總有機(jī)酸;方法優(yōu)化;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）;生物膜

Abstract： The extraction conditions of total organic acid from Prunus mume was optimized and its inhibition on biofilm formation by Staphylococcus aureus was studied. The single factor and orthogonal test were used to optimize and verify the total organic acid extraction scheme of Prunus mume. The amount of biofilm formation by Staphylococcus aureus was determined by crystal violet staining. The results showed that the optimum extraction conditions of total organic acids were ethanol 70% （volume fraction）， solid-liquid ratio of 3 g / 40 mL， ultrasonic extraction time of 1.5 h and ultrasonic extraction temperature of 50 ℃. The extraction rate of total organic acid was 24.50% from Prunus mume under these conditions. The inhibitory rates on biofilm formation by Staphylococcus aureus was 13.06%，48.24% and 74.01% respectively at the extract concentration of 0.5MIC， MIC and 2MIC. Therefore， the extract could inhibit the formation of Staphylococcus aureus biofilm.

Key words： Prunus mume; total organic acid; method optimization; Staphylococcus aureus; biofilm

烏梅又稱酸梅、干枝梅，由薔薇科喬木植物梅（Prunus mume）的近成熟果加工處理所得?！侗静菥V目》及《本經(jīng)》均有記載，烏梅的多數(shù)部分均可入藥，主要可治療呼吸系統(tǒng)疾病及胃腸道不適等。烏梅的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類及揮發(fā)油等[1]，豐富的化學(xué)組成賦予了烏梅多種功能。目前烏梅有機(jī)酸提取工藝以熱水浸提居多，提取時(shí)間長(zhǎng)，提取率較低。超聲波在提取中的應(yīng)用可以提高提取率，大大縮短提取時(shí)間。

細(xì)菌生物膜（Bacterial biofilm，BF）是細(xì)菌為自我防護(hù)而形成的膜狀結(jié)構(gòu)，最大特點(diǎn)是粘附性強(qiáng)，難以清除，從而導(dǎo)致持續(xù)性污染，成為食品安全的一大隱患[2]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是造成人類食物中毒的常見(jiàn)致病菌，也可以引起人類和動(dòng)物的化膿性感染，并具有很強(qiáng)的生物膜形成能力[3]。金黃色葡萄球菌作為第二大食源性疾病發(fā)病原因，對(duì)該菌有效控制具有非常重要的意義。本研究對(duì)烏梅總有機(jī)酸提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究了該提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性和生物膜的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料和試劑

金黃色葡萄球菌保存于中國(guó)藥科大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室。

烏梅購(gòu)于南京同和堂大藥房，60 ℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

胰蛋白胨（生物試劑），購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;結(jié)晶紫草酸銨染色液，永安化學(xué)實(shí)驗(yàn)室出品;YEAST EXTRACT，購(gòu)自O(shè)xoid Ltd（UK）;酚酞，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

HZQ-F160全溫震蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;ELxTM800多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰儀器有限公司;SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烏梅總有機(jī)酸提取工藝流程 將一定質(zhì)量的烏梅粉與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液置于50 mL錐形瓶中超聲，冷卻后離心（4 000 r/min、10 min），取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液，定容后即為待測(cè)液[4，5]。

1.3.2 烏梅總有機(jī)酸提取率的測(cè)定 按文獻(xiàn)[6]方法測(cè)定提取物中的有機(jī)酸，烏梅中的總有機(jī)酸含量以枸櫞酸（Mr=192）計(jì)。按下式計(jì)算烏梅總有機(jī)酸提取率。

[總有機(jī)酸提取率=cVNaOH×Mrm×3×1? 000×50×100%]? ? （1）

式（1）中，c為NaOH滴定液濃度，VNaOH為待滴定液消耗NaOH滴定液的體積，m為烏梅粉質(zhì)量，3為枸櫞酸與NaOH反應(yīng)系數(shù)，50為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 烏梅總有機(jī)酸提取單因素試驗(yàn)

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，料液比為3∶40（g∶mL，下同），在45 ℃下水浴超聲2 h，測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、65%、70%、75%、80%時(shí)烏梅總有機(jī)酸的提取率[4]。

2）料液比對(duì)提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，在45 ℃下水浴超聲2 h，測(cè)定料液比分別為3∶30、3∶35、3∶40、3∶45、3∶50（g∶mL）時(shí)烏梅總有機(jī)酸的提取率[4，7]。

3）超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，恒定乙醇體積分?jǐn)?shù)以及料液比，在45 ℃下水浴超聲，測(cè)定超聲時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí)烏梅總有機(jī)酸的提取率[4]。

4）超聲溫度對(duì)提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，恒定乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時(shí)間，測(cè)定超聲溫度分別為35、40、45、50、55 ℃時(shí)烏梅總有機(jī)酸的提取率[4]。

1.3.4 烏梅總有機(jī)酸提取正交試驗(yàn) 在4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，從每個(gè)單因素的5個(gè)水平中選取3個(gè)較好水平進(jìn)行試驗(yàn)。以有機(jī)酸提取率為提取效果的衡量標(biāo)準(zhǔn)，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)，按照L9（34）標(biāo)準(zhǔn)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化烏梅中有機(jī)酸的最佳提取條件[8，9]。

1.3.5 烏梅總有機(jī)酸提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行提取并計(jì)算有機(jī)酸得率[8]。

1.3.6 烏梅提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用 依據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的提取工藝進(jìn)行提取，得100 mg/mL（以烏梅粉計(jì)）提取物，-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1）最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定。LB培養(yǎng)基滅菌后接種，加入提取液，使其終質(zhì)量濃度分別為1.50、2.00、2.50 mg/mL，37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，觀察金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況。無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度組所對(duì)應(yīng)的濃度即為MIC[3]。

2）對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響。LB培養(yǎng)基滅菌后接種，并加入提取物，使其終濃度為0.5MIC、MIC、2MIC，并設(shè)置空白對(duì)照組。37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h時(shí)測(cè)定其A600 nm的值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.7 對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用 培養(yǎng)基滅菌后加入5 mm×5 mm無(wú)菌輸液管片，并加入提取物，使其濃度為0.5MIC、MIC、2MIC，并設(shè)置空白對(duì)照組，待冷卻后接種菌懸液。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取出輸液管片，無(wú)菌水沖洗，45 ℃干燥30 min，0.2%結(jié)晶紫染色3 min，無(wú)菌水沖洗其表面殘余的結(jié)晶紫，45 ℃干燥30 min，放入96孔板，加入200 μL無(wú)水乙醇洗脫5 min，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定洗脫液的吸光度值。按下式計(jì)算抑制率[2]。

[抑制率=A0-A1A0×100%]? （2）式（2）中，A0為空白組吸光度值，A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏梅總有機(jī)酸提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 由圖1可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～65%時(shí)，烏梅總有機(jī)酸提取率呈上升趨勢(shì)，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)提取率達(dá)到最高;但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于65%時(shí)，烏梅總有機(jī)酸的提取率呈下降趨勢(shì)。一方面可能與有機(jī)溶劑所具有的氫鍵的斷裂有關(guān)，有機(jī)酸在植物體內(nèi)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的連接方式常以氫鍵為主，因此復(fù)合體系有利于有機(jī)酸的提取;另一方面可能是乙醇分子與水分子之間作用力不同而造成提取出的主要有機(jī)酸不同，因而引起提取率下降。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液作為提取溶劑。

2.1.2 料液比的確定 由圖2可知，在料液比為? ? ?3∶30～3∶35時(shí)，烏梅總有機(jī)酸提取率呈上升趨勢(shì)。但在料液比3∶35～3∶45波動(dòng)較小，當(dāng)料液比大于? ? 3∶45時(shí)，提取率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)提取溶劑過(guò)少時(shí)，固液兩相濃度梯度小，使固相中的有機(jī)酸物質(zhì)不能完全溶出;而溶劑過(guò)多則有可能影響到超聲波粉碎的效率，從而影響提取率。此外，料液比增大也會(huì)使旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的時(shí)間延長(zhǎng)。因此，選擇料液比為3∶40。

2.1.3 超聲提取時(shí)間的確定 由圖3可知，在超聲提取時(shí)間為1.0～1.5 h時(shí)，烏梅總有機(jī)酸提取率呈上升趨勢(shì)，并在1.5 h處達(dá)到最大;在1.5～3.0 h時(shí)先下降而后趨于穩(wěn)定。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，烏梅總有機(jī)酸的提取率應(yīng)持續(xù)上升，但是在提取過(guò)程中可能會(huì)有空氣進(jìn)入提取液，進(jìn)入的O2可能與有機(jī)酸發(fā)生一系列氧化、聚合等反應(yīng)，導(dǎo)致烏梅總有機(jī)酸提取率下降。在實(shí)際生產(chǎn)中，提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。因此，選擇最佳超聲提取時(shí)間為1.5 h。

2.1.4 超聲提取溫度的確定 由圖4可知，在超聲提取溫度為35～45 ℃時(shí)，烏梅總有機(jī)酸提取率呈上升趨勢(shì)，并在45 ℃處達(dá)到最大值;溫度大于45 ℃時(shí)呈下降趨勢(shì)。隨著水浴溫度的上升，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，在溫度較低范圍內(nèi)升溫時(shí)，烏梅總有機(jī)酸提取率隨溫度升高而升高;但可能烏梅中的某些有機(jī)酸熱穩(wěn)定性較差，當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃時(shí)，受熱分解，導(dǎo)致烏梅總有機(jī)酸提取率下降。因此，選擇最佳超聲提取溫度為45 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總有機(jī)酸提取率為主要考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲提取時(shí)間（C）和超聲提取溫度（D）對(duì)烏梅總有機(jī)酸提取率的影響。

根據(jù)4個(gè)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了表1所示的正交試驗(yàn)因素與水平，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2中R（極差）分析可知，本試驗(yàn)所考察的影響烏梅總有機(jī)酸提取率的4個(gè)因素中，料液比（B）和超聲提取時(shí)間（C）2個(gè)因素的影響較為顯著，4個(gè)影響因素按照顯著性從高到低依次排列為超聲提取時(shí)間（C）>料液比（B）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>超聲提取溫度（D）。

根據(jù)正交試驗(yàn)可知，烏梅中總有機(jī)酸提取的最佳條件為A3B2C2D3，即提取劑為70%乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）、料液比為3∶40、超聲提取時(shí)間為1.5 h、超聲提取溫度為50 ℃。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照正交試驗(yàn)所確定的最佳提取工藝參數(shù)，使用提取劑為70%乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)），料液比為3∶40（g∶mL），超聲提取時(shí)間為1.5 h，超聲提取溫度為50 ℃，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，烏梅總有機(jī)酸提取率分別為24.43%、24.53%和24.53%，平均為24.50%，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果為0.24%，表明利用正交試驗(yàn)對(duì)烏梅總有機(jī)酸的醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化是有效的。

2.4 對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）

由表3可知，烏梅醇提取物MIC值為2.50 mg/mL。

2.5 對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，0.5 MIC（1.25 mg/mL）組在0～2 h生長(zhǎng)速度趨近于空白組，但在2～12 h的生長(zhǎng)速率與空白組有較為明顯的差異，但其吸光度值在12 h時(shí)與空白組幾乎無(wú)差別，并在24 h之后與空白組一樣進(jìn)入衰退期。MIC（2.50 mg/mL）組在12 h之前均處于緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)，在12 h左右進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，并在24 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。0.5 MIC組與MIC組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌物質(zhì)被消耗，菌數(shù)趨同。由此上述2個(gè)濃度組的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用表現(xiàn)在生長(zhǎng)初期和進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間被推遲及菌數(shù)所能達(dá)到的最大值降低，其抑菌作用在不同階段呈現(xiàn)出不同的特性。2MIC組在0～48 h內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)基本處于停滯狀態(tài)。

2.6 對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

由圖6可知，烏梅醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有較為強(qiáng)烈的抑制作用，且其抑制程度隨提取物濃度的增大而加強(qiáng)，提取物濃度為0.5MIC、MIC和2MIC時(shí)，金黃色葡萄球菌生物膜的抑制率分別為13.06%、48.24%和74.01%。

3 小結(jié)

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)超聲法醇提烏梅總有機(jī)酸的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得最佳提取條件為提取劑70%乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）、料液比? ?3∶40（g∶mL）、超聲提取時(shí)間1.5 h、超聲溫度50 ℃。對(duì)該優(yōu)化工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，烏梅總有機(jī)酸提取率達(dá)24.50%，提取率較高，且提取時(shí)間短。抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏梅提取液對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為2.50 mg/mL。提取物濃度在0.5MIC、MIC和2MIC時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制率分別為13.06%、48.24%和74.01%，生物膜抑制率隨著提取物濃度的升高而增大。因此該提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有明顯的抑制作用。

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